Mikrobiota og relatert metabolom i altetende, vegetarisk eller vegansk diett (MRMOVVD)

Det overordnede målet med dette prosjektet er å finne forholdet mellom diett og spytt og fekal mikrobiota, gjennom høykapasitets og integrerte metaomikk (genomiske, transkriptomiske, proteomiske og metabolomiske) analyser. Flere spørsmål diskuteres fortsatt i denne sammenhengen. For eksempel, hva er det daglige inntaket av mikrober og deres rolle på balansen i tarmmikrobiotaen? Hvordan påvirkes tarmmikrobiotaen av hovedtypene kosthold (altetende, vegetarisk og vegansk)? Hvilke er de rådende mikrobielle gruppene på tarmnivå, avhengig av type diett? Hva er det antatte bidraget til hver mikrobiell gruppe for å opprettholde vertshelsen? Den kvantitative og kvalitative bestemmelsen av de viktigste mikrobielle gruppene som finnes i matvarer, avhengig av kostholdsvaner, svarer på et tidligere spørsmål og faller sammen med et av målene for dette prosjektet. Estimeringen av mangfoldet (genomikk), funksjonell aktivitet (transkriptomikk og proteomikk) og metabolitter (metabolomikk) av, spesielt, den fekale mikrobiotaen faller sammen med den holistiske tilnærmingen til dette prosjektet og svarer på flere av de tidligere spørsmålene. Tatt i betraktning den nære sammenhengen mellom balansen mellom ulike mikrobielle populasjoner i ulike nisjer i menneskekroppen og utbruddet av metabolske patologier, skal dette prosjektet fremskaffe ny kunnskap som kan fremheve mulige sammenhenger mellom kosthold og nedbrytning. Kosthold må betraktes som det mest hensiktsmessige og rimelige verktøyet for å bestemme en stabil og gunstig oral og intestinal mikrobiota, som forhindrer sykdommer og garanterer menneskelig lang levetid. Disse overordnede målene for prosjektet skal nås på grunnlag av spesifikke mål, slik som: (i) identifisering av biologiske, molekylære og metabolske markører som er spesifikke for dietttypen; (ii) estimering av forskjellene i mikrobiota og metabolom av spytt og avføring, både blant individer og mellom typer diett; (iii) estimering av de kvalitative og kvantitative forskjellene på det mikrobielle inntaket knyttet til typen diett; og (iv) identifisering av de funksjonelle egenskapene til avføringsprøver relatert til typen diett, som kan betraktes som indikatorer på sykdomsfølsomhet.

Med sikte på å nå det overordnede målet for dette prosjektet, er ti forskningsenheter (RUs; RU1-10) involvert i forslaget, med partnerskap av 16 nasjonale og spesielt utenlandske institusjoner, som dekker 12 forskjellige land. Lederne for hver RU er rapportert nedenfor:

• RU1. Marco Gobbetti er hovedetterforsker av forslaget og leder av RU1. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 188 publikasjoner som ble sitert 4075 ganger, med et gjennomsnitt av siteringer per publikasjon på 21,68 og en h-indeks på 39. Han har nylig blitt oppført i Top Italian Scientists av VIA Academy (årlig evaluering for forskere som har en verdi på h-indeks høyere enn 30). RU1 har fått god erfaring med studiet av tarmmikrobiotaen til cøliakere, og på proteomikken brukt på melkesyrebakterier og matvarer. RU1 vil spille rollen som koordinator for prosjektet. Innenfor dette prosjektet er RU1 involvert i: rekruttering av frivillige; administrasjon av dagbøker; håndtering og klargjøring av biologiske prøver; bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i avføringsprøvene ved kulturavhengige metoder; meta-proteomikk karakterisering av utvalgte fekale prøver fra individer som har forskjellige kostholdsvaner; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU1 samarbeide med Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Spania, for spesifikk tilordning av funksjonelle aktiviteter og/eller metabolske veier til identifiserte proteiner og med Department of Mikrobiologi ved University College Cork, Irland, for den bioinformatiske tilnærmingen til proteomstudier.
• RU2. Gianluigi Cardinali er leder for RU2. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 38 publikasjoner med en h-indeks på 11. RU2 har opereret i omtrent tjue år innen biologisk mangfold og taksonomi av gjær, som analyseres gjennom mikrobiologiske og molekylære teknikker. Innenfor dette prosjektet er RU2 involvert i: karakterisering av mangfoldet av matmikobiota gjennom PCR-DGGE-tilnærming; karakterisering av mikrobiota av fekale prøver gjennom PCR-DGGE-tilnærming; og, som leder, i styringen av den statistiske utarbeidelsen av resultatene fra alle jernbaneforetakene, tilveiebringe en felles database. RU2 vil samarbeide med Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Nederland, for bioinformatisk utarbeidelse av dataene.
• RU3. Danilo Ercolini er leder for RU3. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 58 publikasjoner, med et totalt antall siteringer på 1354 og en h-indeks på 21. RU3 har vært involvert i mange år nå i studier av mikrobiell økologi til komplekse økosystemer, hovedsakelig matøkosystemer. Matmikrobiotaen har alltid blitt studert ved avanserte molekylære tilnærminger og ved kulturuavhengige metoder som ikke krever dyrking av mikroorganismer på syntetiske medier. Innenfor dette prosjektet er RU3 involvert i: karakterisering av mangfoldet av mikrobiota i spyttprøver; dyp sekvensering av utvalgte matprøver; dyp sekvensering av utvalgte fekale og spyttprøver; meta-genomisk karakterisering av utvalgte fekale prøver fra individer med forskjellige kostholdsvaner; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU3 samarbeide med Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) som drives i Argonne National Laboratory, Lemont, USA, for å lage datasett som beskriver mikroorganismer fra et bredt spekter av økosystemer.
• RU4. Erasmo Neviani er leder for RU4. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 111 publikasjoner, med et totalt antall siteringer på 1508 og en h-indeks på 22. RU4 har fått god erfaring innen matmikrobiell økologi for en omfattende og integrert evaluering av mikrobielle populasjoner, dynamikk og fysiologisk status til cellene i ulike stadier av matproduksjonen. Innenfor dette prosjektet er RU4 involvert i: utarbeidelse av dagbøker; rekruttering av frivillige; administrasjon av dagbøker; håndtering og klargjøring av biologiske prøver; bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i avføringsprøvene gjennom kulturavhengige metoder; utarbeidelse av resultatene fra dagbøker; bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i matvarer gjennom kulturavhengige og -uavhengige metoder; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU4 samarbeide med Institutt for matvitenskap og teknologi ved Agricultural University of Athens, Hellas, for mikrobiell bestemmelse i matvarer og spesielt i meieriprodukter, med Epidemiology Unit of Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori fra Milano, Italia, for hjelp til registrering av kostvaner, og med det nasjonale instituttet for mat- og ernæringsforskning i Roma, Italia, for å overvåke de antatte manglene knyttet til restriktive kostholdsregimer.
• RU5. Aldo Corsetti er leder for RU5. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 81 publikasjoner med et totalt antall siteringer på 2084 og en h-indeks på 28. RU5 har opparbeidet god erfaring innen mikrobiell økologi av mat og drikke, så vel som med karakterisering av stammer for bioteknologiske og funksjonelle aspekter, for å velge startkulturer for ulike bruksområder. Innenfor dette prosjektet er RU5 involvert i: bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i matvarer gjennom kulturavhengige metoder; identifikasjon og typing av mikrobielle isolert fra matvarer; karakterisering av genotoksisiteten til fekale prøver; karakterisering av den antigentoksige aktiviteten til mikrobielle isolater fra matvarer; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU5 samarbeide med Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, Canada, for molekylær typing av matisolerte mikroorganismer ved hjelp av en multi-locus type sekvensering.
• RU6. Patrizia Brigidi er leder for RU6. Som rapportert av ISI Web of Science, er hun forfatter av 102 publikasjoner som ble sitert 3158 ganger, med et gjennomsnitt av siteringer per publikasjon på 32,41 og en h-indeks på 26. RU6 har en konsolidert og bred kompetanse innen identifikasjon og molekylær kvantifisering av bakterier fra komplekse økosystemer (avføring og tarmbiopsier) og innen molekylære mekanismer ansvarlige for helsegevinster av bakterier. Innenfor dette prosjektet er RU6 involvert i: rekruttering av frivillige; administrasjon av dagbøker; håndtering og klargjøring av biologiske prøver; bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i avføringsprøvene gjennom kulturavhengige metoder; meta-transkriptomisk karakterisering av utvalgte fekale prøver fra individer som har forskjellige kostholdsvaner; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU6 samarbeide med Food Microbial Science Unit, University of Reading, Storbritannia, for utviklingen av den metatranskriptomiske plattformen og i den bioinformatiske analysen av de oppnådde sekvensene for deres tilordning til KEGG og COG-klynge av funksjonelle aktiviteter.
• RU7. Francesca Clementi er leder for RU7. Som rapportert av ISI Web of Science, er hun forfatter av 59 publikasjoner som ble sitert 504 ganger, med et gjennomsnitt av siteringer per publikasjon på 11,25 og en h-indeks på 15. RU7 har en pålitelig ekspertise angående rollen, overvåking og kontroll av matbårne mikroorganismer, spesielt melkesyrebakterier. Innenfor dette prosjektet er RU7 involvert i: karakterisering av mangfoldet av matmikrobiota ved PCR-DGGE; bestemmelse av antibiotikaresistens i fekal- og spyttprøver; isolering og identifikasjon av antibiotikaresistente melkesyrebakterier fra fekale og spyttprøver; karakterisering av genene involvert i den mikrobielle antibiotikaresistensen; studie av mekanismene for overføring av antibiotikaresistens mellom bakterier; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU7 samarbeide med det greske Democritus University of Thrace, Hellas, og med Rowett Institute for Nutrition and Health ved University of Aberdeen, Skottland, om undersøkelse av overførbare antibiotikaresistensgener i matvarer og melkesyrebakterier isolert. fra spytt og avføringsprøver.
• RU8. Luca Simone Cocolin er leder for RU8. Som rapportert av Scopus, er han forfatter 131 publikasjoner som ble sitert 2036 ganger, noe som resulterer i en h-indeks på 25. RU 8 har lang erfaring med anvendelse av kulturuavhengige metoder for studiet av mikrobiell biologisk mangfold og vitalitet i fermentert mat. Den har også kunnskap om kvantitativ PCR (qPCR) for kvantifisering av spesifikke mikroorganismer fra komplekse økosystemer. Innenfor dette prosjektet er RU8 involvert i: rekruttering av frivillige; administrasjon av dagbøker; håndtering og klargjøring av biologiske prøver; bestemmelse av de viktigste mikrobielle gruppene i avføringsprøvene gjennom kulturavhengige metoder; profilering av fekal mikrobiota ved DGGE-tilnærminger brukt både på DNA- og RNA-nivå; meta-genomisk karakterisering av utvalgte fekale prøver fra individer med forskjellige kostholdsvaner; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU8 samarbeide med University of Maribor (UM), Slovenia, og Demokritus University of Thrace (DUT), Alexandroupolis, Hellas, for aspekter, håndtering av interaksjonen mellom patogener-vertsceller og for mulige modifikasjoner av diett til de forskjellige diettgruppene, som best kan utnytte den kjente fordelaktige rollen til visse mikrobielle grupper assosiert med spesifikke matvarer.
• RU9. Mauro Rossi er leder for RU9. Som rapportert av ISI Web of Science, er han forfatter av 41 publikasjoner, med et totalt antall siteringer på 1087 og en h-indeks på 19. RU9 har lang erfaring (>25 år) og sterke samarbeid innen biokjemi og immunologi i tynntarmen. Innenfor dette prosjektet er RU9 involvert i: isolering av laktobaciller og bifidobakterier fra fekale prøver; karakterisering av in vitro-immunresponsen til fekale isolater ved bruk av Caco-2-celle; karakterisering av in vitro-immunresponsen til fekale isolater ved bruk av dendrittiske celler; måling av cytokinsekresjon i Caco-2 og dendrittiske celler; og statistisk utarbeidelse av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil RU9 samarbeide med Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Spania (vedlegg i modell B), for å fastslå om særegenheter i fekal mikrobiota kan spille en rolle i utbruddet av immunsvikt i tarmen.
• RU10. Lucia Vannini er leder for RU10. Som rapportert av ISI Web of Science, er hun forfatteren av 27 publikasjoner med et totalt antall siteringer på 322 og en h-indeks på 9. RU10 har fått god erfaring både innen matmikrobiologi og i bruk av instrumentelle teknikker, og spesielt kjernemagnetisk resonans, for metabolomanalyse av biologiske prøver. Innenfor dette prosjektet er RU10 involvert i: metabolomkarakterisering av utvalgte matvarer; metabolomkarakterisering av spyttprøver; metabolomkarakterisering av fekale og urinprøver, og statistisk utdyping av resultatene. Innenfor dette prosjektet vil R10 samarbeide med det svenske institutet för mat- og bioteknologi, Sverige, og Institutet för kjemisk teknologi, Institutt for forskning og utvikling, Praha, Tsjekkia, for henholdsvis aspekter vedrørende metabolomisk karakterisering av enkelte utvalgte matvarer og biologiske prøver. Kaskadetilnærmingen som brukes vil gjøre hver forskningsaktivitet og hver RU uunnværlig for å nå hovedmålene for prosjektet.

Denne studien vil være sammensatt av forskjellig aktivitet (AI-VI) beskrevet nedenfor:

• AKTIVITET I. Rekruttering av enkeltpersoner, administrasjon av dagbøker, håndtering, klargjøring og oppbevaring av biologiske prøver, og mikrobiologiske analyser av fekale prøver.
• AI.1. Rekruttering av individer og administrasjon av dagbøker (RU1, 4, 6, 8) Omtrent 50 omnivore, vegetarianere og veganske frivillige, for totalt 150 emner, vil bli rekruttert. Vegetariske og veganske individer vil bli rekruttert i samarbeid med det italienske vitenskapsselskapet av vegetarisk ernæring. Altetende individer vil bli rekruttert gjennom annonser publisert ved universitetene. Omtrent 50 friske frivillige vil bli rekruttert, inkludert et omtrent like antall altetende, vegetarianere og veganere (alder 18-59 år, mann/kvinnelig forhold ca. 1:1). Rekrutterte frivillige vil bli bedt om å signere et konsensusdokument for å registrere kostholdsvanene deres. Dagbøkene vil være forseggjorte for å få detaljert informasjon om matens egenskaper, noe som gjør det enkelt å identifisere produktene på markedet og en estimering av den antatte mikrobielle belastningen som inntas. Universitetenes etiske komité vil bli informert før prosjektet starter.
• AI.2. Håndtering, klargjøring og lagring av biologiske prøver (RU1, 4, 6, 8). Hver enkelt vil levere prøver av spytt, avføring og urin ukentlig, i et tidsrom på tre uker. Trippelprøver vil bli samlet før analyser for å begrense den intra-individuelle variabiliteten. Håndtering vil bli utført forskjellig avhengig av type biologiske prøver (spytt, avføring, urin) og påfølgende analyser (f.eks. DNA, RNA, proteom). Samtidig med rekruttering av individer og innsamling av biologiske prøver, vil de fleste RU-ene være involvert i å sette opp teknikkene/metodene.
• AI.3. Mikrobiologiske analyser av fekale prøver (RU1, 4, 6, 8). I den første tiden vil de levedyktige tellingene bli utført ved å plettere ferskt fekalt materiale på forskjellige selektive kulturmedier, for å telle opp de vanligste fekale mikrobielle gruppene.
• AI.4. Oppsett av teknikker/metoder (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Samtidig med rekruttering av individer og innsamling av biologiske prøver, vil de fleste RU-ene være involvert i å sette opp teknikkene/metodene. For å etablere en uavhengig og konkurransedyktig plattform for metaomikk-analyser, vil RU3 kjøpe utstyr for sekvensering med høy gjennomstrømning, som er en økonomisk hovedinvestering i dette prosjektet.
• AKTIVITET II. Matmikrobiota og metabolom. Basert på informasjonen fra kostholdsdagbøker, vil de mest representative matvarene av de 3 diettene deles inn i 3 kategorier: (i) lav (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) mellomprodukt (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); og (iii) høy (TBC ³ 10^6 cfu/g) mikrobiell belastning. For matvarer i gruppe (i) vil mikrobielt antall estimeres basert på litteraturdata. For matvarer i gruppene (ii) og (iii) vil mikrobielt antall bli bestemt basert på litteraturdata når det gjelder velkjente produkter med lav markedsdifferensiering (f.eks. Parmigiano Reggiano-ost), mens passende analyser vil bli gjort i tilfelle av matvarer i gruppene (ii) og (iii) produkter med stor variasjon i markedet (f.eks. mozzarellaost). I sistnevnte tilfelle vil analysene involvere et stort antall produkter tilgjengelig i markedet. Det mikrobielle mangfoldet av matvarer vil bli studert mer i dybden først ved PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel electrophoresis) og ved behov ved dyp sekvensering på grunnlag av kompleksitetsnivå og nåværende kunnskap om mikrobiotaen til de spesifikke matvarene.
• AII.1 Kvantitativ bestemmelse av mikroorganismer i næringsmidler (RU 4, 5; 7). Analysen av matvarer vil bli delt mellom RU4 og 5, og noen prøver vil bli analysert av begge RU for å gjensidig validere resultatene. Deretter vil RU4 karakterisere utvalgte matvarer ved LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) analyse, og resultatene vil bli sammenlignet med de oppnådd av RU7 ved bruk av PCR-DGGE. RU5 vil identifisere en stor samling av isolater fra matvarer, med sikte på å finne mulige sammenhenger med redusert antigentoksisk aktivitet i fekalvannet og tilstedeværelse av spesifikke mikroorganismer i den inntatte maten.
• AII.2 Mikrobiell mangfold i matvarer (RU 2, 3). For det første vil denne aktiviteten vurdere dårlig karakterisert mat som er spesifikt spist av veregetarianere og veganere basert på registreringer fra dagbøker. Både mikro- og mikrobiota vil bli undersøkt. PCR-DGGE-analyser for gjær og filamentøse sopp vil være basert på amplifisering av deler av D1/D2-domenet som koder for underenheten LSU eller 26S av rRNA, og ITS-regionene (Internal transkribert spacer). V3-regionen til 16S rRNA-genet vil bli målrettet for å oppdage bakterier. Etter DGGE-analyse vil de resulterende gelene bli digitalisert og analysert av programvaren Bionumerics. Dendrogrammer vil bli utsatt for klyngeanalyse for å utelukke fra den videre sekvenseringen de prøvene som har en likhetskoeffisient på 85 %; slikt utvalg vil spare kostnader for neste generasjons sekvensering, og vil sikre å få en håndterbar mengde data som skal analyseres via bioinformatikk. RU3 vil utføre dyp sekvensering ved å bruke biblioteker av amplikoner av variable gener av taksonomisk interesse og ved å bruke spesifikke prosedyrer i henhold til typen sekvenseringsplattform som vil bli kjøpt. Sekvenseringsresultatene vil bli utarbeidet på bioinformatisk basis av RU2.
• AII.3 Matmetabolom (RU 10). Basert på informasjonen om kostholdsvaner, vil de fermenterte matvarene som er mest representert i de tre diettene, analyseres for å finne en mulig sammenheng mellom kjemiske forbindelser inntatt (f.eks. salysilsyre) og presumptivt gjenvunnet i biologiske prøver. Metabolomanalysene vil bli utført ved GC-MS/SPME (gasskromatografi-massespektrometri/fastfase mikroekstraksjon) og FTIR (Fourier Transform Infrared) spektroskopi.
• AKTIVITET III. Mikrobiotaen av avføring og spytt. Foreløpig ble alle spytt- og avføringsprøver fra alle de ca. 150 frivillige skal gjennomgå PCR-DGGE-analyser for å få oversikt over det mikrobielle mangfoldet. RT-PCR-DGGE (Real Time- Polymerase Chain Reaction- Denaturing gradient gel electrophoresis) vil også bli vurdert for å estimere levedyktige populasjoner i feces. Basert på disse analysene vil representative prøver av hver kostvane bli gjenstand for neste generasjons sekvensering. Resultatet av alle disse resultatene bør tillate, trinn for trinn, valg av 4/5 avføringsprøver for hver av de tre diettene som skal utsettes for metaomiske analyser.
• AKTIVITET III.1. Studie av biologisk mangfold.
• AIII.1.1. PCR-DGGE-profilering (RU 2, 3, 8) PCR-DGGE-analyser for gjær og filamentøse sopp vil målrette 26S rRNA og ITS regioner, mens V3 og/eller V6-V8 regioner av 16S rRNA vil bli studert for bakterier. Både DNA og RNA (etter RT-PCR) vil bli brukt som mål for å undersøke henholdsvis totale og levedyktige populasjoner. Under de samme eksperimentelle forholdene vil RU3 karakterisere det bakterielle mangfoldet av spyttprøver. Etter DGGE, bilde- og klyngeanalyser fra DNA- og RNA-prøver vil det være mulig å definere en forskjell mellom den globale og levedyktige befolkningen. Likhetsdendrogrammene vil bli brukt for å ekskludere fra den videre sekvenseringsaktiviteten de prøvene som har en likhetskoeffisient ³ 85 %; slikt utvalg vil spare kostnader for neste generasjons sekvenseringsanalyser, og vil sikre å få en håndterbar mengde data som skal analyseres via bioinformatikk.
• AIII.1.2. Neste generasjons sekvensering (RU 3, 8) Dyp sekvensering på utvalgte spytt- og fekale prøver vil bli utført ved å bruke biblioteker av amplikoner av variable gener av taksonomisk interesse. Alle sekvenseringsresultater oppnådd både for bakterier og sopp vil bli utarbeidet på bioinformatisk basis av RU2.
• AIII.1.3. Antibiotikaresistens (RU 7) DNA ekstrahert direkte fra spytt- og fekale prøver vil bli screenet for forekomst av gener som koder for resistens mot flere antibiotika ved bruk av PCR-analyser. Prøver, som viste seg å være positive for gener for antibiotikaresistens (AR), vil bli brukt til å isolere antibiotikaresistente laktobaciller, laktokokker og enterokokker. Etter identifikasjon vil isolater som viser verdier for minimum hemmende konsentrasjon (MIC) høyere enn de tilsvarende bruddpunktene, bekreftes ved PCR-amplifisering av de tilsvarende AR-genene. Muligheten for å overføre AR-gener lokalisert på genetiske mobile elementer fra isolater til bakterier av klinisk interesse vil bli evaluert ved konjugasjonsforsøk.
• AIII.2. Meta-omiske analyser av utvalgte fekale prøver I henhold til kaskadetilnærmingen vil resultatene fra studiet av det mikrobielle mangfoldet av fekale prøver velge 4/5 individer som er representative for hver av de 3 dietttypene (4/5 x 3 = 12/ 15) å bli gjenstand for meta-omikk-analyser. Meta-omics-tilnærmingene vil gi en egen database, bestående av DNA- og RNA-sekvensene fra de fekale mikrobiomene til 12/15 individer, som vil gi en fullstendig oversikt over de syntetiserte proteinene.
• AIII.2.1. Meta-genomikk (RU3, 8) Fekalt DNA vil bli kvantifisert og en haglesekvenseringsprotokoll vil bli brukt for meta-genomisk analyse. Denne oppgaven bør utføres av RU3, avhengig av ytelse og tilgjengelighet til sekvenseringsplattformen, som vil være engasjert på heltid i analyse av DNA- og cDNA-amplikoner av avføring og spytt. Alternativt vil spesialiserte bedrifter utføre denne oppgaven som en tjeneste.
• AIII.2.2. Meta-transkriptomikk (RU 6) Den generelle mikrobielle genekspresjonsprofilen vil bli karakterisert ved hjelp av en innovativ Illumina-basert metatranskriptomisk tilnærming og protokollen som ble satt opp i løpet av de første månedene av prosjektet. cDNA vil bli sintetisert fra RNA i henhold til optimaliserte prosedyrer. Tilfeldig amplifikasjon av cDNA vil bli utført og cDNA vil bli sekvensert ved å bruke Illumina HiSeq-plattformen. De sekvenserte meta-transkriptomene vil bli satt sammen ved hjelp av Velvet/MetaVelvet eller SOAPdenovo-pakker for å oppnå størst mulig konsensussekvens. Transkripsjonssekvensene vil bli kommentert ved hjelp av veletablerte rørledninger, og transkripsjoner vil bli søkt ved hjelp av RPS-BLAST (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) mot KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) og Genbank-databasene. Bakterielignende avlesninger identifisert av nr BLASTX vil bli søkt videre mot COG-databasen. De funksjonelle rollene til sekvensene vil bli tildelt basert på KEGG- og COG-søkene.
• AIII.2.3. Meta-proteomics (RU1) Basert på arbeidsflyten designet innen de første månedene av aktivitet, vil proteiner bli ekstrahert fra hver avføringsprøve og analysert med gelfri og/eller gelbasert proteomikk. Identifikasjonen av peptider vil bli utført ved hjelp av massespektrometeret Finnigan LCQ Deca XP MAX. Differensiell proteomisk analyse vil bli utført. For peptididentifikasjon vil Open Mass Spectra Search Algorithm brukes til å søke MS/MS-spektra mot de tilgjengelige databasene. For å hente ytterligere funksjonell informasjon vil proteinene basert på COG-klassifisering bli kommentert. De identifiserte COG-ene vil bli kartlagt på KEGG metabolske pathways-database og visualisert av den elektroniske applikasjonen av iPath. Etter FDR-korreksjon vil alle identifiserte peptider bli søkt mot UniProtKB og deretter kartlagt. For å adressere det høyeste funksjonelle nivået av alle de identifiserte proteinene, vil de identifiserte COG-ene på KEGG-veier bli kartlagt. Foruten den vanlige mikrobielle kjernen, vil inter-individuelle og inter-diett-forskjeller bli bestemt med tanke på metabolsk funksjon.
• AKTIVITET IV. Funksjonell karakterisering. Karakteriseringen av noen funksjonelle trekk ved fekale prøver og av mikrobielle isolater fra fekale prøver vil styrke koblingen mellom kosthold og tarmmikrobiota.
• AIV.1 Fekal genotoksisk og anti-gentoksisk aktivitet (RU 5) Prøver av fekalt vann (FW) vil bli klargjort og genotoksisiteten vil bli bestemt ved Comet-analyse. HT29-enterocyttene (10^6 celler/analyse) co-eksponert for FW og inkorporert i LMA-objektglass vil bli utsatt for Single-Cell Gel-Electrophoresis (SCGE) og analysert ved epifluorescens. Flere mikrobielle isolater fra matvarer vil bli undersøkt for den hemmende aktiviteten mot genotoksiske og mutagene forbindelser, som potensielt finnes i tarmen. Effekten av saminkubasjonen av mikroorganisme-genotoksin vil bli analysert gjennom evaluering av gjenværende genotoksisk aktivitet til forbindelsene ved bruk av SOS-kromotesten (target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) og, parallelt, Comet-analysen (target enterocytes HT29) ).
• AIV.2. Fekale mikroorganismer og modulering av immunresponsen (RU 9) Betingelsene for vekst og differensiering av dendrittiske celler (DC) og Caco-2 celler vil bli satt opp i løpet av de første månedene av aktivitet. Laktobaciller og bifidobakterier vil bli isolert fra alle fekale prøver og brukt som bestrålte bakterier for å påvise ekspresjonen av immunmediatorer i enterocytter. Transkripsjon og beslektede proteinsekresjonsnivåer av IL-8 og tolerogen TGF-beta (Transforming growth factor beta) og TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin) vil bli bestemt. Bestrålte bakterier vil også bli brukt til å stimulere overflatemarkører i DC-celler. Totalt RNA vil bli ekstrahert fra Caco-2 og DC-cellene, og cDNA vil bli forberedt for å se på det relative genuttrykket av IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 og IL-10; konsentrasjonen av de tilsvarende genproduktene vil bli bestemt ved ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITET V. Spytt-, fekal- og urinmetabolom (RU10). For å fullføre "omics"-tilnærmingen vil metabolomet til prøver av avføring, urin og spytt analyseres med tre teknikker (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) og NMR (Nuclear Magnetic Resonance) i henhold til protokollene som er satt opp tidligere. Kjemiske forbindelser vil bli identifisert ved hjelp av massespektradatabaser samt massespektradata i litteraturen og/eller data fra rene kjemiske forbindelser. Ved tining av urin- og spyttprøver vil NMR-analysen utføres innen 2 timer. Avføringsprøver vil bli utarbeidet som gir maksimal betydning for fullstendig gjenvinning av vannløselige molekyler. NMR-spektrene vil bli forberedt for statistisk analyse ved å korrigere de små toppene feiljusteringene gjennom iCoshift-algoritmen.
• ATTIVITET VI. Statistisk utdyping av resultatene (alle RUer). Under prosjektutviklingen vil RU2 ta seg av vedlikeholdet av nettsiden i samarbeid med partneren CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), siden vil samle alle resultatene fra de forskjellige forskningsaktivitetene. Denne databasen vil bli brukt til analyse i "R-modus" for å vurdere virkningen av ulike deskriptorer for å bestemme mangfoldet av de tre diettene, og i "Q-modus" for å bestemme forskjellen mellom de tre diettene. I løpet av samme tid vil de mest relevante resultatene formidles gjennom vitenskapelige publikasjoner til fagfellevurderte tidsskrifter.

Med tanke på emnet som skal studeres, har dette prosjektet utvilsomt brukt potensielle aspekter. For eksempel kan kunnskap om effekten av kosthold på menneskelig mikrobiota resultere i utarbeidelse av hensiktsmessige retningslinjer som skal distribueres i kampanjer for integrert omsorgsfremmende arbeid. Forbrukernes preferanser, holdninger, behov, atferd, livsstil og utdanning skal ivaretas, og kommunikasjonen mellom forbrukere og næringskjedeforskningsmiljøet skal styrkes for å forbedre informerte valg og deres innvirkning på livskvaliteten. Å gi enkeltpersoner mulighet til å forbedre og administrere helsen sin gjennom riktige kostholdsvaner vil resultere i kostnadsbesparelser for helsevesenet.