Mikrobiota ja siihen liittyvät aineenvaihduntat kaikkiruokaisissa, kasvis- tai vegaaniruokavalioissa (MRMOVVD)

Tämän projektin yleisenä tavoitteena on löytää suhde ruokavalion ja syljen ja ulosteen mikrobiotan välillä korkean suorituskyvyn ja integroitujen meta-omiikka (genominen, transkriptominen, proteominen ja metabolominen) analyysien avulla. Tässä yhteydessä keskustellaan edelleen useista kysymyksistä. Mikä on esimerkiksi mikrobien päivittäinen saanti ja niiden rooli suoliston mikrobiotan tasapainossa? Miten pääruokavaliot (kaikkisyöjä, kasvissyöjä ja vegaani) vaikuttavat suoliston mikrobiotaan? Mitkä ovat suoliston tasolla vallitsevat mikrobiryhmät ruokavalion tyypistä riippuen? Mikä on kunkin mikrobiryhmän oletettu panos isännän terveyden ylläpitämiseen? Elintarvikkeissa olevien tärkeimpien mikrobiryhmien määrällinen ja laadullinen määritys ruokailutottumuksista riippuen vastaa aikaisempaan kysymykseen ja sopii yhteen tämän projektin tavoitteen kanssa. Etenkin ulosteen mikrobiotan monimuotoisuuden (genomiikka), toiminnallisen aktiivisuuden (transkriptomiikka ja proteomiikka) ja metaboliittien (metabolomiikka) arvio osuu yhteen tämän projektin kokonaisvaltaisen lähestymistavan kanssa ja vastaa useisiin aikaisempiin kysymyksiin. Ottaen huomioon läheinen korrelaatio erilaisten mikrobipopulaatioiden tasapainon ja aineenvaihduntasairauksien alkamisen välillä ihmiskehon eri osissa, tämä projekti tarjoaa uutta tietoa, joka voi tuoda esiin mahdollisia yhteyksiä ruokavalion ja aineenvaihduntahäiriöiden välillä. Ruokavaliota on pidettävä sopivimpana ja edullisimpana välineenä vakaan ja suotuisan suun ja suoliston mikrobiston määrittämiseksi, joka ehkäisee sairauksia ja takaa ihmisen pitkäikäisyyden. Nämä hankkeen yleiset tavoitteet on saavutettava seuraavien erityistavoitteiden perusteella: i) ruokavaliotyypille ominaisten biologisten, molekyylien ja metabolisten merkkiaineiden tunnistaminen; (ii) arvio eroista syljen ja ulosteiden mikrobiotassa ja aineenvaihdunnassa sekä yksilöiden kesken että eri ruokavaliotyyppien välillä; iii) ruokavaliotyyppiin liittyvien mikrobien saannin laadullisten ja määrällisten erojen arvio; ja iv) ruokavalion tyyppiin liittyvien ulostenäytteiden toiminnallisten piirteiden tunnistaminen, joita voidaan pitää taudille alttiuden indikaattoreina.

Tämän hankkeen yleistavoitteen saavuttamiseksi ehdotukseen osallistuu kymmenen tutkimusyksikköä (RU1-10) 16 kansallisen ja erityisesti ulkomaisen laitoksen kumppanuuden kanssa, jotka kattavat 12 eri maata. Kunkin rautatieyrityksen johtajat on raportoitu alla:

• RU1. Marco Gobbetti on ehdotuksen päätutkija ja RU1:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 188 julkaisua, joihin viitattiin 4 075 kertaa, ja viittausten keskiarvo julkaisua kohti on 21,68 ja h-indeksi 39. Hänet on äskettäin listattu VIA Academyn Italian huippututkijoihin (vuosittainen arviointi tutkijoille, joiden h-indeksi on yli 30). RU1 on kerännyt hyvää kokemusta keliaakikoiden suoliston mikrobiotan tutkimuksesta sekä maitohappobakteerien ja elintarvikkeiden proteomiikasta. RU1 toimii hankkeen koordinaattorina. Tässä hankkeessa RU1 osallistuu: vapaaehtoisten rekrytointiin; päiväkirjojen hallinto; biologisten näytteiden käsittely ja valmistelu; päämikrobiryhmien määrittäminen ulostenäytteistä viljelmästä riippuvilla menetelmillä; valikoitujen ulostenäytteiden metaproteomiikka karakterisointi yksilöiltä, ​​joilla on erilaiset ruokailutottumukset; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa RU1 tekee yhteistyötä Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìonin kanssa, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Espanja, funktionaalisten toimintojen ja/tai aineenvaihduntareittien määrittämiseksi tunnistetuille proteiineille sekä ministeriön kanssa. Microbiology of the University College Cork, Irlanti, bioinformaattista lähestymistapaa proteomitutkimuksiin.
• RU2. Gianluigi Cardinali on RU2:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 38 julkaisua, joiden h-indeksi on 11. RU2 on toiminut noin kahdenkymmenen vuoden ajan biodiversiteetin ja hiivojen taksonomian alalla, joita analysoidaan mikrobiologisilla ja molekyylitekniikoilla. Tässä hankkeessa RU2 osallistuu: elintarvikemikobiotan monimuotoisuuden karakterisointiin PCR-DGGE-lähestymistavan avulla; ulostenäytteiden mikrobiotan karakterisointi PCR-DGGE-lähestymistavan avulla; ja johtajana kaikkien rautatieyritysten tulosten tilastollisen käsittelyn hallinnassa yhteisen tietokannan tarjoamiseksi. RU2 tekee yhteistyötä Centraalbureau voor Schimmelculturesin (CBS) kanssa, Utrecht, Alankomaat, tietojen bioinformaattista käsittelyä varten.
• RU3. Danilo Ercolini on RU3:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 58 julkaisua, joiden kokonaismäärä on 1 354 ja h-indeksi 21. RU3 on ollut mukana jo vuosia monimutkaisten ekosysteemien, pääasiassa ruokaekosysteemien, mikrobiekologian tutkimuksissa. Ruokamikrobistoa on aina tutkittu edistyneillä molekyylimenetelmillä ja viljelmästä riippumattomilla menetelmillä, jotka eivät vaadi mikro-organismien viljelyä synteettisellä alustalla. Tässä projektissa RU3 osallistuu: sylkinäytteiden mikrobiotan monimuotoisuuden karakterisointiin; valittujen ruokanäytteiden syväsekvensointi; valittujen uloste- ja sylkinäytteiden syväsekvensointi; valikoitujen ulostenäytteiden metagenomiikka karakterisointi yksilöiltä, ​​joilla on erilaiset ruokailutottumukset; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä projektissa RU3 tekee yhteistyötä Earth Microbiome Projectin (EMP, www.earthmicrobiome.org) kanssa. jota ajetaan Argonnen kansallisessa laboratoriossa, Lemontissa, Yhdysvalloissa, luomaan tietojoukkoja, jotka kuvaavat mikro-organismeja laajasta valikoimasta ekosysteemejä.
• RU4. Erasmo Neviani on RU4:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 111 julkaisua, joiden kokonaismäärä on 1 508 ja h-indeksi 22. RU4 on kerännyt hyvää kokemusta elintarvikemikrobiekologiasta mikrobipopulaatioiden, dynamiikan ja solujen fysiologisen tilan kokonaisvaltaiseen ja integroituun arviointiin elintarviketuotannon eri vaiheissa. Tässä hankkeessa RU4 osallistuu: päiväkirjojen laatimiseen; vapaaehtoisten rekrytointi; päiväkirjojen hallinto; biologisten näytteiden käsittely ja valmistelu; päämikrobiryhmien määrittäminen ulostenäytteistä viljelystä riippuvaisilla menetelmillä; päiväkirjojen tulosten käsittely; tärkeimpien mikrobiryhmien määrittäminen elintarvikkeista viljelystä riippumattomilla menetelmillä; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa RU4 tekee yhteistyötä Ateenan maatalousyliopiston elintarviketieteen ja teknologian osaston kanssa elintarvikkeiden ja erityisesti maitotuotteiden mikrobien määrittämiseksi Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dein epidemiologiayksikön kanssa. Tumori Milanosta, Italiasta, avustamisesta ruokailutottumusten kirjaamisessa ja Rooman kansallisen elintarvike- ja ravitsemustutkimuksen instituutin kanssa rajoittaviin ruokavalioihin liittyvien oletettujen puutteiden seurannasta.
• RU5. Aldo Corsetti on RU5:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 81 julkaisua, joiden kokonaismäärä on 2 084 ja h-indeksi 28. RU5 on kerännyt hyvää kokemusta elintarvikkeiden ja juomien mikrobiekologiasta sekä kantojen karakterisoinnista bioteknologisista ja toiminnallisista näkökohdista, jotta voidaan valita aloitusviljelmiä erilaisiin käyttötarkoituksiin. Tässä hankkeessa RU5 osallistuu: tärkeimpien mikrobiryhmien määrittämiseen elintarvikkeista viljelyriippuvaisilla menetelmillä; elintarvikkeista eristettyjen mikrobien tunnistaminen ja tyypitys; ulostenäytteiden genotoksisuuden karakterisointi; elintarvikkeista peräisin olevien mikrobiisolaattien antigenotoksigeenisen aktiivisuuden karakterisointi; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä projektissa RU5 tekee yhteistyötä Kanadan Albertan yliopiston maatalous-, elintarvike- ja ravitsemustieteen laitoksen kanssa elintarvikkeista eristettyjen mikro-organismien molekyylityypittämiseksi monilokustyyppisellä sekvensoinnilla.
• RU6. Patrizia Brigidi on RU6:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 102 julkaisua, joihin on viitattu 3 158 kertaa, ja viittausten keskiarvo julkaisua kohti on 32,41 ja h-indeksi 26. RU6:lla on vakiintunut ja laaja osaaminen monimutkaisista ekosysteemeistä peräisin olevien bakteerien tunnistamisessa ja molekyylimäärittelyssä (ulosteet ja suoliston biopsiat) sekä bakteerien terveyshyödyistä vastaavien molekyylimekanismien alalla. Tässä hankkeessa RU6 osallistuu: vapaaehtoisten rekrytointiin; päiväkirjojen hallinto; biologisten näytteiden käsittely ja valmistelu; päämikrobiryhmien määrittäminen ulostenäytteistä viljelystä riippuvaisilla menetelmillä; valikoitujen ulostenäytteiden metatranskriptomiikan karakterisointi yksilöiltä, ​​joilla on erilaiset ruokailutottumukset; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa RU6 tekee yhteistyötä Readingin yliopiston Food Microbial Science Unit -yksikön kanssa metatranskriptoimisalustan kehittämisessä ja saatujen sekvenssien bioinformaattisessa analyysissa niiden liittämistä varten KEGG- ja COG-klusteriin.
• RU7. Francesca Clementi on RU7:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 59 julkaisua, joihin on viitattu 504 kertaa, ja viittausten keskiarvo julkaisua kohti on 11,25 ja h-indeksi 15. RU7:llä on luotettavaa asiantuntemusta elintarvikkeissa leviävien mikro-organismien, erityisesti maitohappobakteerien, roolista, seurannasta ja torjunnasta. Tässä projektissa RU7 osallistuu: elintarvikemikrobiston monimuotoisuuden karakterisointiin PCR-DGGE:llä; antibioottiresistenssin määrittäminen uloste- ja sylkinäytteistä; antibiooteille vastustuskykyisten maitohappobakteerien eristäminen ja tunnistaminen uloste- ja sylkinäytteistä; mikrobien antibioottiresistenssiin osallistuvien geenien karakterisointi; antibioottiresistenssin siirtämisen mekanismeista bakteerien välillä tutkiminen; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa RU7 tekee yhteistyötä kreikkalaisen Traakian Democritus-yliopiston ja Skotlannin Aberdeenin yliopiston Rowettin ravitsemus- ja terveysinstituutin kanssa siirrettävien antibioottiresistenssigeenien tutkimiseksi elintarvikkeissa ja eristettyjen maitohappobakteerien kanssa. sylki- ja ulostenäytteistä.
• RU8. Luca Simone Cocolin on RU8:n johtaja. Scopusin mukaan hän on kirjoittanut 131 julkaisua, joihin viitattiin 2 036 kertaa, jolloin h-indeksi on 25. RU 8:lla on laaja kokemus viljelystä riippumattomien menetelmien soveltamisesta fermentoitujen elintarvikkeiden mikrobien monimuotoisuuden ja elinvoimaisuuden tutkimukseen. Sillä on myös tietoa kvantitatiivisesta PCR:stä (qPCR) monimutkaisista ekosysteemeistä peräisin olevien tiettyjen mikro-organismien kvantifiointiin. Tässä hankkeessa RU8 osallistuu: vapaaehtoisten rekrytointiin; päiväkirjojen hallinto; biologisten näytteiden käsittely ja valmistelu; päämikrobiryhmien määrittäminen ulostenäytteistä viljelystä riippuvaisilla menetelmillä; ulosteen mikrobiotan profilointi DGGE-lähestymistapoilla, joita sovelletaan sekä DNA- että RNA-tasolla; valikoitujen ulostenäytteiden metagenominen karakterisointi yksilöiltä, ​​joilla on erilaiset ruokailutottumukset; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä projektissa RU8 tekee yhteistyötä Mariborin yliopiston (UM), Slovenia, ja Democritus University of Thrace (DUT), Alexandroupolis, Kreikka, kanssa asioissa, jotka käsittelevät patogeenien ja isäntäsolujen vuorovaikutusta ja mahdollisia muutoksia eri ruokavalioryhmien ruokavaliota, joka voi parhaiten hyödyntää tiettyjen tiettyihin elintarvikkeisiin liittyvien mikrobiryhmien tunnettua hyödyllistä roolia.
• RU9. Mauro Rossi on RU9:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 41 julkaisua, joiden kokonaismäärä on 1087 ja h-indeksi 19. RU9:llä on pitkä kokemus (>25 vuotta) ja vahva yhteistyö ohutsuolen biokemian ja immunologian alalla. Tässä hankkeessa RU9 osallistuu: laktobasillien ja bifidobakteerien eristämiseen ulostenäytteistä; uloste-isolaattien in vitro -immuunivasteen karakterisointi käyttäen Caco-2-solua; uloste-isolaattien in vitro -immuunivasteen karakterisointi käyttämällä dendriittisoluja; sytokiinierityksen mittaus Caco-2- ja dendriittisoluissa; ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa RU9 tekee yhteistyötä Ecofisiología Microbiana y Nutriciònin, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentosin (CSIC), Valencia, Espanja (liite mallissa B) kanssa selvittääkseen, voisivatko ulosteen mikrobiotan erityispiirteet vaikuttaa taudin alkamiseen. suoliston immuunijärjestelmän toimintahäiriöt.
• RU10. Lucia Vannini on RU10:n johtaja. Kuten ISI Web of Science raportoi, hän on kirjoittanut 27 julkaisua, joissa on yhteensä 322 viittausta ja h-indeksi 9. RU10 on kerännyt hyvää kokemusta sekä elintarvikemikrobiologian alueelta että instrumentaalisten tekniikoiden ja erityisesti ydinmagneettisen resonanssin käytöstä biologisten näytteiden metabolomianalyysissä. Tässä projektissa RU10 osallistuu: valittujen elintarvikkeiden metabolomien karakterisointiin; sylkinäytteiden metabolomin karakterisointi; uloste- ja virtsanäytteiden metabolomien karakterisointi ja tulosten tilastollinen käsittely. Tässä hankkeessa R10 tekee yhteistyötä Ruotsin elintarvike- ja biotekniikan instituutin (Ruotsi) ja Kemiallisen teknologian instituutin (Institute of Chemical Technology, Department of Research and Development, Praha, Tšekin tasavalta) kanssa eräiden valittujen elintarvikkeiden metabolomista karakterisointia koskevissa asioissa. biologisia näytteitä. Käytetty peräkkäinen lähestymistapa tekee jokaisesta tutkimustoiminnasta ja jokaisesta rautatieyrityksestä välttämättömän hankkeen päätavoitteiden saavuttamisen.

Tämä tutkimus koostuu eri toiminnoista (AI-VI), jotka kuvataan alla:

• TOIMINTA I. Henkilöiden rekrytointi, päiväkirjojen hallinta, biologisten näytteiden käsittely, valmistelu ja varastointi sekä ulostenäytteiden mikrobiologiset analyysit.
• AI.1. Henkilöiden rekrytointi ja päiväkirjojen ylläpito (RU1, 4, 6, 8) Rekrytoidaan noin 50 kaikkiruokaista, kasvissyöjä- ja vegaanivapaaehtoista, yhteensä 150 koehenkilöä. Kasvissyöjiä ja vegaaneja rekrytoidaan yhteistyössä Italian Scientific Societyn kanssa. kasvisruokavaliosta. Kaikkiruokaisia ​​henkilöitä rekrytoidaan yliopistoissa julkaistujen ilmoitusten kautta. Rekrytoidaan noin 50 tervettä vapaaehtoista, mukaan lukien suunnilleen yhtä suuri määrä kaikkiruokaisia, kasvissyöjiä ja vegaaneja (ikä 18-59 vuotta, mies/nainen suhde n. 1:1). Rekrytoituja vapaaehtoisia pyydetään allekirjoittamaan konsensusasiakirja, jossa kirjataan heidän ruokailutottumukset. Päiväkirjat laaditaan yksityiskohtaisten tietojen saamiseksi elintarvikkeiden ominaisuuksista, mikä mahdollistaa markkinoilla olevien tuotteiden helpon tunnistamisen ja arvioiden nautitun mikrobimäärän. Yliopistojen eettiselle toimikunnalle tiedotetaan ennen hankkeen alkamista.
• AI.2. Biologisten näytteiden käsittely, valmistelu ja varastointi (RU1, 4, 6, 8). Jokainen henkilö toimittaa näytteitä sylkestä, ulosteesta ja virtsasta viikoittain kolmen viikon ajan. Kolminkertaiset näytteet yhdistetään ennen analyyseja yksilöiden välisen vaihtelun rajoittamiseksi. Käsittely suoritetaan eri tavalla riippuen biologisten näytteiden tyypistä (sylki, uloste, virtsa) ja myöhemmistä analyyseistä (esim. DNA, RNA, proteomi). Samanaikaisesti henkilöiden rekrytoinnin ja biologisten näytteiden keräämisen kanssa useimmat rautatieyritykset osallistuvat tekniikoiden/menetelmien laatimiseen.
• AI.3. Ulostenäytteiden mikrobiologiset analyysit (RU1, 4, 6, 8). Ensimmäistä kertaa elinkelpoiset laskennat suoritetaan maljaamalla tuoretta ulostemateriaalia erilaisille selektiivisille viljelyalustoille yleisimmät ulosteen mikrobiryhmät luettelemiseksi.
• AI.4. Tekniikoiden/menetelmien määrittäminen (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Samanaikaisesti henkilöiden rekrytoinnin ja biologisten näytteiden keräämisen kanssa useimmat rautatieyritykset osallistuvat tekniikoiden/menetelmien laatimiseen. Luodakseen riippumattoman ja kilpailukykyisen alustan meta-omiikka-analyyseille RU3 ostaa laitteet suuren suorituskyvyn sekvensointiin, mikä on tämän hankkeen tärkein taloudellinen investointi.
• TOIMINTA II. Ruoan mikrobiota ja metabolomi. Ruokavaliopäiväkirjoista saatujen tietojen perusteella kolmen ruokavalion edustavimmat ruoat jaetaan kolmeen luokkaan: (i) alhainen (TBC, 10^3 pmy/g); (ii) välituote (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); ja (iii) korkea (TBC ³ 10^6 cfu/g) mikrobikuormitus. Ryhmän (i) elintarvikkeissa mikrobimäärä arvioidaan kirjallisuustietojen perusteella. Ryhmien (ii) ja (iii) elintarvikkeille mikrobimäärä määritetään kirjallisuustietojen perusteella, kun on kyse hyvin tunnetuista tuotteista, joiden markkinaero on vähäinen (esim. Parmigiano Reggiano -juusto), kun taas asianmukaiset analyysit tehdään tuotteet, joilla on suuri markkinavaihtelu (esim. Mozzarella-juusto). Jälkimmäisessä tapauksessa analyysit koskevat suurta määrää markkinoilla olevia tuotteita. Elintarvikkeiden mikrobien monimuotoisuutta tutkitaan perusteellisemmin ensin PCR-DGGE:llä (polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel -elektroforeesi) ja tarvittaessa syväsekvensoinnilla tiettyjen elintarvikkeiden monimutkaisuustason ja nykyisen tiedon perusteella.
• AII.1 Mikro-organismien kvantitatiivinen määritys elintarvikkeista (RU 4, 5; 7). Elintarvikkeiden analyysit jaetaan RU4:n ja 5:n kesken, ja molemmat RU analysoi jotkin näytteet tulosten vastavuoroiseksi validoimiseksi. Myöhemmin RU4 karakterisoi valitut elintarvikkeet LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) -analyysillä, ja tuloksia verrataan RU7:n PCR-DGGE:tä käyttämällä saamiin tuloksiin. RU5 tunnistaa suuren kokoelman isolaatteja elintarvikkeista tavoitteenaan löytää mahdolliset yhteydet ulostevesien vähentyneeseen antigenotoksiseen aktiivisuuteen ja tiettyjen mikro-organismien esiintymiseen nautituissa elintarvikkeissa.
• AII.2 Mikrobien monimuotoisuus elintarvikkeissa (RU 2, 3). Ensinnäkin tässä toiminnassa tarkastellaan huonosti luonnehdittuja ruokia, joita kasvissyöjät ja vegaanit syövät päiväkirjojen perusteella. Sekä mikrobi- että mikroeliöstöä tutkitaan. Hiivojen ja rihmasienten PCR-DGGE-analyysit perustuvat rRNA:n LSU- tai 26S-alayksikköä koodaavien D1/D2-domeenin osien ja ITS-alueiden (Internal transcribed spacer) monistamiseen. 16S-rRNA-geenin V3-alue kohdistetaan bakteerien havaitsemiseen. DGGE-analyysin jälkeen saadut geelit digitalisoidaan ja analysoidaan Bionumerics-ohjelmistolla. Dendrogrammeille tehdään klusterianalyysi, jotta jatkosekvensoinnista jätetään pois näytteet, joiden samankaltaisuuskerroin on 85 %; Tällainen valinta säästää seuraavan sukupolven sekvensoinnin kustannuksia ja varmistaa, että bioinformatiikan avulla analysoitavaa dataa saadaan hallittavissa. RU3 suorittaa syvän sekvensoinnin käyttämällä taksonomisesti kiinnostavien vaihtelevien geenien amplikonikirjastoja ja erityisiä toimenpiteitä ostettavan sekvensointialustan tyypin mukaan. RU2 laatii sekvensointitulokset bioinformatiikan pohjalta.
• AII.3 Ruoka-aineenvaihdunta (RU 10). Ruokailutottumuksia koskevien tietojen perusteella kolmessa ruokavaliossa eniten edustettuina olevat fermentoidut ruoat analysoidaan, jotta löydettäisiin mahdollinen yhteys nautittujen kemiallisten yhdisteiden (esim. salisyylihappo) ja biologisista näytteistä oletettavasti talteen otettujen välillä. Metabolomianalyysit suoritetaan GC-MS/SPME (kaasukromatografia-massaspektrometria/kiinteäfaasimikrouutto) ja FTIR (Fourier Transform Infrared) -spektroskopialla.
• TOIMINTA III. Ulosteen ja syljen mikrobisto. Alustavasti kaikki sylki- ja ulostenäytteet kaikista n. 150 vapaaehtoiselle tehdään PCR-DGGE-analyysit saadakseen yleiskuvan mikrobien monimuotoisuudesta. RT-PCR-DGGE (Real Time-Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel elektroforeesi) harkitaan myös arvioitaessa elinkelpoisia populaatioita ulosteessa. Näiden analyysien perusteella edustaville näytteille kustakin ruokailutottumuksesta tehdään seuraavan sukupolven sekvensointi. Kaikkien näiden tulosten tulosten pitäisi mahdollistaa vaihe vaiheelta 4/5 ulostenäytteen valitseminen kutakin kolmea ruokavaliota varten, joille tehdään meta-omiikka-analyysi.
• TOIMINTA III.1. Biologisen monimuotoisuuden tutkimus.
• AIII.1.1. PCR-DGGE-profiili (RU 2, 3, 8) PCR-DGGE-analyysit hiivoille ja rihmasienille kohdistuvat 26S-rRNA- ja ITS-alueisiin, kun taas 16S-rRNA:n V3- ja/tai V6-V8-alueet tutkitaan bakteerien varalta. Sekä DNA:ta että RNA:ta (RT-PCR:n jälkeen) käytetään kohteena kokonais- ja vastaavasti elinkelpoisten populaatioiden tutkimiseen. Samoissa koeolosuhteissa RU3 luonnehtii sylkinäytteiden bakteerien monimuotoisuutta. DGGE:n, DNA- ja RNA-näytteistä tehtyjen kuva- ja klusterianalyysien jälkeen on mahdollista määrittää ero globaalin ja elinkelpoisen populaation välillä. Samankaltaisuusdendrogrammeja käytetään sulkemaan pois lisäsekvensointiaktiivisuudesta ne näytteet, joiden samankaltaisuuskerroin on ³ 85 %; Tällainen valinta säästää seuraavan sukupolven sekvensointianalyysien kustannuksia ja varmistaa, että bioinformatiikan avulla analysoitavaa dataa saadaan hallittavissa.
• AIII.1.2. Seuraavan sukupolven sekvensointi (RU 3, 8) Syvä sekvensointi valituista sylki- ja ulostenäytteistä tehdään käyttämällä taksonomisesti kiinnostavien vaihtelevien geenien amplikonikirjastoja. RU2 laatii bioinformatiikan perusteella kaikki sekvensointitulokset, jotka on saatu sekä bakteereille että sienille.
• AIII.1.3. Antibioottiresistenssi (RU 7) Suoraan sylki- ja ulostenäytteistä erotettu DNA seulotaan PCR-määrityksillä useiden antibioottien resistenssiä koodaavien geenien esiintymisen varalta. Näytteitä, jotka ovat positiivisia antibioottiresistenssigeenien (AR) suhteen, käytetään antibioottiresistenttien laktobasillien, laktokokkien ja enterokokkien eristämiseen. Tunnistamisen jälkeen isolaatit, joiden vähimmäisinhiboiva konsentraatio (MIC) on korkeampi kuin vastaavat raja-arvot, varmistetaan vastaavien AR-geenien PCR-monistuksella. Mahdollisuus siirtää geneettisille liikkuville elementeille lokalisoituneita AR-geenejä isolaateista kliinisesti kiinnostaviin bakteereihin arvioidaan konjugaatiokokeissa.
• AIII.2. Valittujen ulostenäytteiden metaomiikka-analyysit Kaskadilähestymistavan mukaan ulostenäytteiden mikrobien monimuotoisuuden tutkimuksen tulokset valitsevat 4/5 yksilöä, jotka edustavat jokaista kolmea ruokavaliota (4/5 x 3 = 12/ 15) meta-omiikka-analyysien kohteeksi. Meta-omiikka-lähestymistavat tarjoavat talon sisäisen tietokannan, joka koostuu 12/15 yksilön ulosteen mikrobiomista peräisin olevista DNA- ja RNA-sekvensseistä, mikä mahdollistaa täydellisen kuvan syntetisoiduista proteiineista.
• AIII.2.1. Metagenomiikka (RU3, 8) Ulosteen DNA kvantifioidaan ja metagenomiseen analyysiin sovelletaan haulikkosekvensointiprotokollaa. Tämä tehtävä on suoritettava RU3:n toimesta riippuen sekvensointialustan suorituskyvystä ja saatavuudesta. Se on mukana kokopäiväisesti ulosteen ja syljen DNA- ja cDNA-amplikonien analysoinnissa. Vaihtoehtoisesti erikoistuneet yritykset suorittavat tämän tehtävän palveluna.
• AIII.2.2. Metatranskriptomiikka (RU 6) Mikrobien yleistä geeniekspressioprofiilia karakterisoidaan käyttämällä innovatiivista Illumina-pohjaista metatranskriptomista lähestymistapaa ja hankkeen ensimmäisten kuukausien aikana laadittua protokollaa. cDNA syntetisoidaan RNA:sta optimoitujen menetelmien mukaisesti. cDNA:n satunnainen monistus suoritetaan ja cDNA sekvensoidaan käyttämällä Illumina HiSeq -alustaa. Sekvensoidut metatranskriptomit kootaan yhteen käyttämällä Velvet/MetaVelvet- tai SOAPdenovo-paketteja mahdollisimman suuren konsensussekvenssin saavuttamiseksi. Transkriptiosekvenssit merkitään vakiintuneilla liukuhihnalla ja transkriptit etsitään RPS-BLAST-ohjelmalla (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) vastaan ​​KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) ja Genbankin tietokannat. BLASTX:n tunnistamia bakteerien kaltaisia ​​lukuja haetaan edelleen COG-tietokannasta. Sekvenssien toiminnalliset roolit jaetaan KEGG- ja COG-hakujen perusteella.
• AIII.2.3. Metaproteomiikka (RU1) Ensimmäisten toimintakuukausien aikana suunnitellun työnkulun perusteella proteiinit uutetaan jokaisesta ulostenäytteestä ja analysoidaan geelittömällä ja/tai geelipohjaisella proteomiikalla. Peptidien tunnistaminen suoritetaan Finnigan LCQ Deca XP MAX -massaspektrometrillä. Proteominen differentiaalinen analyysi suoritetaan. Peptidin tunnistamiseen käytetään Open Mass Spectra Search Algorithmia etsimään MS/MS-spektrejä käytettävissä oleviin tietokantoihin verrattuna. Toiminnallisen lisäinformaation saamiseksi COG-luokitukseen perustuvat proteiinit merkitään. Tunnistetut COG:t kartoitetaan KEGG-aineenvaihduntareittien tietokantaan ja visualisoidaan iPathin online-sovelluksella. FDR-korjauksen jälkeen kaikki tunnistetut peptidit etsitään UniProtKB:tä vastaan ​​ja sitten kartoitetaan. Kaikkien tunnistettujen proteiinien korkeimman toiminnallisen tason saavuttamiseksi tunnistetut COG:t kartoitetaan KEGG-reitteihin. Yhteisen mikrobiytimen lisäksi yksilöiden ja ruokavalioiden väliset erot määritetään aineenvaihdunnan toiminnan kannalta.
• TOIMINTA IV. Toiminnallinen luonnehdinta. Ulostenäytteiden ja ulostenäytteistä saatujen mikrobiisolaattien joidenkin toiminnallisten ominaisuuksien karakterisointi vahvistaa ruokavalion ja suoliston mikrobiston välistä yhteyttä.
• AIV.1 Ulosteen genotoksisuus ja antigenotoksisuus (RU 5) Ulostevedestä (FW) valmistetaan näytteitä ja genotoksisuus määritetään Comet-määrityksellä. HT29-enterosyytit (10^6 solua/määritys), jotka on altistettu samanaikaisesti FW:lle ja sisällytetty LMA-levylle, altistetaan yksisoluiselle geelielektroforeesille (SCGE) ja analysoidaan epifluoresenssilla. Useiden elintarvikkeista peräisin olevien mikrobi-isolaattien inhiboivaa vaikutusta genotoksisiin ja mutageenisiin yhdisteisiin, joita mahdollisesti esiintyy suolistossa, tutkitaan. Mikro-organismin ja genotoksiinin yhteisinkuboinnin vaikutus määritetään arvioimalla yhdisteiden jäännösgenotoksinen aktiivisuus käyttämällä SOS-Chromotestiä (kohde Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) ja rinnakkain Comet-määritystä (kohdeenterosyytit HT29) ).
• AIV.2. Ulosteen mikro-organismit ja immuunivasteen modulaatio (RU 9) Dendriittisolujen (DC) ja Caco-2-solujen kasvun ja erilaistumisen olosuhteet luodaan ensimmäisten toimintakuukausien aikana. Laktobasillit ja bifidobakteerit eristetään kaikista ulostenäytteistä ja niitä käytetään säteilytettyinä bakteereina immuunivälittäjien ilmentymisen havaitsemiseksi enterosyyteissä. IL-8:n ja tolerogeenisen TGF-beetan (transformoiva kasvutekijä beeta) ja TSLP:n (Thymic Stromal Lymphopoietin) transkripti- ja sukulaisproteiinin eritystasot määritetään. Säteilytettyjä bakteereja käytetään myös stimuloimaan pintamarkkereita DC-soluissa. Kokonais-RNA uutetaan Caco-2- ja DC-soluista, ja cDNA valmistetaan tarkastelemaan IL-8:n, TGF-beetan, TSLP:n, TNF-alfan, IL-12p40:n ja IL-10:n suhteellista geeniekspressiota; vastaavien geenituotteiden pitoisuus määritetään ELISA:lla (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIIVISUUS V. Sylki, ulosteen ja virtsan metabolomi (RU10). "Omiikka"-lähestymistavan täydentämiseksi uloste-, virtsa- ja sylkinäytteiden metabolomi analysoidaan kolmella tekniikalla (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) ja NMR (ydinmagneettinen resonanssi). aiemmin asetettujen protokollien mukaan. Kemialliset yhdisteet tunnistetaan käyttämällä massaspektritietokantoja sekä kirjallisuuden massaspektritietoja ja/tai tietoja puhtaista kemiallisista yhdisteistä. Kun virtsa- ja sylkinäytteet on sulatettu, NMR-analyysi suoritetaan 2 tunnin sisällä. Ulostenäytteet valmistetaan siten, että vesiliukoisten molekyylien täydellinen talteenotto on mahdollisimman tärkeä. NMR-spektrit valmistellaan tilastollista analyysiä varten korjaamalla pienten piikkien kohdistusvirheitä iCoshift-algoritmin avulla.
• AKTIVITEETTI VI. Tulosten tilastollinen käsittely (kaikki rautatieyritykset). Hankkeen kehittämisen aikana RU2 huolehtii verkkosivujen ylläpidosta yhteistyössä kumppanin CBS:n (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL) kanssa, sivusto kerää kaikki tulokset eri tutkimustoiminnasta. Tätä tietokantaa käytetään analysointiin "R-moodissa" erilaisten kuvaajien vaikutuksen arvioimiseksi kolmen ruokavalion monimuotoisuuden määrittämisessä ja "Q-tilassa" kolmen ruokavalion välisen eron määrittämiseen. Samaan aikaan tärkeimmät tulokset levitetään tieteellisten julkaisujen kautta vertaisarvioituihin aikakauslehtiin.

Tutkittava aihe huomioon ottaen tässä hankkeessa on epäilemättä käytetty potentiaalisia näkökohtia. Esimerkiksi tieto ruokavalion vaikutuksista ihmisen mikrobiotaan voisi johtaa asianmukaisten ohjeiden laatimiseen, joita jaetaan integroidun hoidon edistämiskampanjoissa. Kuluttajien mieltymyksistä, asenteista, tarpeista, käyttäytymisestä, elämäntavoista ja koulutuksesta huolehditaan sekä kuluttajien ja elintarvikeketjun tutkijayhteisön välistä kommunikaatiota tehostetaan tietoisen valinnan ja sen vaikutusten elämänlaatuun parantamiseksi. Kun yksilöt voivat parantaa ja hallita terveyttään oikeiden ruokailutottumusten avulla, tuo terveydenhuoltojärjestelmille säästöjä.