杂食、素食或素食饮食中的微生物群和相关代谢组 (MRMOVVD)

该项目的总体目标是通过高通量和综合元组学（基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学）分析，找出饮食与唾液和粪便微生物群之间的关系。 在这方面仍有几个问题存在争议。 例如，微生物的每日摄入量是多少及其对肠道菌群平衡的作用？ 肠道菌群如何受到主要饮食类型（杂食、素食和严格素食）的影响？ 根据饮食类型，肠道水平的主要微生物群是哪些？ 每个微生物群在维持宿主健康方面的假定贡献是什么？ 根据饮食习惯，对食物中主要微生物群的定量和定性测定回答了一个较早的问题，并且与该项目的目标之一一致。 对粪便微生物群的多样性（基因组学）、功能活性（转录组学和蛋白质组学）和代谢物（代谢组学）的估计与该项目的整体方法相吻合，并回答了几个早期的问题。 考虑到人体不同生态位中不同微生物种群的平衡与代谢病症的发生之间的密切相关性，该项目将提供可能突出饮食与分解代谢之间可能关系的新知识。 饮食必须被视为确定稳定和有利的口腔和肠道微生物群的最合适和最廉价的工具，从而预防疾病并保证人类长寿。 项目的这些总体目标应在具体目标的基础上实现，例如：(i) 确定饮食类型特有的生物、分子和代谢标记； (ii) 估计个体之间和饮食类型之间唾液和粪便的微生物群和代谢组的差异； (iii) 估计与饮食类型相关的微生物摄入量的定性和定量差异； (iv) 鉴定与饮食类型相关的粪便样本的功能特征，这可以被视为疾病易感性的指标。

为了实现该项目的总体目标，该提案涉及 10 个研究单位（RU；RU1-10），并与 16 个国家机构（尤其是外国机构）合作，涵盖 12 个不同的国家。 各RU的领导人报告如下：

• RU1。 Marco Gobbetti 是该提案的首席研究员和 RU1 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，他是 188 篇论文的作者，被引用 4,075 次，每篇论文的平均引用次数为 21.68，h 指数为 39。 他最近被 VIA 学院列为意大利顶级科学家（对 h 指数值高于 30 的科学家进行年度评估）。 RU1在乳糜泻肠道菌群研究，以及应用于乳酸菌和食品的蛋白质组学研究方面积累了良好的经验。 RU1 将扮演项目协调员的角色。 在这个项目中，RU1 参与： 招募志愿者；日记管理；生物样品的处理和制备；通过依赖于培养的方法测定粪便样品中的主要微生物群；从具有不同饮食习惯的个体中选择的粪便样本的宏蛋白质组学特征；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU1 将与西班牙马德里 CIAL (CSIC - UAM) 的 Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon 合作，将功能活动和/或代谢途径具体归因于已鉴定的蛋白质，并与爱尔兰科克大学的微生物学，用于蛋白质组研究的生物信息学方法。
• RU2。 Gianluigi Cardinali 是 RU2 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，他发表了 38 篇论文，h 指数为 11。 RU2 在酵母的生物多样性和分类学领域开展工作已有大约 20 年的历史，这些领域通过微生物学和分子技术进行分析。 在该项目中，RU2 参与： 通过 PCR-DGGE 方法表征食品微生物群的多样性；通过 PCR-DGGE 方法表征粪便样本的微生物群；并且，作为领导者，管理所有 RU 结果的统计阐述，提供一个通用数据库。 RU2 将与荷兰乌得勒支的 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) 合作，对数据进行生物信息学阐述。
• RU3。 Danilo Ercolini 是 RU3 的领袖。 据 ISI Web of Science 报道，他是 58 篇出版物的作者，总引用次数为 1,354，h 指数为 21。 RU3 多年来一直从事复杂生态系统（主要是食物生态系统）的微生物生态学研究。 食品微生物群一直通过先进的分子方法和不需要在合成培养基上培养微生物的独立培养方法进行研究。 在该项目中，RU3 参与：唾液样本中微生物群多样性的表征；选定食品样本的深度测序；对选定的粪便和唾液样本进行深度测序；从具有不同饮食习惯的个体中选择的粪便样本的宏基因组学特征；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU3 将与地球微生物组项目（EMP，www.earthmicrobiome.org）合作 它在美国莱蒙特的阿贡国家实验室运行，以创建描述来自广泛生态系统的微生物的数据集。
• RU4。 Erasmo Neviani 是 RU4 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，他是 111 篇出版物的作者，总引用次数为 1,508，h 指数为 22。 RU4在食品微生物生态学方面积累了丰富的经验，能够对食品制造各阶段的微生物种群、动态和细胞生理状态进行综合评价。 在这个项目中，RU4 参与： 准备日记；招募志愿者；日记管理；生物样品的处理和制备；通过依赖培养的方法测定粪便样本中的主要微生物群；详细说明日记的结果；通过依赖于培养和独立于培养的方法测定食品中的主要微生物群；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU4 将与希腊雅典农业大学食品科学与技术系合作，与 Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei 的流行病学部门合作，对食品，尤其是乳制品中的微生物进行测定意大利米兰的 Tumori 协助记录饮食习惯，并与意大利罗马国家食品和营养研究所合作监测与限制性饮食制度相关的假定缺陷。
• RU5。 Aldo Corsetti 是 RU5 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，他是 81 篇出版物的作者，总引用次数为 2,084，h 指数为 28。 RU5 在食品和饮料的微生物生态学领域以及生物技术和功能方面的菌株表征方面积累了丰富的经验，以便为不同的应用选择发酵剂培养物。 在该项目中，RU5 参与： 通过依赖培养的方法测定食品中的主要微生物群；从食品中分离出的微生物的鉴定和分型；粪便样品遗传毒性的表征；从食品中分离出的微生物的抗基因毒素活性的表征；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU5 将与加拿大阿尔伯塔大学农业、食品和营养科学系合作，通过多位点类型测序对食品分离微生物进行分子分型。
• RU6。 Patrizia Brigidi 是 RU6 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，她是 102 篇论文的作者，被引用 3,158 次，平均每篇论文被引用 32.41 次，h 指数为 26。 RU6 在复杂生态系统（粪便和肠道活检）细菌的鉴定和分子定量领域以及负责细菌健康益处的分子机制领域具有综合而广泛的能力。 在这个项目中，RU6 参与： 招募志愿者；日记管理；生物样品的处理和制备；通过依赖培养的方法测定粪便样本中的主要微生物群；从具有不同饮食习惯的个体中选择的粪便样本的元转录组学特征；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU6 将与英国雷丁大学食品微生物科学部合作开发元转录组学平台，并对获得的序列进行生物信息学分析，以将其分配给 KEGG 和 COG 功能活动集群。
• RU7。 Francesca Clementi 是 RU7 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，她是 59 篇论文的作者，被引用 504 次，平均每篇论文被引用 11.25 次，h 指数为 15。 RU7 在食源性微生物（尤其是乳酸菌）的作用、监测和控制方面拥有值得信赖的专业知识。 在该项目中，RU7 参与： 通过 PCR-DGGE 表征食品微生物群的多样性；粪便和唾液样本中抗生素耐药性的测定；从粪便和唾液样本中分离和鉴定抗生素耐药性乳酸菌；微生物抗生素抗性相关基因的表征；细菌间抗生素耐药性转移机制的研究；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU7 将与希腊德谟克利特色雷斯大学和苏格兰阿伯丁大学 Rowett 营养与健康研究所合作，研究食品和分离出的乳酸菌中可转移的抗生素抗性基因来自唾液和粪便样本。
• RU8。 Luca Simone Cocolin 是 RU8 的领导者。 据 Scopus 报道，他是 131 篇论文的作者，被引用 2,036 次，h 指数为 25。 RU 8 在应用独立于培养的方法研究发酵食品中的微生物多样性和活力方面拥有丰富的经验。 它还具有用于定量复杂生态系统中特定微生物的定量 PCR (qPCR) 知识。 在这个项目中，RU8 参与： 招募志愿者；日记管理；生物样品的处理和制备；通过依赖培养的方法测定粪便样本中的主要微生物群；通过在 DNA 和 RNA 水平上应用的 DGGE 方法对粪便微生物群进行分析；从具有不同饮食习惯的个体中选择的粪便样本的宏基因组特征；和结果的统计阐述。 在这个项目中，RU8 将与斯洛文尼亚马里博尔大学 (UM) 和希腊亚历山德鲁波利斯的色雷斯德谟克利特大学 (DUT) 合作，处理病原体-宿主细胞的相互作用以及可能的修改不同饮食组的饮食，可能最好地分别利用与特定食物相关的某些微生物群的已知有益作用。
• RU9。 Mauro Rossi 是 RU9 的领袖。 据 ISI Web of Science 报道，他是 41 篇出版物的作者，总引用次数为 1087，h 指数为 19。 RU9 在小肠生物化学和免疫学领域拥有长期经验（>25 年）和强有力的合作。 在该项目中，RU9 参与： 从粪便样本中分离乳酸杆菌和双歧杆菌；使用 Caco-2 细胞表征粪便分离物的体外免疫反应；使用树突状细胞表征粪便分离物的体外免疫反应； Caco-2 和树突细胞中细胞因子分泌的测量；和结果的统计阐述。 在该项目中，RU9 将与西班牙巴伦西亚农业与食品技术研究所 (CSIC) 的 Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn 合作（模型 B 中的附件），以确定粪便微生物群的特殊性是否可以在肠道免疫功能障碍。
• RU10。 Lucia Vannini 是 RU10 的领导者。 据 ISI Web of Science 报道，她是 27 篇出版物的作者，总引用次数为 322 次，h 指数为 9。 RU10 在食品微生物学领域和使用仪器技术（尤其是核磁共振）对生物样品进行代谢组分析方面都获得了良好的经验。 在该项目中，RU10 参与：选定食物的代谢组学表征；唾液样本的代谢组学特征；粪便和尿液样本的代谢组学特征，以及结果的统计阐述。 在这个项目中，R10 将与瑞典的瑞典食品和生物技术研究所以及捷克共和国布拉格的化学技术研究所研究与开发部合作，分别涉及某些选定食品的代谢组学特征和生物样本。 使用的级联方法将使每个研究活动和每个 RU 都不可或缺地实现项目的主要目标。

本研究将由以下描述的不同活动 (AI-VI) 组成：

• 活动 I. 人员招募、日志管理、生物样本的处理、制备和储存，以及粪便样本的微生物学分析。
• AI.1。 个人招募和日记管理（RU1、4、6、8）将招募约 50 名杂食者、素食者和纯素食者志愿者，共计 150 名受试者。将在意大利科学协会的合作下招募素食者和纯素食者素食营养。 将通过在大学发布的广告招募杂食者。 将招募约 50 名健康志愿者，包括大约相等数量的杂食者、素食者和严格素食者（年龄 18-59 岁，男女比例约 . 1:1)。 招募的志愿者将被要求签署一份共识文件，记录他们的饮食习惯。 这些日志将被详细阐述以获取有关食品特性的详细信息，从而可以轻松识别市场上的产品并估计摄入的推定微生物负荷。 大学伦理委员会将在项目开始前得到通知。
• AI.2。 生物样品的处理、制备和储存（RU1、4、6、8）。 每个人将每周提供唾液、粪便和尿液样本，持续三周。 在分析之前将合并一式三份样本，以限制个体间的差异。 根据生物样本（唾液、粪便、尿液）和后续分析（例如 DNA、RNA、蛋白质组）的类型，将进行不同的处理。 在招募人员和收集生物样本的同时，大多数 RU 将参与建立技术/方法。
• AI.3。 粪便样本的微生物学分析（RU1、4、6、8）。 首次通过将新鲜粪便材料铺在不同的选择性培养基上来进行活菌计数，以列举最常见的粪便微生物群。
• AI.4。 设置技术/方法（RU1、2、3、5、6、7、8、9、10）。 在招募人员和收集生物样本的同时，大多数 RU 将参与建立技术/方法。 为了建立一个独立的、有竞争力的元组学分析平台，RU3将购置高通量测序设备，这是本项目的主要经济投资。
• 活动二。 食物微生物群和代谢组。 根据饮食日记中的信息，3 种饮食中最具代表性的食物将分为 3 类：(i) 低（TBC，10^3 cfu/g）； (ii) 中间体 (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g)； (iii) 高 (TBC ³ 10^6 cfu/g) 微生物负荷。 对于组 (i) 的食品，将根据文献数据估算微生物数量。 对于组 (ii) 和 (iii) 的食品，如果是市场差异化程度较低的知名产品（例如 Parmigiano Reggiano 奶酪），微生物数量将根据文献数据确定，而对于以下情况，将进行适当的分析市场变化较大的产品（例如马苏里拉奶酪）。 在后一种情况下，分析将涉及市场上的大量产品。 食品的微生物多样性将首先通过 PCR-DGGE（聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）进行更深入的研究，并在需要时根据特定食品微生物群的复杂程度和当前知识进行深度测序。
• AII.1 食品中微生物的定量测定（RU 4、5；7）。 食品分析将在 RU4 和 5 之间共享，一些样品将由两个 RU 进行分析，以相互验证结果。 随后，RU4 将通过 LH-PCR（长度异质性聚合酶链反应）分析对选定的食物进行表征，并将结果与​​ RU7 使用 PCR-DGGE 获得的结果进行比较。 RU5 将从食物中鉴定出大量分离物，旨在寻找与粪便水的抗遗传毒性活性降低和摄入食物中特定微生物存在的可能关系。
• AII.2 食品中的微生物多样性（RU 2、3）。 首先，这项活动将根据日记记录考虑素食主义者和纯素食主义者专门食用的特征不明确的食物。 微生物群和微生物群都将被调查。 酵母和丝状真菌的 PCR-DGGE 分析将基于部分 D1/D2 结构域编码的亚基 LSU 或 rRNA 的 26S 和 ITS（内部转录间隔区）区域的扩增。 16S rRNA 基因的 V3 区域将被靶向检测细菌。 DGGE 分析后，生成的凝胶将被数字化并通过软件 Bionumerics 进行分析。 将对树状图进行聚类分析，以将相似系数为 85% 的样本排除在进一步测序之外；这样的选择将节省下一代测序的成本，并将确保获得可管理数量的数据以通过生物信息学进行分析。 RU3 将使用分类学感兴趣的可变基因的扩增子库并根据将购买的测序平台类型使用特定程序来执行深度测序。 RU2 将在生物信息学基础上详细阐述测序结果。
• AII.3 食物代谢组（RU 10）。 根据有关饮食习惯的信息，将分析三种饮食中最常见的发酵食品，以发现摄入的化合物（例如水杨酸）与生物样品中推测回收的化合物之间可能存在的关系。 代谢组分析将通过 GC-MS/SPME（气相色谱-质谱/固相微萃取）和 FTIR（傅里叶变换红外）光谱法进行。
• 活动三。 粪便和唾液的微生物群。 初步，所有 ca 的所有唾液和粪便样本。 150 名志愿者将接受 PCR-DGGE 分析，以了解微生物多样性的概况。 RT-PCR-DGGE（实时-聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）也将被考虑用于估计粪便中的活菌群。 基于这些分析，每种饮食习惯的代表性样本将进行下一代测序。 所有这些结果的输出应允许逐步为三种饮食中的每一种选择 4/5 的粪便样本进行元组学分析。
• 活动 III.1。 生物多样性研究。
• AIII.1.1。 PCR-DGGE 分析（RU 2、3、8） 酵母和丝状真菌的 PCR-DGGE 分析将针对 26S rRNA 和 ITS 区域，而 16S rRNA 的 V3 和/或 V6-V8 区域将针对细菌进行研究。 DNA 和 RNA（在 RT-PCR 之后）将分别用作研究总种群和活种群的靶标。 在相同的实验条件下，RU3 将表征唾液样本的细菌多样性。 在对 DNA 和 RNA 样本进行 DGGE、图像和聚类分析后，将有可能定义全球人口和活人口之间的差异。 相似性树状图将用于从进一步的测序活动中排除那些具有相似性系数 ³ 85% 的样本；这样的选择将节省下一代测序分析的成本，并将确保获得可管理数量的数据以通过生物信息学进行分析。
• AIII.1.2。 下一代测序（RU 3、8） 将使用具有分类学意义的可变基因的扩增子文库对选定的唾液和粪便样本进行深度测序。 RU2 将在生物信息学基础上详细阐述细菌和真菌的所有测序结果。
• AIII.1.3。 抗生素耐药性 (RU 7) 直接从唾液和粪便样本中提取的 DNA 将使用 PCR 检测法筛选编码对几种抗生素产生耐药性的基因。 样本的抗生素抗性 (AR) 基因呈阳性，将用于分离抗生素抗性乳杆菌、乳球菌和肠球菌。 鉴定后，分离物显示出高于相应断点的最小抑制浓度（MIC）值将通过相应AR基因的PCR扩增来确认。 将位于遗传移动元件上的 AR 基因从分离株转移到临床感兴趣的细菌的可能性将通过结合试验进行评估。
• AIII.2。 选定粪便样本的元组学分析 根据级联方法，粪便样本微生物多样性研究的结果将选择 4/5 个人代表 3 种饮食类型中的每一种（4/5 x 3 = 12/ 15) 进行元组学分析。 元组学方法将提供一个内部数据库，其中包含来自 12/15 个个体的粪便微生物组的 DNA 和 RNA 序列，这将允许对合成蛋白质的完整视图。
• AIII.2.1。 元基因组学 (RU3, 8) 粪便 DNA 将被量化，鸟枪法测序方案将用于元基因组分析。 该任务应由 RU3 执行，具体取决于测序平台的性能和可用性，该平台将全职参与粪便和唾液 DNA 和 cDNA 扩增子的分析。 或者，专业公司将以服务的形式执行此任务。
• AIII.2.2。 元转录组学 (RU 6) 将使用基于 Illumina 的创新元转录组学方法和项目头几个月制定的方案来表征微生物基因的整体表达谱。 cDNA 将根据优化程序从 RNA 合成。 将执行 cDNA 的随机扩增，并使用 Illumina HiSeq 平台对 cDNA 进行测序。 测序的元转录组将使用 Velvet/MetaVelvet 或 SOAPdenovo 包组装在一起，以实现最大可能的共识序列。 转录本序列将使用完善的管道进行注释，并将使用 RPS-BLAST（反向位置特定-基本局部比对搜索工具）针对 KEGG（京都基因和基因组百科全书）、COG（直系同源群簇）和Genbank 数据库。 将针对 COG 数据库进一步搜索由 nr BLASTX 识别的类细菌读数。 序列的功能角色将根据 KEGG 和 COG 搜索进行分配。
• AIII.2.3。 元蛋白质组学 (RU1) 根据活动最初几个月内设计的工作流程，将从每个粪便样本中提取蛋白质，并通过无凝胶和/或基于凝胶的蛋白质组学进行分析。 肽的鉴定将使用质谱仪 Finnigan LCQ Deca XP MAX 进行。 将进行差异蛋白质组学分析。 对于肽鉴定，开放式质谱搜索算法将用于根据可用数据库搜索 MS/MS 谱图。 为了检索更多的功能信息，将对基于 COG 分类的蛋白质进行注释。 已识别的 COG 将映射到 KEGG 代谢途径数据库，并通过 iPath 的在线应用程序进行可视化。 FDR 校正后，将针对 UniProtKB 搜索所有已识别的肽，然后进行映射。 为了解决所有已识别蛋白质的最高功能水平，将在 KEGG 通路上绘制已识别的 COG。 除了共同的微生物核心外，个体间和饮食间的差异也将根据代谢功能来确定。
• 活动四。 功能表征。 对粪便样本和从粪便样本中分离出的微生物的某些功能特征进行表征，将加强饮食与肠道微生物群之间的联系。
• AIV.1 粪便遗传毒性和抗遗传毒性活性 (RU 5) 将制备粪便水 (FW) 样品，并通过彗星试验确定遗传毒性。 HT29 肠细胞（10^6 个细胞/测定）共暴露于 FW 并掺入 LMA 载玻片中，将进行单细胞凝胶电泳 (SCGE) 并通过落射荧光进行分析。 将研究从食物中分离出的几种微生物对肠道中可能存在的遗传毒性和致突变化合物的抑制活性。 将使用 SOS-Chromotest（目标大肠杆菌 PQ37 sfiA:lacZ）评估化合物的残留基因毒性活性，并同时使用 Comet 测定（目标肠细胞 HT29）来测定微生物-基因毒素共孵育的效果).
• AIV.2。 粪便微生物和免疫反应的调节 (RU 9) 树突状细胞 (DC) 和 Caco-2 细胞的生长和分化条件将在活动的头几个月内建立。 将从所有粪便样本中分离出乳酸杆菌和双歧杆菌，并用作辐照细菌来检测肠细胞中免疫介质的表达。 将确定 IL-8 和致耐受性 TGF-β（转化生长因子 β）和 TSLP（胸腺基质淋巴细胞生成素）的转录物和同源蛋白分泌水平。 辐照细菌也将用于刺激 DC 细胞的表面标记。 Caco-2和DC细胞提取总RNA，制备cDNA，观察IL-8、TGF-β、TSLP、TNF-α、IL-12p40、IL-10的相对基因表达；相应基因产物的浓度将通过ELISA（酶联免疫吸附试验）测定。
• ATTIVITY V. 唾液、粪便和尿液代谢组 (RU10)。 为了完成“组学”方法，将使用三种技术（GC-MS/SPME、FTIR/ATR（傅立叶变换红外/衰减全反射）和 NMR（核磁共振））分析粪便、尿液和唾液样本的代谢组学根据之前设置的协议。 将使用质谱数据库以及文献中的质谱数据和/或来自纯化合物的数据来识别化合物。 尿液和唾液样本解冻后，将在 2 小时内进行 NMR 分析。 粪便样品的制备将高度重视水溶性分子的完全回收。 通过 iCoshift 算法校正小峰未对准，NMR 谱将准备用于统计分析。
• 活动六。 结果的统计阐述（所有 RU）。 在项目开发期间，RU2 将与合作伙伴 CBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures，荷兰乌得勒支）合作维护网站，该网站将收集不同研究活动的所有结果。 该数据库将用于“R 模式”分析，以评估各种描述符对确定三种饮食多样性的影响，并以“Q 模式”分析以确定三种饮食之间的差异。 同时，最相关的结果将通过科学出版物传播到同行评审的期刊中。

考虑到所要研究的课题，本项目无疑具有应用潜力方面。 例如，了解饮食对人体微生物群的影响可能会导致制定适当的指南，以便在综合护理推广活动中分发。 消费者偏好、态度、需求、行为、生活方式和教育将得到关注，消费者与食物链研究界之间的沟通将得到加强，以改善知情选择及其对生活质量的影响。 使个人能够通过正确的饮食习惯来改善和管理他们的健康，这将为医疗保健系统节省成本。