잡식성, 채식주의자 또는 완전채식 식단의 미생물군 및 관련 대사체 (MRMOVVD)

이 프로젝트의 전반적인 목적은 높은 처리량과 통합된 메타오믹스(게놈, 전사체, 프로테오믹 및 대사체) 분석을 통해 식단과 타액 및 분변 미생물 사이의 관계를 찾는 것입니다. 이 맥락에서 몇 가지 질문이 여전히 논의되고 있습니다. 예를 들어 미생물의 일일 섭취량과 장내 미생물의 균형에 대한 미생물의 역할은 무엇입니까? 장내 미생물군은 주요 식단(잡식성, 채식주의자 및 비건 채식)에 의해 어떻게 영향을 받습니까? 식단 유형에 따라 장 수준에서 우세한 미생물 그룹은 무엇입니까? 숙주 건강을 유지하는 데 있어 각 미생물 그룹의 추정 기여도는 무엇입니까? 식습관에 따라 식품에 함유된 주요 미생물 그룹의 양적 및 질적 결정은 이전 질문에 대한 답변이며 이 프로젝트의 목표 중 하나와 일치합니다. 다양성(genomics), 기능적 활동(transcriptomics 및 proteomics) 및 특히 분변 미생물총의 대사산물(metabolomics)의 추정은 이 프로젝트의 전체론적 접근 방식과 일치하며 이전 질문 중 몇 가지에 응답합니다. 인체의 다양한 틈새에 있는 서로 다른 미생물 개체군의 균형과 대사 병리의 시작 사이의 긴밀한 상관관계를 고려하여 이 프로젝트는 식단과 분해 사이의 가능한 관계를 강조할 수 있는 새로운 지식을 제공할 것입니다. 식이요법은 질병을 예방하고 인간의 장수를 보장하는 안정적이고 유리한 구강 및 장내 미생물군을 결정하는 가장 적절하고 저렴한 도구로 간주되어야 합니다. 프로젝트의 이러한 전반적인 목표는 다음과 같은 특정 목표를 기반으로 달성되어야 합니다. (ii) 개인 간 및 식단 유형 간 미생물군과 타액 및 대변의 대사체의 차이 추정; (iii) 식이의 종류에 따른 미생물 섭취량의 질적, 양적 차이 추정; 및 (iv) 질병 감수성의 지표로 간주될 수 있는 식이 유형과 관련된 대변 샘플의 기능적 특징의 식별.

이 프로젝트의 전반적인 목표를 달성하기 위해 10개의 연구 단위(RUs; RU1-10)가 16개의 국내 및 특히 외국 기관의 파트너십과 함께 12개의 다른 국가를 포괄하는 제안에 참여합니다. 각 RU의 리더는 다음과 같습니다.

• RU1. Marco Gobbetti는 제안서의 수석 조사자이자 RU1의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이 그는 4,075번 인용된 188개의 출판물의 저자이며 출판물당 평균 인용 횟수는 21.68회, h 인덱스는 39회입니다. 그는 최근 VIA 아카데미(h-index 값이 30 이상인 과학자에 대한 연간 평가)에서 선정한 최고 이탈리아 과학자 목록에 올랐습니다. RU1은 셀리악병의 장내 미생물 연구와 유산균 및 식품에 적용되는 프로테오믹스에 대한 좋은 경험을 얻었습니다. RU1은 프로젝트의 코디네이터 역할을 할 것입니다. 이 프로젝트 내에서 RU1은 다음과 같은 일에 관여합니다. 일기 관리; 생물학적 시료의 취급 및 준비; 배양 의존적 방법에 의한 배설물 샘플의 주요 미생물 그룹 결정; 다른 식이 습관을 가진 개인으로부터 선택된 대변 샘플의 메타-프로테오믹스 특성화; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU1은 확인된 단백질에 대한 기능적 활동 및/또는 대사 경로의 특정 속성을 위해 Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL(CSIC - UAM), 스페인 마드리드와 협력할 예정입니다. 프로테옴 연구에 대한 생물정보학적 접근을 위해 아일랜드 코크 대학의 미생물학.
• RU2. Gianluigi Cardinali는 RU2의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이 그는 h 인덱스가 11인 38개의 간행물의 저자입니다. RU2는 미생물 및 분자 기술을 통해 분석되는 효모의 생물다양성과 분류학 분야에서 약 20년 동안 운영되고 있습니다. 이 프로젝트 내에서 RU2는 PCR-DGGE 접근법을 통한 식품 미생물군의 다양성 특성화; PCR-DGGE 접근법을 통한 배설물 샘플의 미생물총 특성화; 리더로서 모든 RU의 결과에 대한 통계적 정교화를 관리하여 공통 데이터베이스를 제공합니다. RU2는 데이터의 생물정보 정교화를 위해 네덜란드 위트레흐트에 있는 CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures)와 협력할 것입니다.
• RU3. Danilo Ercolini는 RU3의 리더입니다. ISI Web of Science의 보고에 따르면 그는 58개의 출판물을 저술했으며 총 인용 횟수는 1,354회, h 인덱스는 21회입니다. RU3는 복잡한 생태계, 주로 음식 생태계의 미생물 생태학 연구에 수년 동안 참여해 왔습니다. 식품 미생물총은 항상 첨단 분자 접근법과 합성 배지에서 미생물을 배양할 필요가 없는 배양 독립적인 방법으로 연구되어 왔습니다. 이 프로젝트 내에서 RU3는 다음과 같은 작업에 참여합니다. 타액 샘플의 미생물 다양성 특성화; 선택된 식품 샘플의 심층 시퀀싱; 선택된 배설물 및 타액 샘플의 심층 시퀀싱; 다른 식이 습관을 가진 개인으로부터 선택된 대변 샘플의 메타-게놈 특성화; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU3는 Earth Microbiome Project(EMP, www.earthmicrobiome.org)와 협력할 것입니다. 광범위한 생태계의 미생물을 설명하는 데이터 세트를 생성하기 위해 미국 Lemont의 Argonne National Laboratory에서 실행됩니다.
• RU4. Erasmo Neviani는 RU4의 리더입니다. ISI Web of Science의 보고에 따르면 그는 111개의 출판물을 저술했으며 총 인용 횟수는 1,508회, h 인덱스는 22회입니다. RU4는 식품 제조의 다양한 단계에서 미생물 개체군, 역학 및 세포의 생리학적 상태를 포괄적이고 통합적으로 평가하기 위해 식품 미생물 생태학에서 좋은 경험을 얻었습니다. 이 프로젝트 내에서 RU4는 다음과 같은 일에 관여합니다. 자원봉사자 모집; 일기 관리; 생물학적 시료의 취급 및 준비; 배양 의존적 방법을 통한 대변 샘플의 주요 미생물 그룹 결정; 일기의 결과 정교화; 문화 의존적 및 비독립적 방법을 통한 식품의 주요 미생물 그룹 결정; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU4는 식품, 특히 유제품의 미생물 결정을 위해 그리스 아테네 농업 대학의 식품 과학 기술과와 Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei의 역학 부서와 협력할 것입니다. 이탈리아 밀라노의 Tumori는 식이 습관 기록에 대한 지원을, 이탈리아 로마 국립 식품 영양 연구소는 제한적인 식이 요법과 관련된 추정되는 결함을 모니터링했습니다.
• RU5. 알도 코르세티는 RU5의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이, 그는 총 2,084개의 인용 횟수와 28개의 h 인덱스를 포함하는 81개의 출판물의 저자입니다. RU5는 식품 및 음료의 미생물 생태학 분야와 생명공학 및 기능적 측면에 대한 균주 특성화 분야에서 좋은 경험을 쌓아 다양한 응용 분야에 대한 스타터 배양을 선택했습니다. 이 프로젝트 내에서 RU5는 다음과 같은 일에 관여합니다. 문화 의존적 방법을 통해 식품의 주요 미생물 그룹 결정 식품에서 분리된 미생물의 동정 및 분류; 분변 샘플의 유전독성 특성화; 식품에서 분리된 미생물의 항유전독소 활성 특성 규명; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU5는 캐나다 앨버타 대학의 농업, 식품 및 영양 과학부와 협력하여 다중 유전자좌 유형 시퀀싱에 의한 식품 분리 미생물의 분자 유형 분석을 수행할 것입니다.
• RU6. Patrizia Brigidi는 RU6의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이 그녀는 3,158번 인용된 102개의 출판물의 저자이며 출판물당 평균 인용 횟수는 32.41회, h 인덱스는 26입니다. RU6는 복잡한 생태계(대변 및 장 생검)에서 박테리아의 식별 및 분자 정량화 분야와 박테리아의 건강상의 이점을 담당하는 분자 메커니즘 분야에서 통합되고 광범위한 역량을 보유하고 있습니다. 이 프로젝트 내에서 RU6는 다음과 같은 일에 참여합니다. 일기 관리; 생물학적 시료의 취급 및 준비; 배양 의존적 방법을 통한 대변 샘플의 주요 미생물 그룹 결정; 다른 식이 습관을 가진 개인으로부터 선택된 대변 샘플의 메타-전사체 특성화; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU6는 Metatranscriptomic 플랫폼의 개발과 KEGG 및 기능 활동의 COG 클러스터에 할당하기 위해 얻은 시퀀스의 생물정보학적 분석을 위해 영국 레딩 대학교의 Food Microbial Science Unit과 협력할 것입니다.
• RU7. Francesca Clementi는 RU7의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이, 그녀는 504번 인용된 59개의 출판물의 저자이며 출판물당 평균 인용 횟수는 11.25회이고 h 인덱스는 15입니다. RU7은 식인성 미생물, 특히 유산균의 역할, 모니터링 및 제어에 관한 신뢰할 수 있는 전문 지식을 보유하고 있습니다. 이 프로젝트에서 RU7은 PCR-DGGE에 의한 식품 미생물 다양성의 특성화; 대변 ​​및 타액 샘플에서 항생제 내성 결정; 분변 및 타액 샘플에서 항생제 내성 유산균의 분리 및 식별; 미생물 항생제 내성에 관련된 유전자의 특성화; 박테리아 간의 항생제 내성 전달 메커니즘 연구; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU7은 그리스 트라키아의 그리스 Democritus 대학 및 스코틀랜드 애버딘 대학의 영양 및 건강을 위한 Rowett 연구소와 협력하여 식품 및 분리된 젖산 박테리아에서 전이 가능한 항생제 내성 유전자를 조사할 것입니다. 타액 및 대변 샘플에서.
• RU8. Luca Simone Cocolin은 RU8의 리더입니다. Scopus의 보고에 따르면 그는 2,036번 인용된 131개의 출판물을 저술했으며 h 인덱스는 25입니다. RU 8은 발효 식품의 미생물 생물다양성과 활력 연구를 위한 배양 독립적인 방법의 적용에 대한 광범위한 경험을 가지고 있습니다. 또한 복잡한 생태계에서 특정 미생물을 정량화하기 위한 정량적 PCR(qPCR)에 대한 지식도 보유하고 있습니다. 이 프로젝트 내에서 RU8은 다음과 같은 일에 참여합니다. 일기 관리; 생물학적 시료의 취급 및 준비; 배양 의존적 방법을 통한 대변 샘플의 주요 미생물 그룹 결정; DNA 및 RNA 수준 모두에 적용되는 DGGE 접근법에 의한 배설물 미생물군의 프로파일링; 다른 식이 습관을 가진 개인으로부터 선택된 대변 샘플의 메타-게놈 특성화; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU8은 슬로베니아의 마리보르 대학(UM) 및 그리스 알렉산드루폴리스의 Democritus University of Thrace(DUT)와 협력하여 병원체-숙주 세포의 상호 작용을 다루고 가능한 변형을 위해 협력할 것입니다. 각각 특정 식품과 관련된 특정 미생물 그룹의 알려진 유익한 역할을 가장 잘 활용할 수 있는 다른 식단 그룹의 식단.
• RU9. Mauro Rossi는 RU9의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이 그는 41개의 출판물의 저자이며 총 인용 횟수는 1087회, h 인덱스는 19회입니다. RU9는 소장의 생화학 및 면역학 분야에서 오랜 경험(>25년)과 강력한 협력 관계를 가지고 있습니다. 이 프로젝트에서 RU9는 다음과 같은 작업에 관여합니다. 분변 샘플에서 락토바실러스 및 비피도박테리아 분리; Caco-2 세포를 사용한 분변 분리물의 시험관내 면역 반응의 특성화; 수지상 세포를 사용한 분변 분리물의 시험관내 면역 반응의 특성화; Caco-2 및 수지상 세포에서 사이토카인 분비 측정; 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 RU9는 Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos(CSIC), Valencia, Spain(모델 B의 첨부 파일)과 협력하여 배설물 미생물의 특이성이 질병 발병에 역할을 할 수 있는지 여부를 확인합니다. 장 면역 기능 장애.
• RU10. Lucia Vannini는 RU10의 리더입니다. ISI Web of Science에서 보고한 바와 같이, 그녀는 총 322회의 인용 횟수와 9의 h 인덱스를 포함하는 27개의 출판물의 저자입니다. RU10은 생물학적 샘플의 대사체 분석을 위한 식품 미생물학 분야와 기기 기술, 특히 핵 자기 공명 사용 모두에서 좋은 경험을 얻었습니다. 이 프로젝트 내에서 RU10은 선택된 식품의 대사체 특성화; 타액 샘플의 대사체 특성화; 대변 ​​및 소변 샘플의 대사체 특성화 및 결과의 통계적 정교화. 이 프로젝트 내에서 R10은 스웨덴의 스웨덴 식품 생명 공학 연구소 및 체코 프라하의 연구 개발부 화학 기술 연구소와 각각 일부 선택된 식품 및 생물학적 샘플. 사용된 캐스케이드 접근 방식은 각 연구 활동과 각 RU가 프로젝트의 주요 목표를 달성하는 데 없어서는 안 될 것입니다.

이 연구는 아래에 설명된 다양한 활동(AI-VI)으로 구성됩니다.

• 활동 I. 개인 모집, 일지 관리, 생물학적 시료의 취급, 준비 및 보관, 분변 시료의 미생물학적 분석.
• AI.1. 개인 모집 및 일지 관리(RU1, 4, 6, 8) 총 150명의 피험자에 대해 약 50명의 잡식성, 채식주의자 및 비건 자원봉사자를 모집합니다. 이탈리아 과학 협회의 협력으로 채식주의자 및 비건 개인을 모집합니다. 채식 영양. Omnivore 개인은 대학에 게시된 광고를 통해 모집됩니다. 거의 같은 수의 잡식성, 채식주의자 및 비건(18-59세, 남녀 비율 ca. 1:1). 모집된 자원봉사자는 식습관을 기록하기 위해 합의 문서에 서명해야 합니다. 일기는 식품 특성에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있도록 정교하게 작성되어 시장에서 제품을 쉽게 식별하고 섭취한 것으로 추정되는 미생물 부하를 추정할 수 있습니다. 프로젝트가 시작되기 전에 대학 윤리 위원회에 통보됩니다.
• AI.2. 생물학적 시료의 취급, 준비 및 보관(RU1, 4, 6, 8). 각 개인은 3주 동안 매주 타액, 대변 및 소변 샘플을 제공합니다. 개인 내 가변성을 제한하기 위해 분석 전에 3중 샘플을 모을 것입니다. 생물학적 시료의 종류(타액, 대변, 소변) 및 후속 분석(예: DNA, RNA, 프로테옴)에 따라 처리가 다르게 수행됩니다. 개인 모집 및 생물학적 샘플 수집과 동시에 대부분의 RU는 기술/방법 설정에 관여합니다.
• AI.3. 대변 ​​샘플의 미생물학적 분석(RU1, 4, 6, 8). 처음에는 가장 일반적인 배설물 미생물 그룹을 열거하기 위해 다른 선택 배양 배지에 신선한 배설물 물질을 플레이팅하여 실행 가능한 계수를 수행할 것입니다.
• AI.4. 기술/방법 설정(RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). 개인 모집 및 생물학적 샘플 수집과 동시에 대부분의 RU는 기술/방법 설정에 관여합니다. Meta-omics 분석을 위한 독립적이고 경쟁력 있는 플랫폼을 구축하기 위해 RU3는 이 프로젝트의 주요 경제적 투자인 높은 처리량 시퀀싱을 위한 장비를 구매할 것입니다.
• 활동 II. 식품 미생물총과 대사체. 식이 일기의 정보를 기반으로 3가지 다이어트 중 가장 대표적인 식품은 3가지 범주로 나뉩니다. (i) 낮음(TBC, 10^3 cfu/g); (ii) 중간체(TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); 및 (iii) 높은(TBC ³ 10^6 cfu/g) 미생물 부하. (i) 그룹 식품의 경우 미생물 수는 문헌 데이터를 기반으로 추정됩니다. (ii) 및 (iii) 그룹 식품의 경우 시장 차별화가 낮은 잘 알려진 제품(예: Parmigiano Reggiano 치즈)의 경우 문헌 데이터를 기반으로 미생물 수를 결정하는 반면 다음의 경우 적절한 분석을 수행합니다. 시장 변동성이 큰 제품(예: 모짜렐라 치즈). 후자의 경우 분석에는 시장에서 사용할 수 있는 많은 제품이 포함됩니다. 식품의 미생물 다양성은 먼저 PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel 전기영동)에 의해 더 깊이 연구되고 필요할 때 특정 식품의 미생물군에 대한 복잡성 수준과 현재 지식을 기반으로 심층 시퀀싱을 통해 연구될 것입니다.
• AII.1 식품 내 미생물의 정량적 측정(RU 4, 5; 7). 식품 분석은 RU4와 5 간에 공유되며 일부 샘플은 결과를 상호 검증하기 위해 두 RU에서 분석됩니다. 이후 RU4는 LH-PCR(Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) 분석을 통해 선별된 식품의 특성을 파악하고 그 결과를 PCR-DGGE를 사용하여 RU7에서 얻은 결과와 비교합니다. RU5는 배설물의 감소된 항-유전독성 활성과 섭취된 식품의 특정 미생물의 존재와의 가능한 관계를 찾는 것을 목표로 식품에서 분리된 대규모 컬렉션을 식별할 것입니다.
• AII.2 식품의 미생물 다양성(RU 2, 3). 첫째, 이 활동은 일기의 기록을 기반으로 특히 채식주의자와 완전 채식주의자가 먹는 특성이 불량한 식품을 고려합니다. 마이크로 및 마이크로 바이오타 모두 조사될 것입니다. 효모 및 사상균에 대한 PCR-DGGE 분석은 rRNA의 서브유닛 LSU 또는 26S 및 ITS(Internal transcribed spacer) 영역에 대한 D1/D2 도메인 인코딩 부분의 증폭을 기반으로 합니다. 16S rRNA 유전자의 V3 영역은 박테리아를 검출하기 위해 표적이 될 것입니다. DGGE 분석 후 생성된 젤은 소프트웨어 Bionumerics에 의해 디지털화되고 분석됩니다. 덴드로그램은 유사성 계수가 85%인 샘플을 추가 시퀀싱에서 제외하기 위해 클러스터 분석을 받게 됩니다. 이러한 선택은 차세대 시퀀싱 비용을 절감하고 생물 정보학을 통해 분석할 관리 가능한 양의 데이터를 얻을 수 있도록 보장합니다. RU3는 구매할 시퀀싱 플랫폼 유형에 따라 분류학적 관심 변수 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 사용하고 특정 절차를 사용하여 딥 시퀀싱을 수행합니다. 시퀀싱 결과는 RU2에 의해 생물정보학 기반으로 정교화될 것입니다.
• AII.3 식품 대사체(RU 10). 식습관에 대한 정보를 바탕으로 세 가지 식단에서 가장 많이 대표되는 발효 식품을 분석하여 섭취한 화합물(예: 살리실산)과 생물학적 시료에서 추정되는 회수 사이의 가능한 관계를 찾습니다. 대사체 분석은 GC-MS/SPME(가스 크로마토그래피-질량 분석법/고상 미세 추출) 및 FTIR(푸리에 변환 적외선) 분광법으로 수행됩니다.
• 활동 III. 대변과 타액의 미생물. 예비적으로 모든 ca. 150명의 지원자는 미생물 다양성에 대한 개요를 얻기 위해 PCR-DGGE 분석을 받게 됩니다. RT-PCR-DGGE(Real Time-Polymerase Chain Reaction-Denaturing gradient gel electrophoresis)도 대변에서 생존 가능한 개체군을 추정하기 위해 고려됩니다. 이러한 분석을 바탕으로 각 식습관의 대표 샘플을 차세대 염기서열 분석에 적용합니다. 이러한 모든 결과의 결과는 meta-omics 분석에 적용할 세 가지 식단 각각에 대해 단계적으로 4/5 대변 샘플을 선택할 수 있도록 해야 합니다.
• 활동 III.1. 생물 다양성 연구.
• AIII.1.1. PCR-DGGE 프로파일링(RU 2, 3, 8) 효모 및 사상균에 대한 PCR-DGGE 분석은 26S rRNA 및 ITS 영역을 대상으로 하며, 16S rRNA의 V3 및/또는 V6-V8 영역은 박테리아에 대해 연구됩니다. DNA와 RNA(RT-PCR 후)는 각각 총 인구와 생존 인구를 조사하기 위한 표적으로 사용됩니다. 동일한 실험 조건에서 RU3는 타액 샘플의 박테리아 다양성을 특성화합니다. DGGE 후, DNA 및 RNA 샘플의 이미지 및 클러스터 분석을 통해 전체 개체군과 생존 가능한 개체군의 차이를 정의할 수 있습니다. 유사성 덴드로그램은 유사성 계수가 ³ 85%인 샘플을 추가 시퀀싱 활동에서 제외하는 데 사용됩니다. 이러한 선택은 차세대 시퀀싱 분석 비용을 절감하고 생물 정보학을 통해 분석할 데이터의 관리 가능한 양을 얻을 수 있도록 보장할 것입니다.
• AIII.1.2. 차세대 시퀀싱(RU 3, 8) 선택된 타액 및 대변 샘플에 대한 딥 시퀀싱은 분류학적 관심의 가변 유전자 앰플리콘 라이브러리를 사용하여 수행됩니다. 박테리아와 진균 모두에 대해 얻은 모든 시퀀싱 결과는 RU2에 의해 생물 정보학 기반으로 정교화됩니다.
• AIII.1.3. 항생제 내성(RU 7) 타액 및 분변 샘플에서 직접 추출한 DNA는 PCR 분석을 사용하여 여러 항생제에 대한 내성을 암호화하는 유전자의 발생을 스크리닝합니다. 항생제 내성(AR) 유전자에 대해 양성으로 결과가 나온 샘플은 항생제 내성 유산균, 유산균 및 장구균을 분리하는 데 사용될 것입니다. 식별 후, 해당 중단점보다 높은 최소 억제 농도(MIC) 값을 나타내는 분리주는 해당 AR 유전자의 PCR 증폭에 의해 확인됩니다. 유전자 이동 요소에 국한된 AR 유전자를 분리주에서 임상 관심 있는 박테리아로 전이할 가능성은 접합 시험에 의해 평가될 것입니다.
• AIII.2. 선택된 대변 샘플의 Meta-omics 분석 캐스케이드 접근법에 따르면, 대변 샘플의 미생물 다양성 연구 결과는 3가지 유형의 식단 각각을 대표하는 4/5 개체를 선택합니다(4/5 x 3 = 12/ 15) meta-omics 분석 대상. 메타오믹스 접근법은 12/15 개인의 배설물 미생물군집의 DNA 및 RNA 서열로 구성된 사내 데이터베이스를 제공하여 합성된 단백질을 완전히 볼 수 있게 합니다.
• AIII.2.1. Meta-genomics (RU3, 8) 분변 DNA를 정량화하고 메타-게놈 분석을 위해 shotgun 시퀀싱 프로토콜을 적용합니다. 이 작업은 시퀀싱 플랫폼의 성능과 가용성에 따라 RU3에서 수행해야 하며, 이 플랫폼은 대변 및 타액의 DNA 및 cDNA 앰플리콘 분석에 풀타임으로 참여하게 됩니다. 또는 전문 회사에서 이 작업을 서비스로 수행합니다.
• AIII.2.2. Meta-transcriptomics(RU 6) 전체 미생물 유전자 발현 프로필은 혁신적인 Illumina 기반 Metatranscriptomic 접근 방식과 프로젝트의 첫 달 동안 설정된 프로토콜을 사용하여 특성화됩니다. cDNA는 최적화된 절차에 따라 RNA에서 합성됩니다. cDNA의 무작위 증폭이 수행되고 cDNA는 Illumina HiSeq 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 시퀀싱된 메타 전사체는 Velvet/MetaVelvet 또는 SOAPdenovo 패키지를 사용하여 함께 조립되어 가능한 가장 큰 합의 시퀀스를 달성합니다. 전사체 서열은 잘 확립된 파이프라인을 사용하여 주석을 달고 전사체는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG(Clusters of Orthologous Groups) 및 Genbank 데이터베이스. nr BLASTX로 식별된 박테리아와 유사한 읽기는 COG 데이터베이스에 대해 추가로 검색됩니다. 시퀀스의 기능적 역할은 KEGG 및 COG 검색을 기반으로 지정됩니다.
• AIII.2.3. Meta-proteomics(RU1) 활동 첫 달 내에 설계된 워크플로를 기반으로 각 대변 샘플에서 단백질을 추출하고 젤 프리 및/또는 젤 기반 프로테오믹스로 분석합니다. 펩타이드 식별은 질량 분석기 Finnigan LCQ Deca XP MAX를 사용하여 수행됩니다. 차등 단백질 분석이 수행됩니다. 펩타이드 식별을 위해 Open Mass Spectra Search Algorithm을 사용하여 사용 가능한 데이터베이스에 대해 MS/MS 스펙트럼을 검색합니다. 추가 기능 정보를 검색하기 위해 COG 분류를 기반으로 하는 단백질에 주석이 추가됩니다. 식별된 COG는 KEGG 대사 경로 데이터베이스에 매핑되고 iPath의 온라인 애플리케이션으로 시각화됩니다. FDR 수정 후 식별된 모든 펩타이드는 UniProtKB에 대해 검색된 다음 매핑됩니다. 식별된 모든 단백질의 최고 기능 수준을 다루기 위해 식별된 COG를 KEGG 경로에 매핑합니다. 일반적인 미생물 코어 외에도 개체 간 및 식단 간 차이는 대사 기능 측면에서 결정됩니다.
• 활동 IV. 기능적 특성화. 배설물 샘플과 배설물 샘플에서 분리된 미생물의 일부 기능적 특성의 특성화는 식이와 장내 미생물 사이의 연결을 강화할 것입니다.
• AIV.1 분변 유전독성 및 항유전독성 활성(RU 5) 분변수(FW) 샘플을 준비하고 Comet 분석으로 유전독성을 결정합니다. FW에 동시 노출되고 LMA 슬라이드에 통합된 HT29 장세포(10^6 세포/분석)는 단일 세포 겔 전기영동(SCGE)에 적용되고 표면형광으로 분석됩니다. 식품에서 분리된 여러 미생물이 장에 잠재적으로 존재할 수 있는 유전 독성 및 돌연변이 유발 화합물에 대한 억제 활성에 대해 조사될 것입니다. 미생물-유전자독소 동시 배양의 효과는 SOS-Chromotest(표적 Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) 및 동시에 Comet 분석(표적 장세포 HT29 ).
• AIV.2. 분변 미생물 및 면역 반응 조절(RU 9) 수지상 세포(DC) 및 Caco-2 세포의 성장 및 분화를 위한 조건은 활동 첫 달 내에 설정됩니다. Lactobacilli와 bifidobacteria는 모든 배설물 샘플에서 분리되고 장 세포에서 면역 매개체의 발현을 감지하기 위해 조사된 박테리아로 사용됩니다. IL-8 및 관용원성 TGF-베타(형질전환 성장 인자 베타) 및 TSLP(흉선 간질 림프구 생성 인자)의 전사체 및 동족 단백질 분비 수준이 결정될 것이다. 조사된 박테리아는 또한 DC 세포의 표면 마커를 자극하는 데 사용됩니다. Caco-2 및 DC 세포에서 전체 RNA를 추출하고 cDNA를 준비하여 IL-8, TGF-베타, TSLP, TNF-알파, IL-12p40 및 IL-10의 상대적인 유전자 발현을 확인합니다. 해당 유전자 산물의 농도는 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)에 의해 결정됩니다.
• ATTIVITY V. 타액, 분변 및 소변 대사체(RU10). "omics" 접근 방식을 완성하기 위해 대변, 소변 및 타액 샘플의 대사체를 세 가지 기술(GC-MS/SPME, FTIR/ATR(Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) 및 NMR(Nuclear Magnetic Resonance))로 분석합니다. 이전에 설정한 프로토콜에 따라 화합물은 문헌의 질량 스펙트럼 데이터 및/또는 순수 화합물의 데이터뿐만 아니라 질량 스펙트럼 데이터베이스를 사용하여 식별됩니다. 소변 및 타액 샘플을 해동하면 NMR 분석이 2시간 이내에 수행됩니다. 대변 ​​샘플은 수용성 분자의 완전한 회수에 최대의 중요성을 부여하여 준비됩니다. NMR 스펙트럼은 iCoshift 알고리즘을 통해 작은 피크 오정렬을 수정하여 통계 분석을 위해 준비됩니다.
• 성향 VI. 결과의 통계적 정교화(모든 RU). 프로젝트 개발 중에 RU2는 파트너 CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL)와 협력하여 웹 사이트 유지 관리를 처리하고 사이트는 다양한 연구 활동의 모든 결과를 수집합니다. 이 데이터베이스는 "R 모드"에서 분석에 사용되어 세 가지 다이어트의 다양성을 결정하는 다양한 설명자의 영향을 평가하고 "Q 모드"에서 세 가지 다이어트 간의 차이를 결정하는 데 사용됩니다. 동시에 가장 관련성이 높은 결과는 과학 간행물을 통해 피어 리뷰 저널에 배포됩니다.

연구할 주제를 고려하여 이 프로젝트는 의심할 여지 없이 잠재적인 측면을 적용했습니다. 예를 들어, 인간 미생물군에 대한 식이 효과에 대한 지식은 통합 치료 촉진 캠페인에 배포할 적절한 지침을 준비하는 결과를 가져올 수 있습니다. 소비자 선호도, 태도, 요구 사항, 행동, 라이프스타일 및 교육이 고려될 것이며 정보에 입각한 선택과 삶의 질에 미치는 영향을 개선하기 위해 소비자와 식품 사슬 연구 커뮤니티 간의 커뮤니케이션이 향상될 것입니다. 개인이 올바른 식습관을 통해 자신의 건강을 개선하고 관리할 수 있도록 권한을 부여하면 의료 시스템의 비용을 절감할 수 있습니다.