Mikrobióta és kapcsolódó anyagcsere mindenevő, vegetáriánus vagy vegán étrendben (MRMOVVD)

A projekt átfogó célja az étrend és a nyál, valamint a széklet mikrobiota közötti kapcsolat feltárása nagy áteresztőképességű és integrált meta-omika (genomikus, transzkriptomikai, proteomikai és metabolomikus) elemzések révén. Ebben az összefüggésben még számos kérdés vitatott. Például mennyi a mikrobák napi bevitele és szerepük a bélmikrobióta egyensúlyában? Hogyan befolyásolják a bél mikrobiotáját a főbb étrendtípusok (mindenevő, vegetáriánus és vegán)? Melyek az uralkodó mikrobacsoportok a bélrendszerben, az étrend típusától függően? Mi az egyes mikrobacsoportok feltételezett hozzájárulása a gazdaszervezet egészségének megőrzéséhez? Az élelmiszerekben található főbb mikrobiális csoportok mennyiségi és minőségi meghatározása az étkezési szokásoktól függően egy korábbi kérdésre ad választ, és egybeesik jelen projekt egyik célkitűzésével. A bélsár mikrobiota diverzitásának (genomika), funkcionális aktivitásának (transzkriptomika és proteomika) és metabolitjainak (metabolomika) becslése egybeesik a projekt holisztikus megközelítésével, és több korábbi kérdésre is választ ad. Figyelembe véve a szoros összefüggést az emberi test különböző réseiben lévő különböző mikrobapopulációk egyensúlya és az anyagcsere-patológiák kialakulása között, ez a projekt olyan új ismereteket nyújt, amelyek rávilágíthatnak az étrend és az anyagcserezavarok lehetséges összefüggéseire. A diétát a legmegfelelőbb és legolcsóbb eszköznek kell tekinteni a stabil és kedvező száj- és bélmikrobióta meghatározására, amely megelőzi a betegségeket és garantálja az emberi élettartamot. A projekt ezen átfogó célkitűzéseit konkrét célok alapján kell elérni, mint például: i. az étrend típusára jellemző biológiai, molekuláris és metabolikus markerek azonosítása; ii. a nyál és a széklet mikrobiotájában és metabolómájában mutatkozó különbségek becslése, mind az egyének, mind az étrendtípusok között; (iii) az étrend típusához kapcsolódó mikrobabevitel minőségi és mennyiségi különbségeinek becslése; és (iv) a székletminták étrendi típusához kapcsolódó funkcionális jellemzőinek azonosítása, amelyek a betegségre való hajlam indikátorainak tekinthetők.

A projekt általános célkitűzésének elérése érdekében tíz kutatási egység (RU1-10) vesz részt a pályázatban, 16 nemzeti és különösen külföldi intézmény partnerségével, 12 különböző országot lefedve. Az alábbiakban közöljük az egyes VT vezetőit:

• RU1. Marco Gobbetti a javaslat fő vizsgálója és az RU1 vezetője. Amint az ISI Web of Science beszámolt róla, 188 publikáció szerzője, amelyeket 4075-ször idéztek, publikációnkénti idézetek átlaga 21,68, h indexe pedig 39. Nemrég felkerült a VIA Akadémia Top Italian Scientists listájára (éves értékelés a 30-nál magasabb h-index értékkel rendelkező tudósok számára). Az RU1 jó tapasztalatot szerzett a cöliákiák bélmikrobiótájának vizsgálatában, valamint a tejsavbaktériumokban és élelmiszerekben alkalmazott proteomikában. Az RU1 fogja betölteni a projekt koordinátorának szerepét. A projekten belül a RU1 a következőkben vesz részt: önkéntesek toborzása; naplók adminisztrációja; biológiai minták kezelése, előkészítése; a székletminták fő mikrobiális csoportjainak meghatározása tenyészetfüggő módszerekkel; eltérő táplálkozási szokásokkal rendelkező egyénekből származó kiválasztott székletminták metaproteomikai jellemzése; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekt keretében az RU1 együttműködik az Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon-nal, CIAL (CSIC – UAM), Madrid, Spanyolország, a funkcionális tevékenységek és/vagy metabolikus útvonalak azonosított fehérjékhez való specifikus hozzárendelése érdekében, valamint a Tanszékkel. Az írországi University College Cork mikrobiológiája a proteomvizsgálatok bioinformatikai megközelítéséhez.
• RU2. Gianluigi Cardinali az RU2 vezetője. Az ISI Web of Science jelentése szerint 38 publikáció szerzője 11-es h indexszel. Az RU2 mintegy húsz éve működik az élesztőgombák biodiverzitása és taxonómiája területén, amelyeket mikrobiológiai és molekuláris technikákkal elemeznek. A projekt keretében az RU2 a következőkben vesz részt: az élelmiszer-mikrobióta diverzitásának jellemzése PCR-DGGE megközelítéssel; székletminták mikroobiótájának jellemzése PCR-DGGE megközelítéssel; valamint vezetőként az összes VT-től származó eredmények statisztikai kidolgozásának irányításában, közös adatbázist biztosítva. Az RU2 együttműködik a Centraalbureau voor Schimmelcultures-szel (CBS, Utrecht, Hollandia) az adatok bioinformatikai kidolgozásában.
• RU3. Danilo Ercolini az RU3 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 58 publikáció szerzője, összesen 1354 hivatkozási számmal és 21 h indexszel. Az RU3 már évek óta részt vesz az összetett ökoszisztémák, elsősorban élelmiszer-ökoszisztémák mikrobiális ökológiájának vizsgálatában. Az élelmiszer-mikrobiótát mindig fejlett molekuláris megközelítésekkel és olyan tenyészettől független módszerekkel tanulmányozták, amelyek nem igényelnek mikroorganizmusok szintetikus táptalajon történő tenyésztését. A projekt keretében az RU3 a következőkben vesz részt: a nyálminták mikrobiota diverzitásának jellemzése; kiválasztott élelmiszerminták mély szekvenálása; kiválasztott széklet- és nyálminták mély szekvenálása; eltérő táplálkozási szokásokkal rendelkező egyénekből származó kiválasztott székletminták metagenomikai jellemzése; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekt keretében az RU3 együttműködik az Earth Microbiome Projecttel (EMP, www.earthmicrobiome.org) amelyet az Argonne National Laboratoryban (Lemont, Egyesült Államok) futtatnak, hogy olyan adatkészleteket hozzanak létre, amelyek leírják az ökoszisztémák széles skálájából származó mikroorganizmusokat.
• RU4. Erasmo Neviani az RU4 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 111 publikáció szerzője, összesen 1508 hivatkozási szám és 22 h index. Az RU4 jó tapasztalatokra tett szert az élelmiszer-mikrobiális ökológiában a mikrobapopulációk, a sejtek dinamikájának és fiziológiai állapotának átfogó és integrált értékeléséhez az élelmiszergyártás különböző szakaszaiban. A projekten belül az RU4 a következőkben vesz részt: naplók készítése; önkéntesek toborzása; naplók adminisztrációja; biológiai minták kezelése, előkészítése; a székletminták fő mikrobiális csoportjainak meghatározása tenyészetfüggő módszerekkel; naplók eredményeinek feldolgozása; a főbb mikrobacsoportok meghatározása az élelmiszerekben tenyészetfüggő és -független módszerekkel; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekt keretében az RU4 együttműködik a görögországi Athéni Mezőgazdasági Egyetem Élelmiszertudományi és Technológiai Tanszékével az élelmiszerekben és különösen a tejtermékekben található mikrobameghatározás érdekében a Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei epidemiológiai osztályával. A milánói Tumorinak (Olaszország) az étkezési szokások rögzítésében nyújtott segítségért, valamint a római Nemzeti Élelmiszer- és Táplálkozáskutató Intézetnek (Olaszország) a korlátozó étrendekkel kapcsolatos feltételezett hiányosságok nyomon követéséért.
• RU5. Aldo Corsetti az RU5 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 81 publikáció szerzője, összesen 2084 hivatkozási számmal és 28 h indexszel. Az RU5 jó tapasztalatokra tett szert az élelmiszerek és italok mikrobiális ökológiája, valamint a törzsek biotechnológiai és funkcionális szempontú jellemzése terén, abból a célból, hogy starter kultúrákat válasszon különböző alkalmazásokhoz. A projekt keretében az RU5 a következőkben vesz részt: a főbb mikrobiális csoportok meghatározása élelmiszerekben tenyészetfüggő módszerekkel; élelmiszerekből izolált mikrobák azonosítása és tipizálása; székletminták genotoxicitásának jellemzése; élelmiszerekből származó mikrobiális izolátumok antigenotoxigén aktivitásának jellemzése; és az eredmények statisztikai feldolgozása. Ennek a projektnek a keretében az RU5 együttműködik a kanadai Albertai Egyetem Mezőgazdasági, Élelmiszer- és Táplálkozástudományi Tanszékével az élelmiszer-izolált mikroorganizmusok molekuláris tipizálása érdekében több lókuszos típusú szekvenálás segítségével.
• RU6. Patrizia Brigidi az RU6 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 102 publikáció szerzője, amelyeket 3158-szor idéztek, publikációnkénti idézetek átlaga 32,41, h indexe pedig 26. Az RU6 konszolidált és széleskörű kompetenciával rendelkezik a komplex ökoszisztémákból származó baktériumok azonosítása és molekuláris mennyiségi meghatározása (széklet és bélbiopszia), valamint a baktériumok egészségügyi előnyeiért felelős molekuláris mechanizmusok területén. A projekten belül az RU6 a következőkben vesz részt: önkéntesek toborzása; naplók adminisztrációja; biológiai minták kezelése, előkészítése; a székletminták fő mikrobiális csoportjainak meghatározása tenyészetfüggő módszerekkel; különböző táplálkozási szokásokkal rendelkező egyének kiválasztott székletmintáinak meta-transzkriptomikai jellemzése; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekt keretein belül az RU6 együttműködik a Readingi Egyetem Élelmiszer-mikrobiális Tudományi Egységgel (Egyesült Királyság), a metatranszkriptomikus platform kifejlesztésében és a kapott szekvenciák bioinformatikai elemzésében a funkcionális tevékenységek KEGG és COG klaszteréhez való hozzárendelésük érdekében.
• RU7. Francesca Clementi az RU7 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 59 publikáció szerzője, amelyeket 504-szer idéztek, publikációnkénti idézetek átlaga 11,25, h indexe pedig 15. Az RU7 megbízható szakértelemmel rendelkezik az élelmiszer-eredetű mikroorganizmusok, különösen a tejsavbaktériumok szerepe, monitorozása és ellenőrzése terén. A projekt keretében az RU7 a következőkben vesz részt: az élelmiszer-mikrobióta diverzitásának jellemzése PCR-DGGE-vel; az antibiotikum rezisztencia meghatározása széklet- és nyálmintákban; antibiotikum-rezisztens tejsavbaktériumok izolálása és azonosítása széklet- és nyálmintákból; a mikrobiális antibiotikum-rezisztenciában szerepet játszó gének jellemzése; az antibiotikum-rezisztencia baktériumok közötti átvitelének mechanizmusainak tanulmányozása; és az eredmények statisztikai feldolgozása. Ennek a projektnek a keretében az RU7 együttműködik a görögországi Trákiai Görög Demokritus Egyetemmel és a skóciai Aberdeeni Egyetem Rowett Táplálkozási és Egészségügyi Intézetével élelmiszerekben és izolált tejsavbaktériumokban előforduló átvihető antibiotikum-rezisztencia gének vizsgálatában. nyál- és székletmintákból.
• RU8. Luca Simone Cocolin az RU8 vezetője. A Scopus jelentése szerint 131 publikáció szerzője, amelyeket 2036-szor idéztek, így a h index 25. Az RU 8 kiterjedt tapasztalattal rendelkezik a fermentált élelmiszerek mikrobiológiai sokféleségének és vitalitásának tanulmányozására szolgáló kultúrától független módszerek alkalmazásában. A komplex ökoszisztémákból származó specifikus mikroorganizmusok mennyiségi meghatározásához is ismeri a kvantitatív PCR-t (qPCR). A projekten belül az RU8 a következőkben vesz részt: önkéntesek toborzása; naplók adminisztrációja; biológiai minták kezelése, előkészítése; a székletminták fő mikrobiális csoportjainak meghatározása tenyészetfüggő módszerekkel; a széklet mikrobiota profilozása DGGE módszerekkel, mind DNS, mind RNS szinten; eltérő táplálkozási szokásokkal rendelkező egyénekből származó kiválasztott székletminták metagenomikus jellemzése; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekt keretében az RU8 együttműködik a szlovéniai Maribori Egyetemmel (UM) és a Trákiai Demokritus Egyetemmel (DUT), Alexandroupolis (Görögország) a kórokozók és a gazdasejtek közötti kölcsönhatásokkal és a sejtek lehetséges módosításaival foglalkozó szempontok tekintetében. a különböző étrendi csoportok étrendje, amely a legjobban ki tudja aknázni bizonyos mikrobiális csoportok bizonyos élelmiszerekhez kapcsolódó, ismert jótékony szerepét, ill.
• RU9. Mauro Rossi az RU9 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 41 publikáció szerzője, összesen 1087 hivatkozással és 19 h indexszel. Az RU9 hosszú távú tapasztalattal (>25 év) és szoros együttműködéssel rendelkezik a vékonybél biokémiája és immunológiája területén. A projekt keretében az RU9 a következőkben vesz részt: laktobacillusok és bifidobaktériumok izolálása székletmintákból; széklet izolátumok in vitro immunválaszának jellemzése Caco-2 sejt felhasználásával; széklet izolátumok in vitro immunválaszának jellemzése dendritikus sejtek felhasználásával; citokin szekréció mérése Caco-2 és dendritikus sejtekben; és az eredmények statisztikai feldolgozása. A projekten belül az RU9 együttműködik az Ecofisiología Microbiana y Nutriciònnal, az Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos-nal (CSIC), Valencia, Spanyolország (melléklet a B modellben), hogy megállapítsa, vajon a széklet mikrobiota sajátosságai szerepet játszhatnak-e a betegség kialakulásában. bélrendszeri immunrendszeri zavarok.
• RU10. Lucia Vannini az RU10 vezetője. Amint arról az ISI Web of Science beszámolt, 27 publikáció szerzője, összesen 322 hivatkozási számmal és 9 h indexszel. Az RU10 jó tapasztalatokat szerzett mind az élelmiszer-mikrobiológia területén, mind a műszeres technikák, különösen a mágneses magrezonancia alkalmazásában, biológiai minták metabolomelemzésére. A projekten belül az RU10 a következőkben vesz részt: kiválasztott élelmiszerek metabolom jellemzése; nyálminták metabolom jellemzése; széklet- és vizeletminták metabolom jellemzése és az eredmények statisztikai feldolgozása. Ennek a projektnek a keretében az R10 együttműködik a Svéd Élelmiszer- és Biotechnológiai Intézettel (Svédország) és a Kémiai Technológiai Intézettel, a Prága, Cseh Köztársaság Kutatási és Fejlesztési Osztályával, egyes kiválasztott élelmiszerek metabolomikus jellemzésére vonatkozó szempontok tekintetében. biológiai minták. Az alkalmazott lépcsőzetes megközelítés minden kutatási tevékenységet és VT-t nélkülözhetetlenné tesz a projekt fő célkitűzéseinek eléréséhez.

Ez a tanulmány az alábbiakban ismertetett különböző tevékenységekből (AI-VI) fog állni:

• TEVÉKENYSÉG I. Személyek toborzása, naplók vezetése, biológiai minták kezelése, előkészítése, tárolása, székletminták mikrobiológiai elemzése.
• AI.1. Személyek toborzása és naplók adminisztrációja (RU1, 4, 6, 8) Körülbelül 50 mindenevő, vegetáriánus és vegán önkéntest toboroznak, összesen 150 alanyból. Vegetáriánus és vegán személyek toborzása az Olasz Tudományos Társaság közreműködésével történik. a vegetáriánus táplálkozásról. Mindenevő egyéneket az egyetemeken közzétett hirdetéseken keresztül toboroznak. Körülbelül 50 egészséges önkéntest vesznek fel, köztük körülbelül azonos számú mindenevőt, vegetáriánust és vegánt (18-59 év közötti, férfi/nő arány kb. 1:1). A felvett önkénteseket felkérik, hogy írjanak alá egy konszenzusos dokumentumot, rögzítsék étkezési szokásaikat. A naplókat úgy készítik el, hogy részletes információkat kapjanak az élelmiszerek jellemzőiről, lehetővé téve a piacon lévő termékek egyszerű azonosítását és a feltételezett mikrobiális terhelés becslését. Az egyetemek etikai bizottságát a projekt megkezdése előtt tájékoztatják.
• AI.2. Biológiai minták kezelése, előkészítése és tárolása (RU1, 4, 6, 8). Minden egyén hetente nyál-, széklet- és vizeletmintát ad, három hétig. Az egyeden belüli változékonyság korlátozása érdekében az elemzések előtt három párhuzamos mintát egyesítenek. A kezelést a biológiai minták (nyál, ürülék, vizelet) és az azt követő elemzések (pl. DNS, RNS, proteom) típusától függően eltérően hajtják végre. Az egyének toborzásával és a biológiai minták gyűjtésével egyidejűleg a legtöbb VT részt vesz a technikák/módszerek kidolgozásában.
• AI.3. Székletminták mikrobiológiai vizsgálata (RU1, 4, 6, 8). Az első alkalommal az életképes számlálást friss székletanyag különböző szelektív táptalajokra szélesztésével végezzük, hogy felsoroljuk a leggyakoribb széklet mikrobiális csoportokat.
• AI.4. A technikák/módszerek felállítása (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Az egyének toborzásával és a biológiai minták gyűjtésével egyidejűleg a legtöbb VT részt vesz a technikák/módszerek kidolgozásában. Annak érdekében, hogy független és versenyképes platformot hozzon létre a meta-omikai elemzésekhez, az RU3 nagy áteresztőképességű szekvenálási berendezéseket vásárol, ami a projekt fő gazdasági befektetése.
• TEVÉKENYSÉG II. Élelmiszer-mikrobióta és anyagcsere. Az étrendi naplókból származó információk alapján a 3 diéta közül a legreprezentatívabb élelmiszereket 3 kategóriába soroljuk: (i) alacsony (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) intermedier (TBC 10^3-10^6 cfu/g); és (iii) magas (TBC³ 10^6 cfu/g) mikrobiális terhelés. Az (i) csoportba tartozó élelmiszerek esetében a mikrobiális számot az irodalmi adatok alapján kell megbecsülni. A (ii) és (iii) csoportba tartozó élelmiszerek esetében a mikrobiális szám meghatározása a jól ismert, alacsony piaci differenciáltságú termékek (pl. Parmigiano Reggiano sajt) esetében szakirodalmi adatok alapján történik, míg a megfelelő elemzések elvégzése nagy piaci variabilitású termékek (pl. Mozzarella sajt). Ez utóbbi esetben az elemzések nagyszámú, a piacon elérhető termékre vonatkoznak. Az élelmiszerek mikrobiális diverzitását először PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel elektroforézis), majd szükség esetén mélyreható szekvenálás segítségével tanulmányozzuk az adott élelmiszerek összetettségi szintje és a mikrobióta jelenlegi ismerete alapján.
• AII.1 Mikroorganizmusok mennyiségi meghatározása élelmiszerekben (RU 4, 5; 7). Az élelmiszerek elemzését megosztják az RU4 és 5 között, és egyes mintákat mindkét VT elemezni fog az eredmények kölcsönös érvényesítése érdekében. Ezt követően az RU4 jellemezni fogja a kiválasztott élelmiszereket LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) analízissel, és az eredményeket összehasonlítják az RU7 által PCR-DGGE alkalmazásával kapott eredményekkel. Az RU5 az élelmiszerekből származó izolátumok nagy gyűjteményét fogja azonosítani, hogy lehetséges összefüggéseket találjon a székletvizek csökkent antigenotoxikus aktivitásával és specifikus mikroorganizmusok jelenlétével az elfogyasztott élelmiszerekben.
• AII.2 Mikrobák sokfélesége az élelmiszerekben (RU 2, 3). Először is, ez a tevékenység olyan rosszul jellemezhető ételeket vesz figyelembe, amelyeket kifejezetten a vegetáriánusok és a vegánok fogyasztanak a naplókból származó feljegyzések alapján. Mind a mikro-, mind a mikro-biótát vizsgálni fogják. Az élesztőkre és fonalas gombákra vonatkozó PCR-DGGE elemzések az rRNS LSU vagy 26S alegységét kódoló D1/D2 domén részeinek és az ITS (Internal transscribed spacer) régióknak az amplifikációján alapulnak. A 16S rRNS gén V3 régióját célozzák meg a baktériumok kimutatására. A DGGE elemzése után a kapott géleket a Bionumerics szoftver digitalizálja és elemzi. A dendrogramokat klaszteranalízisnek vetik alá, hogy kizárják a további szekvenálásból azokat a mintákat, amelyek hasonlósági együtthatója 85%. Ez a kiválasztás költséget takarít meg a következő generációs szekvenálás során, és biztosítja, hogy kezelhető mennyiségű adatot kapjunk bioinformatikán keresztül. Az RU3 a mély szekvenálást a taxonómiai érdeklődésre számot tartó variábilis gének amplikonjainak könyvtáraival, valamint a megvásárolni kívánt szekvenálási platform típusának megfelelő specifikus eljárások alkalmazásával végzi el. A szekvenálás eredményeit a RU2 bioinformatikai alapon dolgozza ki.
• AII.3 Élelmiszer-anyagcsere (RU 10). Az étkezési szokásokra vonatkozó információk alapján a három diétában leggyakrabban előforduló fermentált élelmiszereket elemzik, hogy megtalálják a lehetséges összefüggést a lenyelt kémiai vegyületek (pl. szalicilsav) és a biológiai mintákból feltételezhetően visszanyert kémiai vegyületek között. A metabolomelemzéseket GC-MS/SPME (gázkromatográfiás tömegspektrometria/szilárdfázisú mikroextrakció) és FTIR (Fourier Transform Infrared) spektroszkópiával végezzük.
• TEVÉKENYSÉG III. A széklet és a nyál mikrobiotája. Előzetesen minden nyál- és székletmintát minden kb. 150 önkéntest PCR-DGGE elemzésnek vetnek alá, hogy áttekintést kapjanak a mikrobiális sokféleségről. Az RT-PCR-DGGE (valós idejű polimeráz láncreakció - denaturáló gradiens gélelektroforézis) módszert is figyelembe kell venni a széklet életképes populációinak becsléséhez. Ezen elemzések alapján az egyes táplálkozási szokások reprezentatív mintáit a következő generációs szekvenálásnak vetik alá. Mindezen eredményeknek lehetővé kell tenniük lépésről lépésre 4/5 székletminta kiválasztását mindhárom diéta esetében, amelyeket meta-omikai elemzésnek kell alávetni.
• TEVÉKENYSÉG III.1. A biodiverzitás tanulmányozása.
• AIII.1.1. PCR-DGGE profilalkotás (RU 2, 3, 8) Az élesztőkre és fonalas gombákra vonatkozó PCR-DGGE elemzések a 26S rRNS és ITS régiókat célozzák meg, míg a 16S rRNS V3 és/vagy V6-V8 régióit baktériumokra vizsgálják. Mind a DNS-t, mind az RNS-t (RT-PCR után) célpontként fogják használni a teljes, illetve az életképes populációk vizsgálatához. Ugyanezen kísérleti körülmények között az RU3 jellemezni fogja a nyálminták bakteriális diverzitását. A DGGE, a DNS- és RNS-minták kép- és klaszteranalízise után lehetővé válik a globális és az életképes populáció közötti különbség meghatározása. A hasonlóság dendrogramjait arra használjuk, hogy kizárjuk a további szekvenálási tevékenységből azokat a mintákat, amelyek hasonlósági együtthatója ³ 85 %; Ez a kiválasztás költséget takarít meg a következő generációs szekvenálási elemzések során, és biztosítja, hogy kezelhető mennyiségű adatot kapjunk bioinformatikán keresztül.
• AIII.1.2. Következő generációs szekvenálás (RU 3, 8) A kiválasztott nyál- és székletminták mély szekvenálását a taxonómiai érdeklődésre számot tartó variábilis gének amplikonjainak könyvtáraival végzik. A baktériumok és gombák esetében kapott összes szekvenálási eredményt az RU2 bioinformatikai alapon dolgozza ki.
• AIII.1.3. Antibiotikum-rezisztencia (RU 7) A nyál- és székletmintákból közvetlenül kivont DNS-t PCR-vizsgálatok segítségével szűrik a több antibiotikummal szembeni rezisztenciát kódoló gének előfordulására. Az antibiotikum-rezisztencia (AR) génekre pozitívnak bizonyult mintákat az antibiotikum-rezisztens laktobacillusok, lactococcusok és enterococcusok izolálására fogják használni. Az azonosítás után a megfelelő töréspontoknál magasabb minimális gátló koncentrációt (MIC) mutató izolátumokat a megfelelő AR gének PCR-amplifikációjával igazoljuk. A genetikai mobil elemeken lokalizált AR gének izolátumokból a klinikai érdeklődésre számot tartó baktériumokba való átvitelének lehetőségét konjugációs kísérletekkel fogják értékelni.
• AIII.2. Kiválasztott székletminták meta-omikai analízise A kaszkádos megközelítés szerint a székletminták mikrobiális diverzitásának vizsgálatából származó eredmények 4/5 egyedt választanak ki a 3 diétatípus mindegyikére (4/5 x 3 = 12/ 15) meta-omikai elemzéseknek kell alávetni. A meta-omikai megközelítések egy házon belüli adatbázist biztosítanak, amely a 12/15 egyed széklet mikrobiómáiból származó DNS- és RNS-szekvenciákat tartalmazza, amely lehetővé teszi a szintetizált fehérjék teljes áttekintését.
• AIII.2.1. Metagenomika (RU3, 8) A széklet DNS-t mennyiségileg meghatározzák, és egy shotgun szekvenálási protokollt alkalmaznak a metagenomikai elemzéshez. Ezt a feladatot az RU3-nak kell elvégeznie, a szekvenáló platform teljesítményétől és elérhetőségétől függően, amely teljes munkaidőben részt vesz a széklet és a nyál DNS- és cDNS-amplikonjainak elemzésében. Alternatív megoldásként erre szakosodott cégek szolgáltatásként látják el ezt a feladatot.
• AIII.2.2. Meta-transzkriptomika (RU 6) A teljes mikrobiális génexpressziós profilt egy innovatív Illumina-alapú metatranszkriptomikus megközelítés és a projekt első hónapjaiban felállított protokoll segítségével jellemezzük. A cDNS-t szintetizálják az RNS-ből az optimalizált eljárások szerint. A cDNS véletlenszerű amplifikációját hajtják végre, és a cDNS-t az Illumina HiSeq platform segítségével szekvenálják. A szekvenált meta-transzkriptomokat Velvet/MetaVelvet vagy SOAPdenovo csomagok segítségével állítják össze a lehető legnagyobb konszenzusos szekvencia elérése érdekében. Az átiratok szekvenciáit jól bevált csővezetékek segítségével annotáljuk, és az átiratokat az RPS-BLAST (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) segítségével keresik a KEGG (Kiotói Gének és Genomok Enciklopédia), COG (Clusters of Orthologous Groups) és a Genbank adatbázisok. A nr BLASTX által azonosított baktériumszerű leolvasásokat tovább keresik a COG adatbázisban. A szekvenciák funkcionális szerepei a KEGG és COG keresések alapján kerülnek kiosztásra.
• AIII.2.3. Metaproteomika (RU1) A tevékenység első hónapjaiban megtervezett munkafolyamat alapján minden székletmintából fehérjéket vonnak ki, és gélmentes és/vagy gél alapú proteomikával elemzik. A peptidek azonosítása a Finnigan LCQ Deca XP MAX tömegspektrométerrel történik. Differenciálproteomikai analízist végeznek. A peptidek azonosításához az Open Mass Spectra Search Algorithm-et használjuk az MS/MS spektrumok keresésére a rendelkezésre álló adatbázisok alapján. A további funkcionális információk lekéréséhez a COG osztályozáson alapuló fehérjéket annotáljuk. Az azonosított COG-ket a KEGG metabolikus útvonalak adatbázisában térképezzük fel, és az iPath online alkalmazásával vizualizáljuk. Az FDR korrekciója után az összes azonosított peptidet megkeresik az UniProtKB ellen, majd feltérképezik. Az azonosított fehérjék legmagasabb funkcionális szintjének elérése érdekében az azonosított COG-ket a KEGG útvonalakra térképezzük fel. A közös mikrobiális mag mellett az egyedek és az étrendek közötti különbségek is meghatározásra kerülnek a metabolikus funkció szempontjából.
• TEVÉKENYSÉG IV. Funkcionális jellemzés. A székletminták és a székletmintákból származó mikrobiális izolátumok egyes funkcionális jellemzőinek jellemzése megerősíti az étrend és a bélmikrobióta közötti kapcsolatot.
• AIV.1 Széklet genotoxikus és antigenotoxikus aktivitások (RU 5) A székletvízből (FW) mintákat készítenek, és a genotoxicitást Comet assay segítségével határozzák meg. Az FW-nek együtt exponált és LMA tárgylemezbe beépített HT29 enterocitákat (10^6 sejt/assay) egysejtű gélelektroforézisnek (SCGE) vetjük alá, és epifluoreszcenciával elemezzük. Számos élelmiszerből származó mikrobiális izolátumot megvizsgálnak a bélben potenciálisan jelen lévő genotoxikus és mutagén vegyületekkel szembeni gátló hatás szempontjából. A mikroorganizmus-genotoxin együttes inkubáció hatását a vegyületek maradék genotoxikus aktivitásának értékelésével vizsgáljuk, SOS-Chromotest (cél Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) és ezzel párhuzamosan Comet assay (cél enterociták HT29) segítségével. ).
• AIV.2. Széklet mikroorganizmusok és az immunválasz modulálása (RU 9) A dendritikus sejtek (DC) és a Caco-2 sejtek növekedésének és differenciálódásának feltételei az aktivitás első hónapjaiban kialakulnak. A laktobacillusokat és a bifidobaktériumokat minden székletmintából izolálják, és besugárzott baktériumként használják fel az immunmediátorok expressziójának kimutatására az enterocitákban. Meghatározzák az IL-8 és a tolerogén TGF-béta (transzformáló növekedési faktor béta) és a TSLP (thymic Stromal Lymphopoietin) transzkriptum és rokon fehérje szekréciós szintjét. A besugárzott baktériumokat a DC sejtekben a felszíni markerek stimulálására is használják. A teljes RNS-t kivonják a Caco-2 és DC sejtekből, és cDNS-t készítenek, hogy megvizsgálják az IL-8, TGF-béta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 és IL-10 relatív génexpresszióját; a megfelelő géntermékek koncentrációját ELISA-val (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) határozzuk meg.
• ATTIVITÁS V. Nyál, széklet és vizelet metabolom (RU10). Az "omika" megközelítés teljessé tétele érdekében a széklet-, vizelet- és nyálminták metabolomját három technikával (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier-transzformációs infravörös/csillapított teljes visszaverődés) és NMR (nukleáris mágneses rezonancia) elemzik. a korábban felállított protokollok szerint. A kémiai vegyületek azonosítása tömegspektrum adatbázisok, valamint az irodalomban található tömegspektrum adatok és/vagy tiszta kémiai vegyületek adatai alapján történik. A vizelet- és nyálminták felolvasztását követően 2 órán belül el kell végezni az NMR-analízist. A székletmintákat úgy készítik elő, hogy a legnagyobb jelentőséget tulajdonítsák a vízben oldódó molekulák teljes visszanyerésének. Az NMR-spektrumokat statisztikai analízishez készítjük elő azáltal, hogy az iCoshift algoritmus segítségével korrigálják a kis csúcsok eltolódásait.
• ATTIVITÁS VI. Az eredmények statisztikai feldolgozása (minden VT). A projekt fejlesztése során az RU2 gondoskodik a weboldal karbantartásáról a partner CBS-sel (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL) együttműködve, az oldal összegyűjti a különböző kutatási tevékenységek összes eredményét. Ezt az adatbázist az „R mód”-ban történő elemzéshez használjuk fel, hogy felmérjük a különböző leírók hatását a három diéta sokféleségének meghatározásában, „Q módban” pedig a három diéta közötti különbség meghatározására. Ugyanezen idő alatt a legrelevánsabb eredményeket tudományos publikációk útján lektorált folyóiratokban terjesztik.

A vizsgálandó témát figyelembe véve ez a projekt kétségtelenül alkalmazta a lehetséges szempontokat. Például az étrendnek az emberi mikrobiotára gyakorolt ​​hatásának ismerete megfelelő irányelvek elkészítését eredményezheti, amelyeket az integrált gondozást népszerűsítő kampányokban terjesztenek. Figyelmet kell fordítani a fogyasztói preferenciákra, attitűdökre, szükségletekre, viselkedésre, életmódra és oktatásra, valamint javítani kell a fogyasztók és az élelmiszerlánc-kutató közösség közötti kommunikációt a tájékozott választás és annak életminőségre gyakorolt ​​hatásának javítása érdekében. Ha az egyéneket feljogosítjuk egészségük javítására és kezelésére a helyes táplálkozási szokások révén, az egészségügyi rendszerek költségmegtakarítását eredményezi.