Mikrobiota og relateret metabolom i omnivore, vegetarisk eller vegansk kost (MRMOVVD)

Det overordnede formål med dette projekt er at finde sammenhængen mellem kost og spyt og fækal mikrobiota gennem høj-throughput og integrerede meta-omics (genomiske, transkriptomiske, proteomiske og metabolomiske) analyser. Flere spørgsmål diskuteres stadig i denne sammenhæng. For eksempel, hvad er det daglige indtag af mikrober og deres rolle på balancen i tarmmikrobiotaen? Hvordan påvirkes tarmens mikrobiota af hovedtyperne af kost (altædende, vegetarisk og vegansk)? Hvilke er de fremherskende mikrobielle grupper på tarmniveau, afhængigt af typen af ​​diæt? Hvad er det formodede bidrag fra hver mikrobiel gruppe til at opretholde værtens sundhed? Den kvantitative og kvalitative bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fødevarer, afhængigt af kostvaner, svarer på et tidligere spørgsmål og falder sammen med et af formålene med dette projekt. Estimeringen af ​​diversiteten (genomics), funktionel aktivitet (transkriptomics og proteomics) og metabolitter (metabolomics) af især den fækale mikrobiota falder sammen med den holistiske tilgang i dette projekt og svarer på flere af de tidligere spørgsmål. I betragtning af den tætte sammenhæng mellem balancen mellem forskellige mikrobielle populationer i forskellige nicher i den menneskelige krop og opståen af ​​metaboliske patologier, skal dette projekt tilvejebringe ny viden, der kan fremhæve mulige sammenhænge mellem kost og nedbrydning. Kost skal betragtes som det mest passende og billige værktøj til at bestemme en stabil og gunstig oral og intestinal mikrobiota, som forebygger sygdomme og garanterer menneskets levetid. Disse overordnede mål for projektet skal nås på grundlag af specifikke mål, såsom: (i) identifikation af biologiske, molekylære og metaboliske markører, der er specifikke for den type diæt; (ii) estimering af forskellene i mikrobiota og metabolom af spyt og fæces, både blandt individer og mellem typer af kost; iii) estimering af de kvalitative og kvantitative forskelle på det mikrobielle indtag, der er forbundet med diættypen; og (iv) identifikation af de funktionelle træk ved fækale prøver relateret til typen af ​​diæt, som kan betragtes som indikatorer for sygdomsmodtagelighed.

Med det formål at nå det overordnede mål for dette projekt er ti forskningsenheder (RU'er; RU1-10) involveret i forslaget, med partnerskab mellem 16 nationale og især udenlandske institutioner, der dækker 12 forskellige lande. Lederne af hver RUC er rapporteret nedenfor:

• RU1. Marco Gobbetti er hovedefterforsker af forslaget og leder af RU1. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 188 publikationer, som blev citeret 4.075 gange, med et gennemsnit af citater pr. publikation på 21,68 og et h-indeks på 39. Han er for nylig blevet opført i Top Italian Scientists af VIA Academy (årlig evaluering for forskere med en værdi på h-indeks højere end 30). RU1 har opnået en god erfaring med undersøgelse af tarmmikrobiotaen hos cøliakere og om proteomik anvendt på mælkesyrebakterier og fødevarer. RU1 vil spille rollen som koordinator for projektet. Inden for dette projekt er RU1 involveret i: rekruttering af frivillige; administration af dagbøger; håndtering og forberedelse af biologiske prøver; bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fækale prøver ved kulturafhængige metoder; meta-proteomisk karakterisering af udvalgte fækale prøver fra individer med forskellige kostvaner; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU1 samarbejde med Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Spanien, for den specifikke tilskrivning af funktionelle aktiviteter og/eller metaboliske veje til identificerede proteiner og med Department of Mikrobiologi ved University College Cork, Irland, for den bioinformatiske tilgang til proteomstudier.
• RU2. Gianluigi Cardinali er leder af RU2. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 38 publikationer med et h-indeks på 11. RU2 har arbejdet i cirka tyve år inden for biodiversitet og taksonomi af gær, som analyseres gennem mikrobiologiske og molekylære teknikker. Inden for dette projekt er RU2 involveret i: karakterisering af mangfoldigheden af ​​fødevaremikobiota gennem PCR-DGGE tilgang; karakterisering af mikrobiotaen af ​​fækale prøver gennem PCR-DGGE-tilgang; og, som leder, i forvaltningen af ​​den statistiske udarbejdelse af resultaterne fra alle jernbanevirksomheder, tilvejebringelse af en fælles database. RU2 vil samarbejde med Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Holland, om den bioinformatiske udarbejdelse af dataene.
• RU3. Danilo Ercolini er leder af RU3. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 58 publikationer, med et samlet antal citater på 1.354 og et h-indeks på 21. RU3 har i årevis været involveret i studier af mikrobiel økologi i komplekse økosystemer, hovedsageligt fødevareøkosystemer. Fødevaremikrobiotaen er altid blevet undersøgt ved avancerede molekylære tilgange og ved kulturuafhængige metoder, der ikke kræver dyrkning af mikroorganismer på syntetiske medier. Inden for dette projekt er RU3 involveret i: karakterisering af diversiteten af ​​mikrobiotaen i spytprøver; dyb sekventering af udvalgte fødevareprøver; dyb sekventering af udvalgte fækale prøver og spytprøver; meta-genomisk karakterisering af udvalgte fækale prøver fra individer med forskellige kostvaner; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU3 samarbejde med Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) der drives i Argonne National Laboratory, Lemont, USA, for at skabe datasæt, der beskriver mikroorganismer fra en bred vifte af økosystemer.
• RU4. Erasmo Neviani er leder af RU4. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 111 publikationer med et samlet antal citater på 1.508 og et h-indeks på 22. RU4 har opnået god erfaring inden for fødevaremikrobiel økologi til en omfattende og integreret evaluering af de mikrobielle populationer, dynamik og fysiologiske status af celler på forskellige stadier af fødevarefremstilling. Inden for dette projekt er RU4 involveret i: udarbejdelse af dagbøger; rekruttering af frivillige; administration af dagbøger; håndtering og forberedelse af biologiske prøver; bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fækale prøver gennem kulturafhængige metoder; udarbejdelse af resultaterne fra dagbøger; bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fødevarer gennem kulturafhængige og -uafhængige metoder; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU4 samarbejde med Institut for Fødevarevidenskab og Teknologi ved Agricultural University of Athens, Grækenland, om mikrobiel bestemmelse i fødevarer og især i mejeriprodukter, med Epidemiology Unit of Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori fra Milano, Italien, for hjælp til registrering af kostvaner og med National Institute for Food and Nutrition Research i Rom, Italien, for at overvåge de formodede mangler i forbindelse med restriktive kostregimer.
• RU5. Aldo Corsetti er leder af RU5. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 81 publikationer med et samlet antal citater på 2.084 og et h-indeks på 28. RU5 har opnået god erfaring inden for mikrobiel økologi af fødevarer og drikkevarer samt med karakterisering af stammer for bioteknologiske og funktionelle aspekter, for at udvælge starterkulturer til forskellige anvendelser. Inden for dette projekt er RU5 involveret i: bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fødevarer gennem kulturafhængige metoder; identifikation og typebestemmelse af mikrobiel isoleret fra fødevarer; karakterisering af genotoksiciteten af ​​fækale prøver; karakterisering af den anti-genotoksige aktivitet af mikrobielle isolater fra fødevarer; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU5 samarbejde med Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, Canada, om molekylær typning af fødevareisolerede mikroorganismer ved en multi-locus type sekventering.
• RU6. Patrizia Brigidi er leder af RU6. Som rapporteret af ISI Web of Science er hun forfatter til 102 publikationer, der blev citeret 3.158 gange, med et gennemsnit af citater pr. publikation på 32,41 og et h-indeks på 26. RU6 har en konsolideret og bred kompetence inden for identifikation og molekylær kvantificering af bakterier fra komplekse økosystemer (fæces og tarmbiopsier) og inden for molekylære mekanismer, der er ansvarlige for bakteriers sundhedsmæssige fordele. Inden for dette projekt er RU6 involveret i: rekruttering af frivillige; administration af dagbøger; håndtering og forberedelse af biologiske prøver; bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fækale prøver gennem kulturafhængige metoder; meta-transkriptomisk karakterisering af udvalgte fækale prøver fra individer med forskellige kostvaner; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU6 samarbejde med Food Microbial Science Unit, University of Reading, Storbritannien, for udviklingen af ​​den metatranskriptomiske platform og i den bioinformatiske analyse af de opnåede sekvenser for deres tildeling til KEGG og COG klynge af funktionelle aktiviteter.
• RU7. Francesca Clementi er leder af RU7. Som rapporteret af ISI Web of Science er hun forfatter til 59 publikationer, der blev citeret 504 gange, med et gennemsnit af citater pr. publikation på 11,25 og et h-indeks på 15. RU7 har en pålidelig ekspertise vedrørende rolle, overvågning og kontrol af fødevarebårne mikroorganismer, især mælkesyrebakterier. Inden for dette projekt er RU7 involveret i: karakterisering af mangfoldigheden af ​​fødevaremikrobiotaen ved PCR-DGGE; bestemmelse af antibiotikaresistens i fækal- og spytprøver; isolering og identifikation af antibiotikaresistente mælkesyrebakterier fra fækal- og spytprøver; karakterisering af generne involveret i den mikrobielle antibiotikaresistens; undersøgelse af mekanismerne til overførsel af antibiotikaresistens mellem bakterier; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU7 samarbejde med det græske Democritus University of Thrace, Grækenland, og med Rowett Institute for Nutrition and Health ved University of Aberdeen, Skotland, om undersøgelse af overførbare antibiotikaresistensgener i isolerede fødevarer og mælkesyrebakterier. fra spyt og afføringsprøver.
• RU8. Luca Simone Cocolin er leder af RU8. Som rapporteret af Scopus er han forfatter til 131 publikationer, der blev citeret 2.036 gange, hvilket resulterer i et h-indeks på 25. RU 8 har en omfattende erfaring med anvendelse af kulturuafhængige metoder til undersøgelse af mikrobiel biodiversitet og vitalitet i fermenterede fødevarer. Den har også viden om kvantitativ PCR (qPCR) til kvantificering af specifikke mikroorganismer fra komplekse økosystemer. Inden for dette projekt er RU8 involveret i: rekruttering af frivillige; administration af dagbøger; håndtering og forberedelse af biologiske prøver; bestemmelse af de vigtigste mikrobielle grupper i fækale prøver gennem kulturafhængige metoder; profilering af den fækale mikrobiota ved hjælp af DGGE-tilgange anvendt både på DNA- og RNA-niveau; meta-genomisk karakterisering af udvalgte fækale prøver fra individer med forskellige kostvaner; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU8 samarbejde med University of Maribor (UM), Slovenien, og Demokritus University of Thrace (DUT), Alexandroupolis, Grækenland, for aspekter, der beskæftiger sig med interaktionen mellem patogener-værtsceller og for mulige modifikationer af diæt af de forskellige diætgrupper, der bedst kan udnytte den kendte gavnlige rolle for visse mikrobielle grupper, der er forbundet med henholdsvis specifikke fødevarer.
• RU9. Mauro Rossi er leder af RU9. Som rapporteret af ISI Web of Science er han forfatter til 41 publikationer med et samlet antal citater på 1087 og et h-indeks på 19. RU9 har en lang erfaring (>25 år) og stærke samarbejder inden for biokemi og immunologi i tyndtarmen. Inden for dette projekt er RU9 involveret i: isolering af lactobaciller og bifidobakterier fra fækale prøver; karakterisering af in vitro-immunresponset af fækale isolater ved anvendelse af Caco-2-celle; karakterisering af in vitro-immunresponset af fækale isolater ved anvendelse af dendritiske celler; måling af cytokinsekretion i Caco-2 og dendritiske celler; og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil RU9 samarbejde med Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Spanien (vedhæftet fil i model B), for at fastslå, om ejendommeligheder i fækal mikrobiota kan spille en rolle i starten af dysfunktion af tarmens immunforsvar.
• RU10. Lucia Vannini er leder af RU10. Som rapporteret af ISI Web of Science er hun forfatter til 27 publikationer med et samlet antal citater på 322 og et h-indeks på 9. RU10 har opnået en god erfaring både inden for fødevaremikrobiologi og i brugen af ​​instrumentelle teknikker, og især nuklear magnetisk resonans, til metabolomanalyse af biologiske prøver. Inden for dette projekt er RU10 involveret i: metabolomkarakterisering af udvalgte fødevarer; metabolomkarakterisering af spytprøver; metabolomkarakterisering af fækal- og urinprøver og statistisk udarbejdelse af resultaterne. Inden for dette projekt vil R10 samarbejde med det svenske Institut for Fødevare- og Bioteknologi, Sverige, og Instituttet för Kemisk Teknologi, Institut for Forskning og Udvikling, Prag, Tjekkiet, for henholdsvis aspekter vedrørende metabolomisk karakterisering af nogle udvalgte fødevarer og biologiske prøver. Den anvendte kaskadetilgang vil gøre hver forskningsaktivitet og hver enkelt RUC uundværlig for at nå projektets hovedmål.

Denne undersøgelse vil være sammensat af forskellige aktiviteter (AI-VI) beskrevet nedenfor:

• AKTIVITET I. Rekruttering af personer, administration af dagbøger, håndtering, klargøring og opbevaring af biologiske prøver samt mikrobiologiske analyser af fæcesprøver.
• AI.1. Rekruttering af individer og administration af dagbøger (RU1, 4, 6, 8) Omkring 50 omnivore, vegetariske og veganske frivillige, for i alt 150 forsøgspersoner vil blive rekrutteret. Vegetariske og veganske individer vil blive rekrutteret i samarbejde med det italienske videnskabelige selskab af vegetarisk ernæring. Omnivore individer vil blive rekrutteret gennem annoncer offentliggjort på universiteterne. Omkring 50 raske frivillige vil blive rekrutteret, herunder et omtrent lige antal omnivore, vegetarer og veganere (alder 18-59 år, mand/hun-forhold ca. 1:1). Rekrutterede frivillige vil blive bedt om at underskrive et konsensusdokument for at registrere deres kostvaner. Dagbøgerne vil være omfattende for at få detaljerede oplysninger om fødevareegenskaber, hvilket muliggør en nem identifikation af produkterne på markedet og en vurdering af den formodede mikrobielle belastning, der er indtaget. Universiteternes etiske udvalg vil blive informeret, inden projektet starter.
• AI.2. Håndtering, klargøring og opbevaring af biologiske prøver (RU1, 4, 6, 8). Hver enkelt vil levere prøver af spyt, afføring og urin ugentligt i et tidsrum på tre uger. Tredobbelte prøver vil blive samlet før analyser for at begrænse den intra-individuelle variabilitet. Håndteringen vil blive udført forskelligt afhængigt af typen af ​​biologiske prøver (spyt, afføring, urin) og efterfølgende analyser (f.eks. DNA, RNA, proteom). Samtidig med rekruttering af enkeltpersoner og indsamling af biologiske prøver, vil de fleste jernbanevirksomheder være involveret i etableringen af ​​teknikkerne/metoderne.
• AI.3. Mikrobiologiske analyser af fækale prøver (RU1, 4, 6, 8). I den første tid vil de levedygtige tællinger blive udført ved at udplade frisk fækalt materiale på forskellige selektive dyrkningsmedier for at opregne de mest almindelige fækale mikrobielle grupper.
• AI.4. Opsætning af teknikker/metoder (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Samtidig med rekruttering af enkeltpersoner og indsamling af biologiske prøver, vil de fleste jernbanevirksomheder være involveret i etableringen af ​​teknikkerne/metoderne. For at etablere en uafhængig og konkurrencedygtig platform for meta-omics analyser vil RU3 købe udstyr til high throughput sekventering, hvilket er en væsentlig økonomisk investering i dette projekt.
• AKTIVITET II. Fødevaremikrobiota og metabolom. Baseret på oplysningerne fra kostdagbøger vil de mest repræsentative fødevarer af de 3 diæter blive opdelt i 3 kategorier: (i) lav (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) mellemprodukt (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); og (iii) høj (TBC ³ 10^6 cfu/g) mikrobiel belastning. For fødevarer i gruppe (i) vil det mikrobielle antal blive estimeret baseret på litteraturdata. For fødevarer i gruppe (ii) og (iii) vil det mikrobielle antal blive bestemt baseret på litteraturdata i tilfælde af velkendte produkter med lav markedsdifferentiering (f.eks. Parmigiano Reggiano ost), hvorimod passende analyser vil blive udført i tilfælde af produkter med stor markedsvariabilitet (f.eks. mozzarellaost). I sidstnævnte tilfælde vil analyserne involvere et stort antal produkter, der er tilgængelige på markedet. Den mikrobielle mangfoldighed af fødevarer vil blive undersøgt mere i dybden først ved PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel electrophoresis) og efter behov ved dyb sekventering på basis af kompleksitetsniveau og aktuel viden om de specifikke fødevarers mikrobiota.
• AII.1 Kvantitativ bestemmelse af mikroorganismer i fødevarer (RU 4, 5; 7). Analysen af ​​fødevarer vil blive delt mellem RU4 og 5, og nogle prøver vil blive analyseret af begge RU for at gensidigt validere resultaterne. Efterfølgende vil RU4 karakterisere udvalgte fødevarer ved LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) analyse, og resultaterne vil blive sammenlignet med dem opnået af RU7 ved brug af PCR-DGGE. RU5 vil identificere en stor samling af isolater fra fødevarer, med det formål at finde mulige sammenhænge med en reduceret anti-genotoksisk aktivitet af det fækale vand og tilstedeværelsen af ​​specifikke mikroorganismer i de indtagne fødevarer.
• AII.2 Mikrobiel diversitet i fødevarer (RU 2, 3). For det første vil denne aktivitet overveje dårligt karakteriserede fødevarer, der specifikt spises af veregetarianere og veganere baseret på optegnelser fra dagbøger. Både mikro- og mikrobiota vil blive undersøgt. PCR-DGGE-analyser for gær og filamentøse svampe vil være baseret på amplifikation af dele af D1/D2-domænet, der koder for underenheden LSU eller 26S af rRNA'et, og ITS-regionerne (Internal transcribed spacer). V3-regionen af ​​16S rRNA-genet vil blive målrettet til at påvise bakterier. Efter DGGE-analyse vil de resulterende geler blive digitaliseret og analyseret af softwaren Bionumerics. Dendrogrammer vil blive udsat for klyngeanalyse for at udelukke fra den videre sekventering de prøver, der har en lighedskoefficient på 85 %; en sådan udvælgelse vil spare omkostninger til næste generations sekvensering og vil sikre at få en håndterbar mængde data, der skal analyseres via bio-informatik. RU3 vil udføre den dybe sekventering ved hjælp af biblioteker af amplikoner af variable gener af taksonomisk interesse og ved hjælp af specifikke procedurer i henhold til typen af ​​sekventeringsplatform, der vil blive købt. Sekvenseringsresultaterne vil blive udarbejdet på et bioinformatisk grundlag af RU2.
• AII.3 Fødevaremetabolom (RU 10). Baseret på informationen om kostvaner, vil de fermenterede fødevarer, der er mest repræsenteret i de tre diæter, blive analyseret for at finde en mulig sammenhæng mellem kemiske forbindelser indtaget (f.eks. salycilsyre) og formodentlig genfundet i biologiske prøver. Metabolomanalyserne vil blive udført ved GC-MS/SPME (gaskromatografi-massespektrometri/fastfase mikroekstraktion) og FTIR (Fourier Transform Infrared) spektroskopi.
• AKTIVITET III. Mikrobiotaen af ​​afføring og spyt. Foreløbigt er alle spyt- og fæcesprøver fra alle de ca. 150 frivillige vil blive udsat for PCR-DGGE analyser for at få et overblik over den mikrobielle mangfoldighed. RT-PCR-DGGE (Real Time- Polymerase Chain Reaction- Denaturing gradient gel electrophoresis) vil også blive overvejet for at estimere levedygtige populationer i fæces. Baseret på disse analyser vil repræsentative prøver af hver kostvane blive udsat for næste generations sekventering. Outputtet af alle disse resultater skulle muliggøre, trin for trin, udvælgelse af 4/5 fækale prøver for hver af de tre diæter, der skal underkastes meta-omiske analyser.
• AKTIVITET III.1. Undersøgelse af biodiversiteten.
• AIII.1.1. PCR-DGGE profilering (RU 2, 3, 8) PCR-DGGE analyser for gær og trådsvampe vil målrette 26S rRNA og ITS regioner, mens V3 og/eller V6-V8 regioner af 16S rRNA vil blive undersøgt for bakterier. Både DNA og RNA (efter RT-PCR) vil blive brugt som mål til at undersøge henholdsvis totale og levedygtige populationer. Under de samme eksperimentelle forhold vil RU3 karakterisere den bakterielle mangfoldighed af spytprøver. Efter DGGE, billed- og klyngeanalyser fra DNA- og RNA-prøver vil det være muligt at definere en forskel mellem den globale og levedygtige befolkning. Dendrogrammerne af lighed vil blive brugt til at udelukke fra den yderligere sekventeringsaktivitet de prøver, der har en lighedskoefficient ³ 85 %; en sådan udvælgelse vil spare omkostninger til næste generation af sekventeringsanalyser og vil sikre at få en håndterbar mængde data, der skal analyseres via bio-informatik.
• AIII.1.2. Næste generations sekventering (RU 3, 8) Dyb sekventering på udvalgte spyt- og fækale prøver vil blive udført ved brug af biblioteker af amplikoner af variable gener af taksonomisk interesse. Alle sekventeringsresultater opnået både for bakterier og svampe vil blive udarbejdet på bioinformatisk basis af RU2.
• AIII.1.3. Antibiotikaresistens (RU 7) DNA ekstraheret direkte fra spyt- og fækale prøver vil blive screenet for forekomsten af ​​gener, der koder for resistens over for flere antibiotika ved hjælp af PCR-assays. Prøver, der viste sig at være positive for antibiotikaresistens (AR) gener, vil blive brugt til at isolere antibiotika-resistente lactobaciller, lactococci og enterokokker. Efter identifikation vil isolater, der viser værdier af minimum inhiberende koncentration (MIC) højere end de tilsvarende brudpunkter, blive bekræftet ved PCR-amplifikation af de tilsvarende AR-gener. Muligheden for at overføre AR-gener lokaliseret på genetiske mobile elementer fra isolater til bakterier af klinisk interesse vil blive evalueret ved konjugationsforsøg.
• AIII.2. Metaomiske analyser af udvalgte fækale prøver I henhold til kaskadetilgangen vil resultaterne fra undersøgelsen af ​​den mikrobielle mangfoldighed af fækale prøver udvælge 4/5 individer, der er repræsentative for hver af de 3 typer diæt (4/5 x 3 = 12/ 15) at blive udsat for meta-omics analyser. Meta-omics tilgangene vil give en in-house database, bestående af DNA- og RNA-sekvenserne fra de fækale mikrobiomer fra de 12/15 individer, som vil give et komplet overblik over de syntetiserede proteiner.
• AIII.2.1. Meta-genomics (RU3, 8) Fækalt DNA vil blive kvantificeret, og en shotgun-sekventeringsprotokol vil blive anvendt til meta-genomisk analyse. Denne opgave bør udføres af RU3, afhængigt af ydeevne og tilgængelighed af sekventeringsplatformen, som vil være engageret på fuld tid i analyse af DNA- og cDNA-amplikoner af fæces og spyt. Alternativt vil specialiserede virksomheder udføre denne opgave som en service.
• AIII.2.2. Meta-transcriptomics (RU 6) Den overordnede mikrobielle genekspressionsprofil vil blive karakteriseret ved hjælp af en innovativ Illumina-baseret Metatranscriptomic tilgang og den protokol, der er opstillet i løbet af projektets første måneder. cDNA vil blive sintetiseret fra RNA ifølge optimerede procedurer. Tilfældig amplifikation af cDNA'et vil blive udført, og cDNA'et vil blive sekventeret ved hjælp af Illumina HiSeq-platformen. De sekventerede meta-transkriptomer vil blive samlet ved hjælp af Velvet/MetaVelvet eller SOAPdenovo-pakker for at opnå den størst mulige konsensussekvens. Transskriptionssekvenserne vil blive kommenteret ved hjælp af veletablerede pipelines, og transkriptioner vil blive søgt ved hjælp af RPS-BLAST (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) mod KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) og Genbank-databaserne. Bakterie-lignende læsninger identificeret af nr BLASTX vil blive søgt yderligere mod COG-databasen. Sekvensernes funktionelle roller vil blive tildelt baseret på KEGG- og COG-søgningerne.
• AIII.2.3. Meta-proteomics (RU1) Baseret på arbejdsgangen designet inden for de første måneders aktivitet, vil proteiner blive ekstraheret fra hver fækal prøve og analyseret ved gel-fri og/eller gel-baseret proteomics. Identifikationen af ​​peptider vil blive udført ved hjælp af massespektrometeret Finnigan LCQ Deca XP MAX. Differentiel proteomisk analyse vil blive udført. Til peptididentifikation vil Open Mass Spectra Search Algorithm blive brugt til at søge MS/MS-spektre mod de tilgængelige databaser. For at hente yderligere funktionel information vil proteinerne baseret på COG-klassificering blive kommenteret. De identificerede COG'er vil blive kortlagt på KEGG metaboliske pathways-database og visualiseret ved online-applikationen af ​​iPath. Efter FDR-korrektion vil alle identificerede peptider blive søgt mod UniProtKB og derefter kortlagt. For at adressere det højeste funktionelle niveau af alle de identificerede proteiner, vil de identificerede COG'er på KEGG-veje blive kortlagt. Udover den fælles mikrobielle kerne, vil inter-individuelle og inter-diæt forskelle blive bestemt med hensyn til metabolisk funktion.
• AKTIVITET IV. Funktionel karakterisering. Karakteriseringen af ​​nogle funktionelle træk ved fækale prøver og af mikrobielle isolater fra fækale prøver vil styrke forbindelsen mellem diæt og tarmmikrobiota.
• AIV.1 Fækale genotoksiske og anti-gentoksiske aktiviteter (RU 5) Prøver af fækalt vand (FW) vil blive forberedt, og genotoksiciteten vil blive bestemt ved Comet assay. HT29-enterocytterne (10^6 celler/assay) co-eksponeret for FW og inkorporeret i LMA-objektglas vil blive udsat for Single-Cell Gel-Electrophoresis (SCGE) og analyseret ved epifluorescens. Flere mikrobielle isolater fra fødevarer vil blive undersøgt for den hæmmende aktivitet over for genotoksiske og mutagene forbindelser, som potentielt er til stede i tarmen. Effekten af ​​mikroorganisme-genotoksin co-inkubationen vil blive analyseret gennem evaluering af den resterende genotoksiske aktivitet af forbindelserne ved hjælp af SOS-Chromotest (target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) og parallelt Comet assay (target enterocytes HT29) ).
• AIV.2. Fækale mikroorganismer og modulering af immunrespons (RU 9) Betingelserne for vækst og differentiering af dendritiske celler (DC) og Caco-2 celler vil blive opstillet inden for de første måneders aktivitet. Lactobaciller og bifidobakterier vil blive isoleret fra alle fækale prøver og brugt som bestrålede bakterier til at påvise ekspressionen af ​​immunmediatorer i enterocytter. Transskription og beslægtede proteinsekretionsniveauer af IL-8 og tolerogen TGF-beta (Transforming growth factor beta) og TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin) vil blive bestemt. Bestrålede bakterier vil også blive brugt til at stimulere overflademarkører i DC-celler. Total RNA vil blive ekstraheret fra Caco-2 og DC cellerne, og cDNA vil blive forberedt til at se på den relative genekspression af IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alpha, IL-12p40 og IL-10; koncentrationen af ​​de tilsvarende genprodukter vil blive bestemt ved ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITET V. Spyt-, fækal- og urinmetabolom (RU10). For at fuldende "omics"-tilgangen vil metabolomet af prøver af fæces, urin og spyt blive analyseret med tre teknikker (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) og NMR (Nuclear Magnetic Resonance) i henhold til de tidligere opstillede protokoller. Kemiske forbindelser vil blive identificeret ved hjælp af massespektradatabaser samt massespektradata i litteraturen og/eller data fra rene kemiske forbindelser. Efter optøning af urin- og spytprøver vil NMR-analysen blive udført inden for 2 timer. Fækale prøver vil blive forberedt, hvilket giver størst mulig betydning for fuldstændig genvinding af vandopløselige molekyler. NMR-spektrene vil blive forberedt til statistisk analyse ved at korrigere de små peak-fejljusteringer gennem iCoshift-algoritmen.
• ATTIVITET VI. Statistisk udarbejdelse af resultaterne (alle jernbanevirksomheder). Under projektudviklingen vil RU2 tage sig af vedligeholdelsen af ​​hjemmesiden i samarbejde med partneren CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), siden vil indsamle alle resultater fra de forskellige forskningsaktiviteter. Denne database vil blive brugt til analyse i "R-tilstand" for at vurdere virkningen af ​​forskellige deskriptorer for at bestemme mangfoldigheden af ​​de tre diæter, og i "Q-tilstand" til at bestemme forskellen mellem de tre diæter. Samtidig vil de mest relevante resultater blive formidlet gennem videnskabelige publikationer til peer-reviewede tidsskrifter.

Under hensyntagen til det emne, der skal undersøges, har dette projekt utvivlsomt anvendt potentielle aspekter. For eksempel kunne viden om kostens effekt på menneskelig mikrobiota resultere i udarbejdelse af passende retningslinjer, der skal distribueres i kampagner for integreret plejefremme. Forbrugernes præferencer, holdninger, behov, adfærd, livsstil og uddannelse vil blive taget hånd om, og kommunikationen mellem forbrugere og fødevarekædeforskningssamfundet vil blive forbedret for at forbedre informerede valg og dets indvirkning på livskvaliteten. Bemyndigelse af enkeltpersoner til at forbedre og styre deres sundhed gennem korrekte kostvaner vil resultere i omkostningsbesparelser for sundhedssystemerne.