Mikrobiota a související metabolom ve stravě všežravců, vegetariánů nebo veganů (MRMOVVD)

Celkovým cílem tohoto projektu je najít vztah mezi stravou a slinami a fekální mikroflórou pomocí vysoce výkonných a integrovaných meta-omických (genomických, transkriptomických, proteomických a metabolomických) analýz. V této souvislosti se stále diskutuje o několika otázkách. Jaký je například denní příjem mikrobů a jejich role v rovnováze střevní mikroflóry? Jak je střevní mikrobiota ovlivněna hlavními druhy stravy (všežravá, vegetariánská a veganská)? Jaké jsou převládající mikrobiální skupiny na úrovni střev v závislosti na typu stravy? Jaký je předpokládaný příspěvek každé mikrobiální skupiny k udržení zdraví hostitele? Kvantitativní a kvalitativní stanovení hlavních mikrobiálních skupin obsažených v potravinách v závislosti na stravovacích návycích odpovídá na předchozí otázku a shoduje se s jedním z cílů tohoto projektu. Odhad diverzity (genomika), funkční aktivity (transkriptomika a proteomika) a metabolitů (metabolomika) zejména fekální mikrobioty se shoduje s holistickým přístupem tohoto projektu a odpovídá na několik dřívějších otázek. Vzhledem k úzké korelaci mezi rovnováhou různých mikrobiálních populací v různých nikách lidského těla a nástupem metabolických patologií by tento projekt měl poskytnout nové poznatky, které mohou upozornit na možné vztahy mezi stravou a dismetabolismy. Dietu je třeba považovat za nejvhodnější a nenákladný nástroj k určení stabilní a příznivé ústní a střevní mikroflóry, která předchází nemocem a zaručuje lidskou dlouhověkost. Těchto celkových cílů projektu bude dosaženo na základě specifických cílů, jako jsou: i) identifikace biologických, molekulárních a metabolických markerů specifických pro daný typ stravy; ii) odhad rozdílů v mikrobiotě a metabolomu slin a výkalů, jak mezi jednotlivci, tak mezi typy stravy; iii) odhad kvalitativních a kvantitativních rozdílů v mikrobiálním příjmu v souvislosti s typem stravy; a iv) identifikaci funkčních znaků vzorků stolice souvisejících s typem stravy, které lze považovat za indikátory náchylnosti k onemocnění.

S cílem dosáhnout celkového cíle tohoto projektu je do návrhu zapojeno deset výzkumných jednotek (RU; RU1-10) s partnerstvím 16 národních a zejména zahraničních institucí, které pokrývají 12 různých zemí. Vedoucí jednotlivých RU jsou uvedeni níže:

• RU1. Marco Gobbetti je hlavním řešitelem návrhu a vedoucím RU1. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 188 publikací, které byly citovány 4 075krát, s průměrem citací na publikaci 21,68 a h indexem 39. Nedávno byl zařazen do žebříčku Top Italian Scientists podle VIA Academy (roční hodnocení pro vědce s hodnotou h-indexu vyšší než 30). RU1 získala dobré zkušenosti se studiem střevní mikrobioty celiaků a s proteomikou aplikovanou na bakterie mléčného kvašení a potraviny. RU1 bude plnit roli koordinátora projektu. V rámci tohoto projektu se RU1 podílí na: náboru dobrovolníků; správa deníků; manipulace a příprava biologických vzorků; stanovení hlavních mikrobiálních skupin ve vzorcích stolice metodami závislými na kultuře; metaproteomická charakterizace vybraných vzorků stolice od jedinců s odlišnými stravovacími návyky; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU1 spolupracovat s Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Španělsko, na specifickém přiřazování funkčních aktivit a/nebo metabolických drah identifikovaným proteinům a s oddělením Mikrobiologie University College Cork, Irsko, za bioinformatický přístup ke studiu proteomu.
• RU2. Gianluigi Cardinali je vůdcem RU2. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 38 publikací s h indexem 11. RU2 působí přibližně dvacet let v oblasti biodiverzity a taxonomie kvasinek, které jsou analyzovány pomocí mikrobiologických a molekulárních technik. V rámci tohoto projektu se RU2 podílí na: charakterizaci diverzity potravní mikrobioty prostřednictvím přístupu PCR-DGGE; charakterizace mikobioty vzorků stolice pomocí přístupu PCR-DGGE; a jako vedoucí v řízení statistického zpracování výsledků ze všech RU, poskytování společné databáze. RU2 bude na bioinformatickém zpracování dat spolupracovat s Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Nizozemsko.
• RU3. Danilo Ercolini je lídrem RU3. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 58 publikací s celkovým počtem citací 1 354 a h indexem 21. RU3 se již léta zabývá studiem mikrobiální ekologie komplexních ekosystémů, zejména potravních ekosystémů. Potravinová mikroflóra byla vždy studována pokročilými molekulárními přístupy a metodami nezávislými na kultuře, které nevyžadují kultivaci mikroorganismů na syntetických médiích. V rámci tohoto projektu se RU3 zabývá: charakterizací diverzity mikrobioty ve vzorcích slin; hluboké sekvenování vybraných vzorků potravin; hluboké sekvenování vybraných vzorků stolice a slin; metagenomická charakterizace vybraných vzorků stolice od jedinců s odlišnými stravovacími návyky; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU3 spolupracovat s projektem Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) který je provozován v Argonne National Laboratory, Lemont, Spojené státy americké, za účelem vytvoření datových souborů popisujících mikroorganismy z široké škály ekosystémů.
• RU 4. Erasmo Neviani je lídrem RU4. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 111 publikací s celkovým počtem citací 1 508 a h indexem 22. RU4 získala dobré zkušenosti v potravinářské mikrobiální ekologii pro komplexní a integrované hodnocení mikrobiálních populací, dynamiky a fyziologického stavu buněk v různých fázích výroby potravin. V rámci tohoto projektu se RU4 podílí na: přípravě deníků; nábor dobrovolníků; správa deníků; manipulace a příprava biologických vzorků; stanovení hlavních mikrobiálních skupin ve vzorcích stolice metodami závislými na kultuře; vypracování výsledků z deníků; stanovení hlavních mikrobiálních skupin v potravinách metodami závislými na kultuře a nezávislými na kultuře; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU4 spolupracovat s Katedrou potravinářské vědy a technologie Zemědělské univerzity v Aténách, Řecko, na mikrobiálním stanovení v potravinách a zejména v mléčných výrobcích, s Epidemiologickou jednotkou Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori z Milána v Itálii za pomoc při zaznamenávání stravovacích návyků a Národnímu ústavu pro výzkum potravin a výživy v Římě v Itálii za sledování domnělých nedostatků souvisejících s restriktivními dietními režimy.
• RU5. Aldo Corsetti je lídrem RU5. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 81 publikací s celkovým počtem citací 2 084 a h indexem 28. RU5 získala dobré zkušenosti v oblasti mikrobiální ekologie potravin a nápojů a také v oblasti charakterizace kmenů pro biotechnologické a funkční aspekty, aby bylo možné vybrat startovací kultury pro různé aplikace. V rámci tohoto projektu se RU5 podílí na: stanovení hlavních mikrobiálních skupin v potravinách pomocí metod závislých na kultuře; identifikace a typizace mikrobiálních bakterií izolovaných z potravin; charakterizace genotoxicity vzorků stolice; charakterizace antigenotoxigenní aktivity mikrobiálních izolátů z potravin; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU5 spolupracovat s Katedrou zemědělství, potravinářství a výživy, University of Alberta, Kanada, na molekulární typizaci mikroorganismů izolovaných v potravinách pomocí sekvenování typu multilocus.
• RU6. Patrizia Brigidi je lídrem RU6. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorkou 102 publikací, které byly citovány 3 158krát, s průměrem citací na publikaci 32,41 a h indexem 26. RU6 má konsolidovanou a širokou kompetenci v oblasti identifikace a molekulární kvantifikace bakterií z komplexních ekosystémů (výkaly a střevní biopsie) a v oblasti molekulárních mechanismů odpovědných za zdravotní přínosy bakterií. V rámci tohoto projektu se RU6 podílí na: náboru dobrovolníků; správa deníků; manipulace a příprava biologických vzorků; stanovení hlavních mikrobiálních skupin ve vzorcích stolice metodami závislými na kultuře; meta-transkriptomická charakterizace vybraných vzorků stolice od jedinců s odlišnými stravovacími návyky; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU6 spolupracovat s Food Microbial Science Unit, University of Reading, Spojené království, na vývoji metatranskriptomické platformy a při bioinformatické analýze získaných sekvencí pro jejich přiřazení do KEGG a COG clusteru funkčních aktivit.
• RU7. Francesca Clementi je lídrem RU7. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorkou 59 publikací, které byly citovány 504krát, s průměrem citací na publikaci 11,25 a h indexem 15. RU7 má důvěryhodné odborné znalosti týkající se úlohy, monitorování a kontroly potravinových mikroorganismů, zejména bakterií mléčného kvašení. V rámci tohoto projektu se RU7 podílí na: charakterizaci diverzity potravinové mikrobioty pomocí PCR-DGGE; stanovení antibiotické rezistence ve vzorcích stolice a slin; izolace a identifikace bakterií mléčného kvašení odolných vůči antibiotikům ze vzorků stolice a slin; charakterizace genů zapojených do mikrobiální antibiotické rezistence; studium mechanismů přenosu antibiotické rezistence mezi bakteriemi; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU7 spolupracovat s řeckou Democritus University of Thrace, Řecko a s Rowett Institute for Nutrition and Health of the University of Aberdeen, Scotland, na výzkumu přenosných genů antibiotické rezistence v potravinách a izolovaných bakteriích mléčného kvašení. ze vzorků slin a stolice.
• RU8. Luca Simone Cocolin je lídrem RU8. Jak uvádí Scopus, je autorem 131 publikací, které byly citovány 2 036krát, což má za následek h index 25. RU 8 má rozsáhlé zkušenosti s aplikací kulturně nezávislých metod pro studium mikrobiální biodiverzity a vitality ve fermentovaných potravinách. Má také znalosti o kvantitativní PCR (qPCR) pro kvantifikaci specifických mikroorganismů z komplexních ekosystémů. V rámci tohoto projektu se RU8 podílí na: náboru dobrovolníků; správa deníků; manipulace a příprava biologických vzorků; stanovení hlavních mikrobiálních skupin ve vzorcích stolice metodami závislými na kultuře; profilování fekální mikroflóry přístupy DGGE aplikovanými na úrovni DNA i RNA; metagenomická charakterizace vybraných vzorků stolice od jedinců s odlišnými stravovacími návyky; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU8 spolupracovat s University of Maribor (UM), Slovinsko, a Democritus University of Thrace (DUT), Alexandroupolis, Řecko, na aspektech zabývajících se interakcí patogenů a hostitelských buněk a na možných modifikacích dieta různých dietních skupin, která může nejlépe využít známou prospěšnou roli určitých mikrobiálních skupin spojených s konkrétními potravinami, resp.
• RU9. Mauro Rossi je lídrem RU9. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorem 41 publikací s celkovým počtem citací 1087 a h indexem 19. RU9 má dlouholeté zkušenosti (>25 let) a silnou spolupráci v oblasti biochemie a imunologie tenkého střeva. V rámci tohoto projektu se RU9 podílí na: izolaci laktobacilů a bifidobakterií ze vzorků stolice; charakterizace in vitro imunitní reakce fekálních izolátů pomocí Caco-2 buněk; charakterizace in vitro imunitní reakce fekálních izolátů pomocí dendritických buněk; měření sekrece cytokinů v Caco-2 a dendritických buňkách; a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude RU9 spolupracovat s Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Španělsko (příloha v modelu B), aby zjistila, zda by zvláštnosti fekální mikrobioty mohly hrát roli při nástupu onemocnění. střevní imunitní dysfunkce.
• RU10. Lucia Vannini je lídrem RU10. Jak uvádí ISI Web of Science, je autorkou 27 publikací s celkovým počtem citací 322 a h indexem 9. RU10 má dobré zkušenosti jak v oblasti potravinářské mikrobiologie, tak v použití instrumentálních technik, zejména nukleární magnetické rezonance, pro metabolomovou analýzu biologických vzorků. V rámci tohoto projektu se RU10 podílí na: metabolomové charakterizaci vybraných potravin; metabolomová charakterizace vzorků slin; metabolomová charakterizace vzorků stolice a moči a statistické zpracování výsledků. V rámci tohoto projektu bude R10 spolupracovat se Švédským institutem pro potraviny a biotechnologie, Švédsko, a VŠCHT, oddělením výzkumu a vývoje, Praha, Česká republika na aspektech týkajících se metabolomické charakterizace některých vybraných potravin a biologické vzorky. Použitý kaskádový přístup učiní každou výzkumnou činnost a každou RU nepostradatelnou pro dosažení hlavních cílů projektu.

Tato studie se bude skládat z různých aktivit (AI-VI) popsaných níže:

• ČINNOST I. Nábor osob, vedení deníků, manipulace, příprava a skladování biologických vzorků a mikrobiologické rozbory vzorků stolice.
• AI.1. Nábor jednotlivců a administrace deníků (RU1, 4, 6, 8) Bude přijato asi 50 všežravých, vegetariánských a veganských dobrovolníků, celkem 150 subjektů. Vegetariáni a vegani budou vybráni ve spolupráci s Italskou vědeckou společností vegetariánské výživy. Všežravci budou přijímáni prostřednictvím inzerátů zveřejněných na univerzitách. Bude přijato asi 50 zdravých dobrovolníků, včetně přibližně stejného počtu všežravců, vegetariánů a veganů (věk 18-59 let, poměr muži/ženy cca. 1:1). Najatí dobrovolníci budou požádáni, aby podepsali dokument o konsensu, aby zaznamenali své stravovací návyky. Deníky budou zpracovány tak, aby získaly podrobné informace o vlastnostech potravin, což umožní snadnou identifikaci produktů na trhu a odhad předpokládané požité mikrobiální zátěže. Etická komise vysokých škol bude informována před zahájením projektu.
• AI.2. Manipulace, příprava a skladování biologických vzorků (RU1, 4, 6, 8). Každý jedinec bude dodávat vzorky slin, výkalů a moči týdně po dobu tří týdnů. Triplikátní vzorky budou před analýzou spojeny, aby se omezila intraindividuální variabilita. Manipulace bude probíhat odlišně v závislosti na typu biologických vzorků (sliny, stolice, moč) a následných analýzách (např. DNA, RNA, proteom). Současně s náborem jedinců a odběrem biologických vzorků bude většina RU zapojena do nastavení technik/metod.
• AI.3. Mikrobiologické rozbory vzorků stolice (RU1, 4, 6, 8). Poprvé budou počty životaschopných zvířat provedeny nanesením čerstvého fekálního materiálu na různá selektivní kultivační média, aby se vyjmenovaly nejběžnější fekální mikrobiální skupiny.
• AI.4. Nastavení technik/metod (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Současně s náborem jedinců a odběrem biologických vzorků bude většina RU zapojena do nastavení technik/metod. Za účelem vytvoření nezávislé a konkurenceschopné platformy pro meta-omické analýzy RU3 zakoupí zařízení pro vysokovýkonné sekvenování, což je hlavní ekonomická investice do tohoto projektu.
• AKTIVITA II. Potravinová mikroflóra a metabolom. Na základě informací z dietních deníků budou nejreprezentativnější potraviny ze 3 diet rozděleny do 3 kategorií: (i) nízká (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) meziprodukt (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); a (iii) vysoká (TBC 3 10^6 cfu/g) mikrobiální zátěž. U potravin skupiny (i) bude mikrobiální počet odhadnut na základě údajů z literatury. U potravin skupin (ii) a (iii) bude mikrobiální číslo stanoveno na základě údajů z literatury v případě dobře známých produktů s nízkou tržní diferenciací (např. sýr Parmigiano Reggiano), zatímco v případě produkty s velkou variabilitou trhu (např. sýr Mozzarella). V druhém případě budou analýzy zahrnovat velké množství produktů dostupných na trhu. Mikrobiální diverzita potravin bude hlouběji studována nejprve pomocí PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel elektroforéza) a v případě potřeby hlubokým sekvenováním na základě úrovně složitosti a současných znalostí mikrobioty konkrétních potravin.
• AII.1 Kvantitativní stanovení mikroorganismů v potravinách (RU 4, 5; 7). Analýza potravin bude sdílena mezi RU4 a 5 a některé vzorky budou analyzovány oběma RU za účelem vzájemného ověření výsledků. Následně bude RU4 charakterizovat vybrané potraviny analýzou LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) a výsledky budou porovnány s výsledky získanými RU7 pomocí PCR-DGGE. RU5 identifikuje velkou sbírku izolátů z potravin s cílem nalézt možné souvislosti se sníženou antigenotoxickou aktivitou fekálních vod a přítomností specifických mikroorganismů v požitých potravinách.
• AII.2 Mikrobiální diverzita v potravinách (RU 2, 3). Za prvé, tato aktivita bude zvažovat špatně charakterizovaná jídla, která specificky jedí veregetariáni a vegani na základě záznamů z deníků. Bude zkoumána jak mikrobiota, tak mikrobiota. PCR-DGGE analýzy pro kvasinky a vláknité houby budou založeny na amplifikaci částí domény D1/D2 kódující podjednotku LSU nebo 26S rRNA a oblastí ITS (Internal transcribed spacer). Oblast V3 genu 16S rRNA bude zaměřena na detekci bakterií. Po analýze DGGE budou výsledné gely digitalizovány a analyzovány softwarem Bionumerics. Dendrogramy budou podrobeny shlukové analýze, aby se z dalšího sekvenování vyloučily vzorky s koeficientem podobnosti 85 %; takový výběr ušetří náklady na sekvenování příští generace a zajistí získání zvládnutelného množství dat k analýze pomocí bioinformatiky. RU3 provede hluboké sekvenování pomocí knihoven amplikonů variabilních genů taxonomického zájmu a za použití specifických postupů podle typu sekvenační platformy, která bude zakoupena. Výsledky sekvenování budou zpracovány na bioinformatickém základě RU2.
• AII.3 Metabolom potravy (RU 10). Na základě informací o stravovacích návycích budou analyzovány fermentované potraviny nejvíce zastoupené ve třech dietách, aby se našel možný vztah mezi požitými chemickými sloučeninami (např. kyselina salicylová) a pravděpodobně získanými v biologických vzorcích. Metabolomové analýzy budou prováděny pomocí GC-MS/SPME (plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie / mikroextrakce na pevné fázi) a FTIR (Fourier Transform Infrared) spektroskopie.
• AKTIVITA III. Mikrobiota výkalů a slin. Předběžně byly všechny vzorky slin a stolice ze všech cca. 150 dobrovolníků bude podrobeno PCR-DGGE analýzám, aby získali přehled o mikrobiální diverzitě. RT-PCR-DGGE (Real Time- Polymerázová řetězová reakce- Denaturační gradientová gelová elektroforéza) bude také zvažována k odhadu životaschopných populací ve stolici. Na základě těchto analýz budou reprezentativní vzorky každého stravovacího návyku podrobeny sekvenování nové generace. Výstup všech těchto výsledků by měl umožnit krok za krokem výběr 4/5 vzorků stolice pro každou ze tří diet, které mají být podrobeny meta-omickým analýzám.
• ČINNOST III.1. Studium biodiverzity.
• AIII.1.1. Profilování PCR-DGGE (RU 2, 3, 8) Analýzy PCR-DGGE pro kvasinky a vláknité houby se zaměří na oblasti 26S rRNA a ITS, zatímco oblasti V3 a/nebo V6-V8 16S rRNA budou studovány pro bakterie. Jak DNA, tak RNA (po RT-PCR) budou použity jako cíl pro zkoumání celkových a životaschopných populací. Za stejných experimentálních podmínek bude RU3 charakterizovat bakteriální diverzitu vzorků slin. Po DGGE, obrazových a shlukových analýzách ze vzorků DNA a RNA bude možné definovat rozdíl mezi globální a životaschopnou populací. Dendrogramy podobnosti budou použity k vyloučení z další sekvenační aktivity těch vzorků, které mají koeficient podobnosti ³ 85 %; takový výběr ušetří náklady na sekvenační analýzy příští generace a zajistí získání zvládnutelného množství dat k analýze prostřednictvím bioinformatiky.
• AIII.1.2. Sekvenování nové generace (RU 3, 8) Hluboké sekvenování vybraných vzorků slin a stolice bude provedeno pomocí knihoven amplikonů variabilních genů taxonomického zájmu. Všechny výsledky sekvenování získané jak pro bakterie, tak pro houby budou zpracovány na bioinformatickém základě RU2.
• AIII.1.3. Rezistence na antibiotika (RU 7) DNA extrahovaná přímo ze vzorků slin a stolice bude testována na výskyt genů kódujících rezistenci k několika antibiotikům pomocí PCR testů. Vzorky, které byly pozitivní na geny antibiotické rezistence (AR), budou použity k izolaci laktobacilů, laktokoků a enterokoků rezistentních na antibiotika. Po identifikaci budou izoláty vykazující hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) vyšší než odpovídající breakpointy potvrzeny PCR amplifikací odpovídajících AR genů. Možnost přenosu AR genů lokalizovaných na genetických mobilních elementech z izolátů do bakterií klinického zájmu bude hodnocena konjugačními testy.
• AIII.2. Metaomické analýzy vybraných vzorků stolice Podle kaskádového přístupu budou výsledky studia mikrobiální diverzity vzorků stolice vybrány 4/5 jedinců reprezentujících každý ze 3 typů stravy (4/5 x 3 = 12/ 15), které mají být podrobeny meta-omickým analýzám. Meta-omické přístupy poskytnou vlastní databázi, sestávající ze sekvencí DNA a RNA z fekálních mikrobiomů 12/15 jedinců, což umožní úplný pohled na syntetizované proteiny.
• AIII.2.1. Metagenomika (RU3, 8) Fekální DNA bude kvantifikována a pro metagenomickou analýzu bude použit protokol sekvenování pomocí brokovnice. Tento úkol by měl provádět RU3 v závislosti na výkonu a dostupnosti sekvenační platformy, která se bude na plný úvazek věnovat analýze amplikonů DNA a cDNA stolice a slin. Případně tento úkol provedou specializované firmy jako službu.
• AIII.2.2. Meta-transkriptomika (RU 6) Celkový profil mikrobiální genové exprese bude charakterizován pomocí inovativního metatranskriptomického přístupu založeného na Illumina a protokolu nastaveného během prvních měsíců projektu. cDNA bude syntetizována z RNA podle optimalizovaných postupů. Bude provedena náhodná amplifikace cDNA a cDNA bude sekvenována pomocí platformy Illumina HiSeq. Sekvenované meta-transkriptomy budou sestaveny dohromady pomocí balíčků Velvet/MetaVelvet nebo SOAPdenovo, aby se dosáhlo co největší konsenzuální sekvence. Sekvence transkriptů budou anotovány pomocí dobře zavedených pipeline a transkripty budou prohledávány pomocí RPS-BLAST (Reverse Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) proti KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) a databáze Genbank. Čtení podobná bakteriím identifikovaná pomocí nr BLASTX budou dále prohledávána proti databázi COG. Funkční role sekvencí budou přiřazeny na základě vyhledávání KEGG a COG.
• AIII.2.3. Meta-proteomika (RU1) Na základě pracovního postupu navrženého během prvních měsíců aktivity budou proteiny extrahovány z každého vzorku stolice a analyzovány bezgelovou a/nebo gelovou proteomikou. Identifikace peptidů bude provedena pomocí hmotnostního spektrometru Finnigan LCQ Deca XP MAX. Bude provedena diferenciální proteomická analýza. Pro identifikaci peptidů bude použit Open Mass Spectra Search Algorithm pro vyhledávání MS/MS spekter proti dostupným databázím. Pro získání dalších funkčních informací budou proteiny založené na klasifikaci COG anotovány. Identifikované COG budou mapovány v databázi metabolických drah KEGG a vizualizovány online aplikací iPath. Po korekci FDR budou všechny identifikované peptidy prohledány proti UniProtKB a poté zmapovány. Pro řešení nejvyšší funkční úrovně všech identifikovaných proteinů budou zmapovány identifikované COG na KEGG drahách. Kromě společného mikrobiálního jádra budou stanoveny interindividuální a mezidietní rozdíly z hlediska metabolické funkce.
• ČINNOST IV. Funkční charakteristika. Charakterizace některých funkčních vlastností vzorků stolice a mikrobiálních izolátů ze vzorků stolice posílí vazbu mezi stravou a střevní mikroflórou.
• AIV.1 Fekální genotoxické a antigenotoxické aktivity (RU 5) Budou připraveny vzorky fekální vody (FW) a genotoxicita bude stanovena Comet assay. Enterocyty HT29 (10^6 buněk/test) společně vystavené FW a začleněné do podložního sklíčka LMA budou podrobeny jednobuněčné gelové elektroforéze (SCGE) a analyzovány epifluorescencí. U několika mikrobiálních izolátů z potravin bude zkoumána inhibiční aktivita vůči genotoxickým a mutagenním sloučeninám, které jsou potenciálně přítomny ve střevě. Účinek společné inkubace mikroorganismů a genotoxinu bude testován prostřednictvím hodnocení zbytkové genotoxické aktivity sloučenin pomocí SOS-Chromotestu (cílová Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) a paralelně pomocí Comet assay (cílové enterocyty HT29 ).
• AIV.2. Fekální mikroorganismy a modulace imunitní odpovědi (RU 9) Podmínky pro růst a diferenciaci dendritických buněk (DC) a Caco-2 buněk budou nastaveny během prvních měsíců aktivity. Laktobacily a bifidobakterie budou izolovány ze všech vzorků stolice a použity jako ozářené bakterie k detekci exprese imunitních mediátorů v enterocytech. Budou stanoveny hladiny transkriptu a příbuzné proteinové sekrece IL-8 a tolerogenního TGF-beta (Transforming growth factor beta) a TSLP (thymic Stromal Lymphopoetin). Ozářené bakterie budou také použity ke stimulaci povrchových markerů v DC buňkách. Celková RNA bude extrahována z buněk Caco-2 a DC a bude připravena cDNA pro sledování relativní genové exprese IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 a IL-10; koncentrace odpovídajících genových produktů bude stanovena pomocí ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITY V. Metabolom slin, stolice a moči (RU10). K dokončení „omického“ přístupu bude metabolom vzorků stolice, moči a slin analyzován třemi technikami (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) a NMR (nukleární magnetická rezonance). podle dříve nastavených protokolů. Chemické sloučeniny budou identifikovány pomocí databází hmotnostních spekter a také dat hmotnostních spekter v literatuře a/nebo dat z čistých chemických sloučenin. Po rozmrazení vzorků moči a slin bude do 2 hodin provedena NMR analýza. Budou připraveny vzorky stolice s maximálním důrazem na úplné získání ve vodě rozpustných molekul. Spektra NMR budou připravena pro statistickou analýzu pomocí korekce odchylek malých píků pomocí algoritmu iCoshift.
• ATIVITA VI. Statistické zpracování výsledků (všechny RU). Během vývoje projektu se bude RU2 starat o údržbu webových stránek ve spolupráci s partnerskou CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), stránka bude shromažďovat všechny výsledky z různých výzkumných aktivit. Tato databáze bude použita pro analýzu v „režimu R“ k posouzení vlivu různých deskriptorů při určování rozmanitosti tří diet a v „režimu Q“ k určení rozdílu mezi třemi dietami. Zároveň budou nejrelevantnější výsledky šířeny prostřednictvím vědeckých publikací do recenzovaných časopisů.

S přihlédnutím ke zkoumanému tématu tento projekt nepochybně uplatnil potenciální aspekty. Například znalost vlivu stravy na lidskou mikroflóru by mohla vést k přípravě vhodných pokynů, které by byly distribuovány v kampaních na podporu integrované péče. Bude postaráno o spotřebitelské preference, postoje, potřeby, chování, životní styl a vzdělání a posílí se komunikace mezi spotřebiteli a výzkumnou komunitou potravinového řetězce s cílem zlepšit informovaný výběr a jeho dopad na kvalitu života. Zmocnění jednotlivců ke zlepšení a správě svého zdraví prostřednictvím správných stravovacích návyků povede k úsporám nákladů systémů zdravotní péče.