Mikrobiota und verwandte Metabolome in omnivoren, vegetarischen oder veganen Ernährungsweisen (MRMOVVD)

Das übergeordnete Ziel dieses Projekts ist es, die Beziehung zwischen Ernährung und Speichel und fäkalen Mikrobiota durch Hochdurchsatz- und integrierte Meta-Omics-Analysen (genomische, transkriptomische, proteomische und metabolomische) Analysen zu finden. In diesem Zusammenhang werden noch einige Fragen diskutiert. Wie hoch ist beispielsweise die tägliche Aufnahme von Mikroben und ihre Rolle für das Gleichgewicht der Darmmikrobiota? Wie wird die Darmmikrobiota durch die wichtigsten Ernährungsformen (Allesfresser, Vegetarier und Veganer) beeinflusst? Welches sind die vorherrschenden mikrobiellen Gruppen auf Darmebene, abhängig von der Art der Ernährung? Was ist der mutmaßliche Beitrag jeder mikrobiellen Gruppe zur Aufrechterhaltung der Wirtsgesundheit? Die quantitative und qualitative Bestimmung der wichtigsten mikrobiellen Gruppen in Lebensmitteln in Abhängigkeit von Ernährungsgewohnheiten beantwortet eine frühere Frage und deckt sich mit einem der Ziele dieses Projekts. Die Abschätzung der Diversität (Genomik), der funktionellen Aktivität (Transkriptomik und Proteomik) und der Stoffwechselprodukte (Metabolomik) insbesondere der fäkalen Mikrobiota deckt sich mit dem ganzheitlichen Ansatz dieses Projekts und beantwortet mehrere der früheren Fragen. Unter Berücksichtigung der engen Korrelation zwischen dem Gleichgewicht verschiedener mikrobieller Populationen in verschiedenen Nischen des menschlichen Körpers und dem Auftreten von Stoffwechselerkrankungen soll dieses Projekt neue Erkenntnisse liefern, die mögliche Zusammenhänge zwischen Ernährung und Stoffwechselstörungen aufzeigen können. Die Ernährung muss als das geeignetste und kostengünstigste Instrument angesehen werden, um eine stabile und günstige orale und intestinale Mikrobiota zu bestimmen, die Krankheiten vorbeugt und die Langlebigkeit des Menschen garantiert. Diese Gesamtziele des Projekts sollen auf der Grundlage spezifischer Ziele erreicht werden, wie beispielsweise: (i) die Identifizierung von biologischen, molekularen und metabolischen Markern, die für die Art der Ernährung spezifisch sind; (ii) die Schätzung der Unterschiede in der Mikrobiota und im Metabolom von Speichel und Kot, sowohl zwischen Individuen als auch zwischen verschiedenen Ernährungsarten; (iii) die Schätzung der qualitativen und quantitativen Unterschiede bei der mikrobiellen Aufnahme im Zusammenhang mit der Art der Ernährung; und (iv) die Identifizierung der funktionellen Merkmale von Kotproben in Bezug auf die Art der Ernährung, die als Indikatoren für die Anfälligkeit für Krankheiten angesehen werden können.

Mit dem Ziel, das Gesamtziel dieses Projekts zu erreichen, sind zehn Forschungseinheiten (RUs; RU1-10) an dem Vorschlag beteiligt, mit der Partnerschaft von 16 nationalen und insbesondere ausländischen Institutionen, die 12 verschiedene Länder abdecken. Die Leiter der einzelnen RU sind unten aufgeführt:

• RU1. Marco Gobbetti ist der leitende Prüfarzt des Vorschlags und Leiter von RU1. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 188 Publikationen, die 4.075 Mal zitiert wurden, mit einem Durchschnitt von 21,68 Zitationen pro Publikation und einem h-Index von 39. Er wurde kürzlich von der VIA Academy in die Top Italian Scientists aufgenommen (jährliche Bewertung für Wissenschaftler mit einem h-Index-Wert über 30). Das RU1 hat gute Erfahrungen mit der Untersuchung der intestinalen Mikrobiota von Zöliakiepatienten und mit der auf Milchsäurebakterien und Lebensmittel angewendeten Proteomik gesammelt. RU1 übernimmt die Rolle des Koordinators des Projekts. Innerhalb dieses Projekts ist RU1 beteiligt an: Rekrutierung von Freiwilligen; Verwaltung von Tagebüchern; Handhabung und Vorbereitung biologischer Proben; Bestimmung der Hauptkeimgruppen in den Stuhlproben durch kulturabhängige Methoden; metaproteomische Charakterisierung ausgewählter Kotproben von Personen mit unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird das RU1 mit dem Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Spanien, für die spezifische Zuordnung funktioneller Aktivitäten und/oder Stoffwechselwege zu identifizierten Proteinen und mit der Abteilung für Mikrobiologie des University College Cork, Irland, für den bioinformatischen Ansatz bei Proteomstudien.
• RU2. Gianluigi Cardinali ist der Anführer von RU2. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 38 Publikationen mit einem h-Index von 11. Das RU2 arbeitet seit etwa zwanzig Jahren auf dem Gebiet der Biodiversität und Taxonomie von Hefen, die mit mikrobiologischen und molekularbiologischen Methoden analysiert werden. Innerhalb dieses Projekts ist RU2 beteiligt an: Charakterisierung der Diversität der Lebensmittel-Mikrobiota durch PCR-DGGE-Ansatz; Charakterisierung der Mikrobiota von Stuhlproben durch PCR-DGGE-Ansatz; und federführend bei der Verwaltung der statistischen Aufbereitung der Ergebnisse aller EVU zur Bereitstellung einer gemeinsamen Datenbasis. Das RU2 wird für die bioinformatische Aufbereitung der Daten mit dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Niederlande, zusammenarbeiten.
• RU3. Danilo Ercolini ist der Anführer von RU3. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 58 Publikationen mit einer Gesamtzahl von Zitationen von 1.354 und einem h-Index von 21. Das RU3 beschäftigt sich seit Jahren mit Studien zur mikrobiellen Ökologie komplexer Ökosysteme, hauptsächlich Nahrungsökosysteme. Die Lebensmittelmikrobiota wurde schon immer mit fortschrittlichen molekularen Ansätzen und kulturunabhängigen Methoden untersucht, die keine Kultivierung von Mikroorganismen auf synthetischen Medien erfordern. Innerhalb dieses Projekts ist RU3 beteiligt an: Charakterisierung der Diversität der Mikrobiota in Speichelproben; Tiefensequenzierung ausgewählter Lebensmittelproben; Tiefensequenzierung ausgewählter Stuhl- und Speichelproben; metagenomische Charakterisierung ausgewählter Kotproben von Personen mit unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Innerhalb dieses Projekts wird das RU3 mit dem Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) zusammenarbeiten. das im Argonne National Laboratory, Lemont, USA, betrieben wird, um Datensätze zu erstellen, die Mikroorganismen aus einem breiten Spektrum von Ökosystemen beschreiben.
• RU4. Erasmo Neviani ist der Anführer von RU4. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 111 Publikationen mit einer Gesamtzahl von Zitationen von 1.508 und einem h-Index von 22. Das RU4 hat gute Erfahrungen in der mikrobiellen Ökologie von Lebensmitteln gesammelt, um eine umfassende und integrierte Bewertung der mikrobiellen Populationen, der Dynamik und des physiologischen Zustands von Zellen in verschiedenen Phasen der Lebensmittelherstellung zu ermöglichen. Innerhalb dieses Projekts ist RU4 beteiligt an: Erstellung von Tagebüchern; Rekrutierung von Freiwilligen; Verwaltung von Tagebüchern; Handhabung und Vorbereitung biologischer Proben; Bestimmung der Hauptkeimgruppen in den Stuhlproben durch kulturabhängige Methoden; Ausarbeitung der Ergebnisse aus Tagebüchern; Bestimmung der wichtigsten mikrobiellen Gruppen in Lebensmitteln durch kulturabhängige und -unabhängige Methoden; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird das RU4 mit dem Department of Food Science and Technology der Agricultural University of Athens, Griechenland, für die mikrobielle Bestimmung in Lebensmitteln und insbesondere in Milchprodukten mit der Epidemiology Unit des Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei zusammenarbeiten Tumori aus Mailand, Italien, für die Unterstützung bei der Aufzeichnung von Ernährungsgewohnheiten und mit dem Nationalen Institut für Lebensmittel- und Ernährungsforschung in Rom, Italien, für die Überwachung der mutmaßlichen Mängel im Zusammenhang mit restriktiven Ernährungsregimen.
• RU5. Aldo Corsetti ist der Anführer von RU5. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 81 Publikationen mit einer Gesamtzahl von Zitationen von 2.084 und einem h-Index von 28. RU5 hat gute Erfahrungen im Bereich der mikrobiellen Ökologie von Lebensmitteln und Getränken sowie in der Stammcharakterisierung für biotechnologische und funktionelle Aspekte gesammelt, um Starterkulturen für verschiedene Anwendungen auszuwählen. Innerhalb dieses Projektes ist RU5 beteiligt an: Bestimmung der wichtigsten mikrobiellen Gruppen in Lebensmitteln durch kulturabhängige Methoden; Identifizierung und Typisierung von aus Lebensmitteln isolierten Mikroben; Charakterisierung der Genotoxizität von Stuhlproben; Charakterisierung der antigenoxigenen Aktivität mikrobieller Isolate aus Lebensmitteln; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird das RU5 mit dem Department of Agricultural, Food and Nutritional Science der University of Alberta, Kanada, zusammenarbeiten, um durch eine Multi-Locus-Typ-Sequenzierung molekulare Typisierung von Mikroorganismen zu ermöglichen, die in Lebensmitteln isoliert sind.
• RU6. Patrizia Brigidi ist die Leiterin von RU6. Wie ISI Web of Science berichtet, ist sie Autorin von 102 Publikationen, die 3.158 Mal zitiert wurden, mit einem Durchschnitt von 32,41 Zitationen pro Publikation und einem h-Index von 26. RU6 verfügt über eine konsolidierte und breite Kompetenz auf dem Gebiet der Identifizierung und molekularen Quantifizierung von Bakterien aus komplexen Ökosystemen (Fäkalien und Darmbiopsien) und auf dem Gebiet der molekularen Mechanismen, die für den gesundheitlichen Nutzen von Bakterien verantwortlich sind. Innerhalb dieses Projekts ist RU6 beteiligt an: Rekrutierung von Freiwilligen; Verwaltung von Tagebüchern; Handhabung und Vorbereitung biologischer Proben; Bestimmung der Hauptkeimgruppen in den Stuhlproben durch kulturabhängige Methoden; meta-transkriptomische Charakterisierung ausgewählter Stuhlproben von Personen mit unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird das RU6 mit der Food Microbial Science Unit der University of Reading, Großbritannien, zusammenarbeiten, um die metatranskriptomische Plattform zu entwickeln und die erhaltenen Sequenzen für ihre Zuordnung zu KEGG- und COG-Clustern für funktionelle Aktivitäten bioinformatisch zu analysieren.
• RU7. Francesca Clementi ist die Leiterin von RU7. Wie ISI Web of Science berichtet, ist sie Autorin von 59 Publikationen, die 504 Mal zitiert wurden, mit einem Durchschnitt von 11,25 Zitationen pro Publikation und einem h-Index von 15. Das RU7 verfügt über eine vertrauenswürdige Expertise in Bezug auf die Rolle, Überwachung und Kontrolle von lebensmittelbedingten Mikroorganismen, insbesondere Milchsäurebakterien. Innerhalb dieses Projekts ist RU7 beteiligt an: Charakterisierung der Diversität der Lebensmittelmikrobiota durch PCR-DGGE; Bestimmung der Antibiotikaresistenz in Stuhl- und Speichelproben; Isolierung und Identifizierung von Antibiotika-resistenten Milchsäurebakterien aus Stuhl- und Speichelproben; Charakterisierung der an der mikrobiellen Antibiotikaresistenz beteiligten Gene; Untersuchung der Mechanismen zur Übertragung von Antibiotikaresistenzen zwischen Bakterien; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Innerhalb dieses Projekts wird das RU7 mit der griechischen Democritus University of Thrace, Griechenland, und mit dem Rowett Institute for Nutrition and Health der University of Aberdeen, Schottland, zusammenarbeiten, um übertragbare Antibiotika-Resistenzgene in Lebensmitteln zu untersuchen und Milchsäurebakterien zu isolieren aus Speichel- und Kotproben.
• RU8. Luca Simone Cocolin ist der Anführer von RU8. Wie Scopus berichtet, ist er Autor von 131 Publikationen, die 2.036 Mal zitiert wurden, was einen h-Index von 25 ergibt. Die RU 8 verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Anwendung kulturunabhängiger Methoden zur Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität und Vitalität in fermentierten Lebensmitteln. Es verfügt auch über Kenntnisse der quantitativen PCR (qPCR) zur Quantifizierung spezifischer Mikroorganismen aus komplexen Ökosystemen. Innerhalb dieses Projekts ist RU8 beteiligt an: Rekrutierung von Freiwilligen; Verwaltung von Tagebüchern; Handhabung und Vorbereitung biologischer Proben; Bestimmung der Hauptkeimgruppen in den Stuhlproben durch kulturabhängige Methoden; Profilierung der fäkalen Mikrobiota durch DGGE-Ansätze, die sowohl auf DNA- als auch auf RNA-Ebene angewendet werden; metagenomische Charakterisierung ausgewählter Kotproben von Personen mit unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Innerhalb dieses Projekts wird RU8 mit der Universität Maribor (UM), Slowenien, und der Democritus University of Thrace (DUT), Alexandroupolis, Griechenland, zusammenarbeiten, um Aspekte zu untersuchen, die sich mit der Interaktion von Pathogenen und Wirtszellen befassen, und für mögliche Modifikationen der Ernährung der verschiedenen Ernährungsgruppen, die die bekannte vorteilhafte Rolle bestimmter mikrobieller Gruppen, die jeweils mit bestimmten Nahrungsmitteln verbunden sind, am besten ausnutzen können.
• RU9. Mauro Rossi ist der Anführer von RU9. Wie ISI Web of Science berichtet, ist er Autor von 41 Publikationen mit einer Gesamtzahl von Zitationen von 1087 und einem h-Index von 19. Das RU9 verfügt über langjährige Erfahrung (>25 Jahre) und starke Kooperationen im Bereich der Biochemie und Immunologie des Dünndarms. Innerhalb dieses Projekts ist RU9 beteiligt an: Isolierung von Laktobazillen und Bifidobakterien aus Stuhlproben; Charakterisierung der In-vitro-Immunantwort von Fäkalisolaten unter Verwendung von Caco-2-Zellen; Charakterisierung der In-vitro-Immunantwort von Fäkalisolaten unter Verwendung dendritischer Zellen; Messung der Zytokinsekretion in Caco-2 und dendritischen Zellen; und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird RU9 mit der Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Spanien (Anlage in Modell B) zusammenarbeiten, um festzustellen, ob Besonderheiten in der fäkalen Mikrobiota eine Rolle bei der Entstehung von spielen könnten Störungen des Immunsystems im Darm.
• RU10. Lucia Vannini ist die Leiterin von RU10. Wie ISI Web of Science berichtet, ist sie Autorin von 27 Publikationen mit einer Gesamtzahl von Zitationen von 322 und einem h-Index von 9. Das RU10 hat sowohl im Bereich der Lebensmittelmikrobiologie als auch in der Anwendung instrumenteller Techniken, insbesondere der Kernspinresonanz, für die Metabolomanalyse biologischer Proben gute Erfahrungen gesammelt. Innerhalb dieses Projekts ist RU10 beteiligt an: Metabolomcharakterisierung ausgewählter Lebensmittel; Metabolomcharakterisierung von Speichelproben; Metabolomcharakterisierung von Stuhl- und Urinproben und statistische Aufbereitung der Ergebnisse. Im Rahmen dieses Projekts wird R10 mit dem Schwedischen Institut für Lebensmittel- und Biotechnologie, Schweden, und dem Institut für Chemische Technologie, Abteilung für Forschung und Entwicklung, Prag, Tschechische Republik, zusammenarbeiten, um jeweils Aspekte der metabolomischen Charakterisierung einiger ausgewählter Lebensmittel zu untersuchen biologische Proben. Der verwendete Kaskadenansatz macht jede Forschungsaktivität und jede RU unverzichtbar, um die Hauptziele des Projekts zu erreichen.

Diese Studie wird aus verschiedenen unten beschriebenen Aktivitäten (AI-VI) bestehen:

• TÄTIGKEIT I. Rekrutierung von Personen, Verwaltung von Tagebüchern, Handhabung, Aufbereitung und Lagerung biologischer Proben und mikrobiologische Analysen von Stuhlproben.
• AI.1. Rekrutierung von Einzelpersonen und Verwaltung von Tagebüchern (RU1, 4, 6, 8) Etwa 50 freiwillige Allesfresser, Vegetarier und Veganer für insgesamt 150 Probanden werden rekrutiert. Vegetarier und Veganer werden in Zusammenarbeit mit der Italienischen Wissenschaftlichen Gesellschaft rekrutiert der vegetarischen Ernährung. Omnivore-Individuen werden durch an den Universitäten veröffentlichte Anzeigen rekrutiert. Es werden etwa 50 gesunde Freiwillige rekrutiert, darunter etwa gleich viele Omnivoren, Vegetarier und Veganer (Alter 18-59 Jahre, Verhältnis Männer/Frauen ca. 1:1). Rekrutierte Freiwillige werden gebeten, ein Konsensdokument zu unterzeichnen, um ihre Ernährungsgewohnheiten aufzuzeichnen. Die Tagebücher werden ausgearbeitet, um detaillierte Informationen über Lebensmitteleigenschaften zu erhalten, was eine einfache Identifizierung der auf dem Markt befindlichen Produkte und eine Schätzung der angenommenen mikrobiellen Belastung ermöglicht. Die Ethikkommissionen der Universitäten werden vor Projektbeginn informiert.
• AI.2. Handhabung, Aufbereitung und Lagerung von biologischen Proben (RU1, 4, 6, 8). Jede Person liefert über einen Zeitraum von drei Wochen wöchentlich Speichel-, Kot- und Urinproben. Dreifache Proben werden vor den Analysen gepoolt, um die intraindividuelle Variabilität zu begrenzen. Je nach Art der biologischen Proben (Speichel, Kot, Urin) und anschließender Analysen (z. B. DNA, RNA, Proteom) wird unterschiedlich gehandhabt. Gleichzeitig mit der Rekrutierung von Personen und der Sammlung biologischer Proben werden die meisten EVU an der Einrichtung der Techniken/Methoden beteiligt sein.
• AI.3. Mikrobiologische Analysen von Kotproben (RU1, 4, 6, 8). In der ersten Zeit werden die lebensfähigen Zählungen durchgeführt, indem frisches Fäkalmaterial auf verschiedene selektive Kulturmedien plattiert wird, um die häufigsten fäkalen mikrobiellen Gruppen aufzuzählen.
• AI.4. Aufbau von Techniken/Methoden (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Gleichzeitig mit der Rekrutierung von Personen und der Sammlung biologischer Proben werden die meisten EVU an der Einrichtung der Techniken/Methoden beteiligt sein. Um eine unabhängige und wettbewerbsfähige Plattform für Meta-Omics-Analysen zu etablieren, wird RU3 Ausrüstung für die Hochdurchsatz-Sequenzierung erwerben, was eine wirtschaftliche Hauptinvestition in dieses Projekt darstellt.
• AKTIVITÄT II. Lebensmittelmikrobiota und Metabolom. Basierend auf den Informationen aus Ernährungstagebüchern werden die repräsentativsten Nahrungsmittel der 3 Diäten in 3 Kategorien eingeteilt: (i) niedrig (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) intermediär (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); und (iii) hohe mikrobielle Belastung (TBC ³ 10^6 cfu/g). Für Lebensmittel der Gruppe (i) wird die Keimzahl auf der Grundlage von Literaturdaten geschätzt. Für Lebensmittel der Gruppen (ii) und (iii) wird die Keimzahl bei bekannten Produkten mit geringer Marktdifferenzierung (z. B. Parmigiano Reggiano-Käse) anhand von Literaturdaten bestimmt, während bei diesen entsprechende Analysen durchgeführt werden Produkte mit großer Marktvariabilität (z. B. Mozzarella-Käse). Im letzteren Fall umfassen die Analysen eine große Anzahl von Produkten, die auf dem Markt verfügbar sind. Die mikrobielle Diversität von Lebensmitteln wird zunächst durch PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) und bei Bedarf durch Tiefensequenzierung auf Basis des Komplexitätsgrades und des aktuellen Wissensstandes über die Mikrobiota der spezifischen Lebensmittel vertieft untersucht.
• AII.1 Quantitative Bestimmung von Mikroorganismen in Lebensmitteln (RU 4, 5; 7). Die Analyse der Lebensmittel wird zwischen RU4 und 5 geteilt, und einige Proben werden von beiden RU analysiert, um die Ergebnisse gegenseitig zu validieren. Anschließend wird RU4 ausgewählte Lebensmittel mittels LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction)-Analyse charakterisieren und die Ergebnisse mit denen von RU7 mittels PCR-DGGE vergleichen. RU5 wird eine große Sammlung von Isolaten aus Lebensmitteln identifizieren, um mögliche Zusammenhänge mit einer reduzierten antigentoxischen Aktivität der Fäkalien und dem Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen in den aufgenommenen Lebensmitteln zu finden.
• AII.2 Mikrobielle Vielfalt in Lebensmitteln (RU 2, 3). Erstens betrachtet diese Aktivität schlecht charakterisierte Lebensmittel, die speziell von Vegetariern und Veganern gegessen werden, basierend auf Aufzeichnungen aus Tagebüchern. Sowohl Mikro- als auch Mikrobiota werden untersucht. PCR-DGGE-Analysen für Hefen und Fadenpilze basieren auf der Amplifikation von Teilen der D1/D2-Domäne, die für die Untereinheit LSU oder 26S der rRNA und der ITS-Regionen (Internal transcribed spacer) kodieren. Die V3-Region des 16S-rRNA-Gens wird zum Nachweis von Bakterien anvisiert. Nach der DGGE-Analyse werden die resultierenden Gele digitalisiert und mit der Software Bionumerics analysiert. Dendrogramme werden einer Clusteranalyse unterzogen, um Proben mit einem Ähnlichkeitskoeffizienten von 85 % von der weiteren Sequenzierung auszuschließen; Eine solche Auswahl spart Kosten für die Sequenzierung der nächsten Generation und stellt sicher, dass eine überschaubare Menge an Daten zur Analyse mittels Bioinformatik erhalten wird. RU3 führt die Tiefensequenzierung unter Verwendung von Bibliotheken von Amplikons variabler Gene von taxonomischem Interesse und unter Verwendung spezifischer Verfahren entsprechend der Art der zu erwerbenden Sequenzierungsplattform durch. Die Sequenzierungsergebnisse werden vom RU2 bioinformatisch aufbereitet.
• AII.3 Lebensmittelmetabolom (RU 10). Basierend auf den Informationen zu den Ernährungsgewohnheiten werden die in den drei Ernährungsweisen am stärksten vertretenen fermentierten Lebensmittel analysiert, um einen möglichen Zusammenhang zwischen aufgenommenen chemischen Verbindungen (z. B. Salicylsäure) und mutmaßlich in biologischen Proben gefundenen Verbindungen zu finden. Die Metabolomanalysen werden mittels GC-MS/SPME (Gaschromatographie-Massenspektrometrie/Festphasen-Mikroextraktion) und FTIR-Spektroskopie (Fourier-Transformations-Infrarot) durchgeführt.
• AKTIVITÄT III. Die Mikrobiota von Kot und Speichel. Vorläufig wurden alle Speichel- und Kotproben von allen ca. 150 Freiwillige werden PCR-DGGE-Analysen unterzogen, um sich einen Überblick über die mikrobielle Vielfalt zu verschaffen. RT-PCR-DGGE (Real Time-Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) wird ebenfalls in Betracht gezogen, um lebensfähige Populationen im Kot abzuschätzen. Basierend auf diesen Analysen werden repräsentative Proben jeder Ernährungsgewohnheit einer Sequenzierung der nächsten Generation unterzogen. Die Ausgabe all dieser Ergebnisse sollte Schritt für Schritt die Auswahl von 4/5 Kotproben für jede der drei Diäten ermöglichen, die Meta-Omics-Analysen unterzogen werden sollen.
• AKTIVITÄT III.1. Studium der Biodiversität.
• AIII.1.1. PCR-DGGE-Profilierung (RU 2, 3, 8) PCR-DGGE-Analysen für Hefen und Fadenpilze zielen auf 26S-rRNA und ITS-Regionen ab, während V3- und/oder V6-V8-Regionen der 16S-rRNA auf Bakterien untersucht werden. Sowohl DNA als auch RNA (nach RT-PCR) werden als Ziel verwendet, um die gesamten bzw. lebensfähigen Populationen zu untersuchen. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen wird RU3 die bakterielle Diversität von Speichelproben charakterisieren. Nach DGGE-, Bild- und Clusteranalysen von DNA- und RNA-Proben wird es möglich sein, einen Unterschied zwischen der globalen und der lebensfähigen Population zu definieren. Die Dendrogramme der Ähnlichkeit werden verwendet, um Proben mit einem Ähnlichkeitskoeffizienten von ³ 85 % von der weiteren Sequenzierung auszuschließen; Eine solche Auswahl spart Kosten für die Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation und stellt sicher, dass eine überschaubare Menge an Daten zur Analyse mittels Bioinformatik erhalten wird.
• AIII.1.2. Sequenzierung der nächsten Generation (RU 3, 8) Die Tiefensequenzierung ausgewählter Speichel- und Stuhlproben wird unter Verwendung von Bibliotheken von Amplikons variabler Gene von taxonomischem Interesse durchgeführt. Alle gewonnenen Sequenzierungsergebnisse sowohl für Bakterien als auch für Pilze werden vom RU2 bioinformatisch aufbereitet.
• AIII.1.3. Antibiotikaresistenz (RU 7) DNA, die direkt aus Speichel- und Kotproben extrahiert wird, wird auf das Vorkommen von Genen untersucht, die für Resistenzen gegen mehrere Antibiotika mit PCR-Assays kodieren. Proben, die sich als positiv für Antibiotikaresistenzgene (AR) erwiesen haben, werden verwendet, um antibiotikaresistente Laktobazillen, Laktokokken und Enterokokken zu isolieren. Nach der Identifizierung werden Isolate, die Werte der minimalen Hemmkonzentration (MHK) aufweisen, die höher sind als die entsprechenden Grenzwerte, durch PCR-Amplifikation der entsprechenden AR-Gene bestätigt. Die Möglichkeit, auf genetischen mobilen Elementen lokalisierte AR-Gene von Isolaten auf Bakterien von klinischem Interesse zu übertragen, wird durch Konjugationsversuche evaluiert.
• AIII.2. Meta-Omics-Analysen ausgewählter Kotproben Gemäß dem Kaskadenansatz werden die Ergebnisse aus der Untersuchung der mikrobiellen Diversität von Kotproben 4/5 Personen auswählen, die repräsentativ für jede der 3 Ernährungsarten sind (4/5 x 3 = 12/ 15) Meta-Omics-Analysen unterzogen werden. Die Meta-Omics-Ansätze werden eine interne Datenbank bereitstellen, die aus den DNA- und RNA-Sequenzen aus den fäkalen Mikrobiomen der 12/15-Individuen besteht, die einen vollständigen Überblick über die synthetisierten Proteine ​​ermöglichen.
• AIII.2.1. Metagenomik (RU3, 8) Fäkale DNA wird quantifiziert und ein Shotgun-Sequenzierungsprotokoll wird für die metagenomische Analyse angewendet. Diese Aufgabe soll je nach Leistungsfähigkeit und Verfügbarkeit der Sequenzierungsplattform vom RU3 übernommen werden, das sich hauptberuflich mit der Analyse von DNA- und cDNA-Amplifikaten aus Kot und Speichel beschäftigt. Alternativ übernehmen spezialisierte Unternehmen diese Aufgabe als Dienstleistung.
• AIII.2.2. Metatranskriptomik (RU 6) Das gesamte mikrobielle Genexpressionsprofil wird mit einem innovativen Illumina-basierten Metatranskriptomik-Ansatz und dem in den ersten Monaten des Projekts erstellten Protokoll charakterisiert. cDNA wird nach optimierten Verfahren aus RNA synthetisiert. Es wird eine zufällige Amplifikation der cDNA durchgeführt und die cDNA wird mithilfe der Illumina HiSeq-Plattform sequenziert. Die sequenzierten Meta-Transkriptome werden unter Verwendung von Velvet/MetaVelvet- oder SOAPdenovo-Paketen zusammengesetzt, um die größtmögliche Konsensussequenz zu erreichen. Die Transkriptsequenzen werden mit etablierten Pipelines annotiert und Transkripte werden mit RPS-BLAST (Reversed Position Specific-Basic Local Alignment Search Tool) gegen KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) und durchsucht die Genbank-Datenbanken. Durch nr BLASTX identifizierte bakterienähnliche Reads werden weiter gegen die COG-Datenbank durchsucht. Die funktionalen Rollen der Sequenzen werden basierend auf den KEGG- und COG-Suchen zugewiesen.
• AIII.2.3. Meta-Proteomik (RU1) Basierend auf dem Arbeitsablauf, der in den ersten Monaten der Aktivität entwickelt wurde, werden Proteine ​​aus jeder Stuhlprobe extrahiert und durch gelfreie und/oder gelbasierte Proteomik analysiert. Die Identifizierung von Peptiden wird mit dem Massenspektrometer Finnigan LCQ Deca XP MAX durchgeführt. Es wird eine differentielle proteomische Analyse durchgeführt. Zur Peptididentifizierung wird der Open Mass Spectra Search Algorithm verwendet, um MS/MS-Spektren anhand der verfügbaren Datenbanken zu durchsuchen. Um weitere funktionelle Informationen zu erhalten, werden die Proteine ​​basierend auf der COG-Klassifikation annotiert. Die identifizierten COGs werden in der KEGG-Stoffwechselwegdatenbank abgebildet und durch die Online-Anwendung von iPath visualisiert. Nach der FDR-Korrektur werden alle identifizierten Peptide gegen UniProtKB durchsucht und dann kartiert. Um die höchste funktionelle Ebene aller identifizierten Proteine ​​zu adressieren, werden die identifizierten COGs auf KEGG-Signalwegen abgebildet. Neben dem gemeinsamen mikrobiellen Kern werden interindividuelle und ernährungsphysiologische Unterschiede in Bezug auf die Stoffwechselfunktion ermittelt.
• AKTIVITÄT IV. Funktionale Charakterisierung. Die Charakterisierung einiger funktioneller Merkmale von Stuhlproben und von mikrobiellen Isolaten aus Stuhlproben wird die Verbindung zwischen Ernährung und Darmmikrobiota stärken.
• AIV.1 Fäkale genotoxische und antigentoxische Aktivitäten (RU 5) Proben von Fäkalwasser (FW) werden vorbereitet und die Genotoxizität wird durch Comet-Assay bestimmt. Die HT29-Enterozyten (10^6 Zellen/Assay), die gleichzeitig FW ausgesetzt und in einen LMA-Objektträger eingebaut wurden, werden einer Einzelzell-Gelelektrophorese (SCGE) unterzogen und durch Epifluoreszenz analysiert. Mehrere mikrobielle Isolate aus Lebensmitteln werden auf ihre Hemmaktivität gegenüber genotoxischen und mutagenen Verbindungen untersucht, die möglicherweise im Darm vorhanden sind. Die Wirkung der Mikroorganismus-Genotoxin-Co-Inkubation wird durch die Bewertung der genotoxischen Restaktivität der Verbindungen mit dem SOS-Chromotest (Target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) und parallel dazu dem Comet-Assay (Target Enterozyten HT29 ).
• AIV.2. Fäkale Mikroorganismen und Modulation der Immunantwort (RU 9) Die Bedingungen für das Wachstum und die Differenzierung von dendritischen Zellen (DC) und Caco-2-Zellen werden innerhalb der ersten Monate der Aktivität geschaffen. Laktobazillen und Bifidobakterien werden aus allen Stuhlproben isoliert und als bestrahlte Bakterien verwendet, um die Expression von Immunmediatoren in Enterozyten nachzuweisen. Transkript- und verwandte Proteinsekretionsspiegel von IL-8 und tolerogenem TGF-beta (transformierender Wachstumsfaktor beta) und TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin) werden bestimmt. Bestrahlte Bakterien werden auch verwendet, um Oberflächenmarker in DC-Zellen zu stimulieren. Gesamt-RNA wird aus den Caco-2- und DC-Zellen extrahiert und cDNA wird präpariert, um die relative Genexpression von IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alpha, IL-12p40 und IL-10 zu untersuchen; die Konzentration der entsprechenden Genprodukte wird mittels ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) bestimmt.
• AKTIVITÄT V. Metabolom von Speichel, Stuhl und Urin (RU10). Um den „omics“-Ansatz zu vervollständigen, wird das Metabolom von Kot-, Urin- und Speichelproben mit drei Techniken analysiert (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) und NMR (Nuclear Magnetic Resonance) gemäß den zuvor erstellten Protokollen. Chemische Verbindungen werden unter Verwendung von Massenspektrendatenbanken sowie Massenspektrendaten in der Literatur und/oder Daten von reinen chemischen Verbindungen identifiziert. Nach dem Auftauen von Urin- und Speichelproben wird die NMR-Analyse innerhalb von 2 h durchgeführt. Kotproben werden präpariert, wobei der vollständigen Rückgewinnung wasserlöslicher Moleküle größte Bedeutung beigemessen wird. Die NMR-Spektren werden für die statistische Analyse vorbereitet, indem die Fehlausrichtungen der kleinen Peaks durch den iCoshift-Algorithmus korrigiert werden.
• AKTIVITÄT VI. Statistische Aufbereitung der Ergebnisse (alle EVU). Während der Projektentwicklung kümmert sich RU2 in Zusammenarbeit mit dem Partner CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL) um die Pflege der Website, die Website wird alle Ergebnisse aus den verschiedenen Forschungsaktivitäten sammeln. Diese Datenbank wird für die Analyse im "R-Modus" verwendet, um den Einfluss verschiedener Deskriptoren bei der Bestimmung der Diversität der drei Diäten zu bewerten, und im "Q-Modus", um den Unterschied zwischen den drei Diäten zu bestimmen. Gleichzeitig werden die relevantesten Ergebnisse durch wissenschaftliche Veröffentlichungen in Fachzeitschriften verbreitet.

Unter Berücksichtigung des zu untersuchenden Themas hat dieses Projekt zweifellos potenzielle Aspekte angewendet. Beispielsweise könnte das Wissen um die Auswirkungen der Ernährung auf die menschliche Mikrobiota zur Ausarbeitung geeigneter Leitlinien führen, die in Kampagnen zur Förderung der integrierten Versorgung verteilt werden. Verbraucherpräferenzen, Einstellungen, Bedürfnisse, Verhalten, Lebensstil und Bildung werden berücksichtigt, und die Kommunikation zwischen Verbrauchern und der Lebensmittelkettenforschungsgemeinschaft wird verbessert, um fundierte Entscheidungen und ihre Auswirkungen auf die Lebensqualität zu verbessern. Die Befähigung von Einzelpersonen, ihre Gesundheit durch richtige Ernährungsgewohnheiten zu verbessern und zu verwalten, wird zu Kosteneinsparungen für die Gesundheitssysteme führen.