Микробиота и связанный с ней метаболизм у всеядных, вегетарианцев и веганов (MRMOVVD)

Общая цель этого проекта — найти взаимосвязь между диетой и микробиотой слюны и фекалий с помощью высокопроизводительного и интегрированного метаомного (геномного, транскриптомного, протеомного и метаболомного) анализа. В этом контексте до сих пор обсуждаются некоторые вопросы. Например, каково ежедневное потребление микробов и их роль в балансе микробиоты кишечника? Как влияют на кишечную микробиоту основные типы питания (всеядное, вегетарианское и веганское)? Какие микробные группы преобладают на уровне кишечника в зависимости от типа питания? Каков предполагаемый вклад каждой микробной группы в поддержание здоровья хозяина? Количественное и качественное определение основных микробных групп, содержащихся в пищевых продуктах, в зависимости от пищевых привычек отвечает на поставленный ранее вопрос и совпадает с одной из целей данного проекта. Оценка разнообразия (геномика), функциональной активности (транскриптомика и протеомика) и метаболитов (метаболомика), особенно фекальной микробиоты, совпадает с целостным подходом этого проекта и отвечает на несколько ранее поставленных вопросов. Учитывая тесную взаимосвязь между балансом различных микробных популяций в различных нишах человеческого организма и возникновением метаболических патологий, этот проект должен предоставить новые знания, которые могут выявить возможные связи между диетой и дисметаболизмом. Диету следует рассматривать как наиболее подходящий и недорогой инструмент для определения стабильной и благоприятной микробиоты полости рта и кишечника, которая предотвращает заболевания и гарантирует долголетие человека. Эти общие цели проекта должны быть достигнуты на основе конкретных целей, таких как: (i) идентификация биологических, молекулярных и метаболических маркеров, специфичных для типа рациона; (ii) оценка различий в микробиоте и метаболоме слюны и фекалий как между отдельными людьми, так и между типами диеты; (iii) оценка качественных и количественных различий в потреблении микробов, связанных с типом рациона; и (iv) идентификация функциональных особенностей образцов фекалий, связанных с типом диеты, которые можно рассматривать как индикаторы предрасположенности к заболеванию.

Для достижения общей цели этого проекта в предложении участвуют десять исследовательских подразделений (RU; RU1-10) в партнерстве с 16 национальными и особенно иностранными учреждениями, охватывающими 12 разных стран. Лидеры каждого RU представлены ниже:

• РУ1. Марко Гоббетти — главный исследователь предложения и лидер RU1. По данным ISI Web of Science, он является автором 188 публикаций, которые цитировались 4075 раз, при этом среднее число цитирований на публикацию составляет 21,68, а индекс h — 39. Недавно он был включен в список лучших итальянских ученых по версии VIA Academy (ежегодная оценка ученых, имеющих индекс Хирша выше 30). RU1 накопил хороший опыт в изучении кишечной микробиоты больных целиакией, а также в протеомике, применяемой к молочнокислым бактериям и продуктам питания. RU1 выступит в роли координатора проекта. В рамках этого проекта RU1 занимается: набором волонтеров; ведение дневников; обработка и подготовка биологических образцов; определение основных микробных групп в пробах фекалий культурально-зависимыми методами; метапротеомная характеристика отобранных образцов фекалий от людей с различными диетическими привычками; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU1 будет сотрудничать с Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Мадрид, Испания, для конкретного определения функциональной активности и/или метаболических путей идентифицированных белков, а также с Департаментом Микробиология Университетского колледжа Корка, Ирландия, за биоинформатический подход к изучению протеома.
• РУ2. Джанлуиджи Кардинали — лидер RU2. Как сообщает ISI Web of Science, он является автором 38 публикаций с индексом h 11. RU2 работает около двадцати лет в области биоразнообразия и таксономии дрожжей, которые анализируются с помощью микробиологических и молекулярных методов. В рамках этого проекта RU2 участвует в: характеристике разнообразия пищевой микробиоты с помощью метода PCR-DGGE; характеристика микробиоты образцов фекалий методом ПЦР-ДГГЭ; и, как лидер, в управлении статистической обработкой результатов всех RU, предоставляя общую базу данных. RU2 будет сотрудничать с Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Утрехт, Нидерланды, для биоинформатической обработки данных.
• РУ3. Данило Эрколини — лидер RU3. Как сообщает ISI Web of Science, он является автором 58 публикаций с общим количеством цитирований 1354 и индексом h 21. RU3 уже много лет занимается исследованиями микробной экологии сложных экосистем, в основном пищевых экосистем. Пищевая микробиота всегда изучалась передовыми молекулярными подходами и культурально-независимыми методами, не требующими культивирования микроорганизмов на синтетических средах. В рамках этого проекта RU3 занимается: характеристикой разнообразия микробиоты в образцах слюны; глубокое секвенирование выбранных образцов продуктов питания; глубокое секвенирование отобранных образцов фекалий и слюны; метагеномная характеристика отобранных образцов фекалий от людей с различными диетическими привычками; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU3 будет сотрудничать с проектом Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org). который проводится в Аргоннской национальной лаборатории, Лемонт, США, для создания наборов данных, описывающих микроорганизмы из широкого спектра экосистем.
• РУ4. Эразмо Невиани — лидер RU4. Как сообщает ISI Web of Science, он является автором 111 публикаций с общим количеством цитирований 1508 и индексом h 22. RU4 накопил хороший опыт в области пищевой микробной экологии для всесторонней и комплексной оценки микробных популяций, динамики и физиологического состояния клеток на различных этапах производства продуктов питания. В рамках этого проекта RU4 занимается: подготовкой дневников; набор волонтеров; ведение дневников; обработка и подготовка биологических образцов; определение основных микробных групп в образцах фекалий культурально-зависимыми методами; обработка результатов дневников; определение основных микробных групп в пищевых продуктах культурально-зависимыми и независимыми методами; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU4 будет сотрудничать с кафедрой пищевых наук и технологий Афинского сельскохозяйственного университета, Греция, для определения микробов в пищевых продуктах и, особенно, в молочных продуктах, с отделом эпидемиологии Фонда IRCCS Istituto Nazionale dei. Tumori из Милана, Италия, за помощь в регистрации диетических привычек, а также с Национальным институтом исследований пищевых продуктов и питания в Риме, Италия, за мониторинг предполагаемых недостатков, связанных с ограничительными диетическими режимами.
• РУ5. Альдо Корсетти — лидер RU5. Как сообщает ISI Web of Science, он является автором 81 публикации с общим количеством цитирований 2084 и индексом h 28. RU5 накопила хороший опыт в области микробной экологии продуктов питания и напитков, а также в характеристике штаммов с точки зрения биотехнологии и функциональных аспектов, чтобы выбрать заквасочные культуры для различных применений. В рамках этого проекта RU5 занимается: определением основных микробных групп в пищевых продуктах культурально-зависимыми методами; идентификация и типирование микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов; характеристика генотоксичности образцов фекалий; характеристика антигенотоксигенной активности микробных изолятов из пищевых продуктов; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU5 будет сотрудничать с Департаментом сельскохозяйственных, пищевых и пищевых наук Университета Альберты, Канада, для молекулярного типирования пищевых микроорганизмов с помощью многолокусного секвенирования.
• РУ6. Патриция Бриджиди — лидер RU6. Как сообщает ISI Web of Science, она является автором 102 публикаций, которые были процитированы 3158 раз, при этом среднее число цитирований на публикацию составляет 32,41, а индекс h — 26. RU6 обладает консолидированной и широкой компетенцией в области идентификации и молекулярного количественного определения бактерий из сложных экосистем (фекалии и биопсии кишечника), а также в области молекулярных механизмов, ответственных за пользу бактерий для здоровья. В рамках этого проекта RU6 занимается: набором волонтеров; ведение дневников; обработка и подготовка биологических образцов; определение основных микробных групп в образцах фекалий культурально-зависимыми методами; метатранскриптомная характеристика отобранных образцов фекалий от людей с различными диетическими привычками; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU6 будет сотрудничать с Отделом пищевой микробиологии Университета Рединга, Великобритания, для разработки метатранскриптомной платформы и биоинформатического анализа полученных последовательностей для их отнесения к KEGG и кластеру COG функциональной активности.
• RU7. Франческа Клементи — лидер RU7. Как сообщает ISI Web of Science, она является автором 59 публикаций, которые цитировались 504 раза, при этом среднее число цитирований на публикацию составляет 11,25, а индекс h — 15. RU7 обладает заслуживающим доверия опытом в отношении роли, мониторинга и контроля пищевых микроорганизмов, особенно молочнокислых бактерий. В рамках этого проекта RU7 занимается: характеристикой разнообразия пищевой микробиоты методом ПЦР-ДГГЭ; определение антибиотикорезистентности в образцах кала и слюны; выделение и идентификация устойчивых к антибиотикам молочнокислых бактерий из образцов фекалий и слюны; характеристика генов, участвующих в устойчивости микробов к антибиотикам; изучение механизмов передачи антибиотикорезистентности между бактериями; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU7 будет сотрудничать с Греческим университетом Демокрита во Фракии, Греция, и с Институтом питания и здоровья им. Роуэта Абердинского университета, Шотландия, в исследовании переносимых генов устойчивости к антибиотикам в пищевых продуктах и ​​выделенных молочнокислых бактериях. из образцов слюны и кала.
• РУ8. Лука Симоне Коколин — лидер RU8. По данным Scopus, он является автором 131 публикации, которые были процитированы 2036 раз, в результате чего индекс h равен 25. RU 8 имеет большой опыт применения независимых от культуры методов изучения микробного биоразнообразия и жизнеспособности ферментированных пищевых продуктов. Он также обладает знаниями о количественной ПЦР (кПЦР) для количественного определения конкретных микроорганизмов из сложных экосистем. В рамках этого проекта RU8 занимается: набором волонтеров; ведение дневников; обработка и подготовка биологических образцов; определение основных микробных групп в образцах фекалий культурально-зависимыми методами; профилирование фекальной микробиоты с помощью подходов DGGE, применяемых как на уровне ДНК, так и на уровне РНК; метагеномная характеристика отобранных образцов фекалий от людей с различными диетическими привычками; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU8 будет сотрудничать с Университетом Марибора (UM), Словения, и Фракийским университетом Демокрита (DUT), Александруполис, Греция, по аспектам, касающимся взаимодействия патогенов с клетками-хозяевами и возможных модификаций клеток-хозяев. диеты различных диетических групп, которые могут наилучшим образом использовать известную полезную роль определенных микробных групп, связанных с конкретными продуктами, соответственно.
• RU9. Мауро Росси — лидер RU9. Как сообщает ISI Web of Science, он является автором 41 публикации с общим количеством цитирований 1087 и индексом h 19. RU9 имеет многолетний опыт (более 25 лет) и активное сотрудничество в области биохимии и иммунологии тонкого кишечника. В рамках этого проекта RU9 занимается: выделением лактобактерий и бифидобактерий из образцов фекалий; характеристика иммунного ответа in vitro фекальных изолятов с использованием клеток Caco-2; характеристика иммунного ответа in vitro фекальных изолятов с использованием дендритных клеток; измерение секреции цитокинов в Caco-2 и дендритных клетках; и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта RU9 будет сотрудничать с Ecofisiología Microbiana y Nutricion, Instituto de Agroquimica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Валенсия, Испания (приложение к модели B), чтобы установить, могут ли особенности фекальной микробиоты играть роль в возникновении кишечные иммунные дисфункции.
• RU10. Лючия Ваннини — лидер RU10. Как сообщает ISI Web of Science, она является автором 27 публикаций с общим количеством цитирований 322 и индексом h 9. RU10 накопил хороший опыт как в области пищевой микробиологии, так и в использовании инструментальных методов, в частности ядерного магнитного резонанса, для метаболомного анализа биологических образцов. В рамках этого проекта RU10 участвует в: характеристике метаболома выбранных пищевых продуктов; метаболомная характеристика образцов слюны; метаболомная характеристика образцов фекалий и мочи и статистическая обработка результатов. В рамках этого проекта R10 будет сотрудничать со Шведским институтом пищевых продуктов и биотехнологии, Швеция, и Институтом химической технологии, Департамент исследований и разработок, Прага, Чешская Республика, по аспектам, соответственно, касающимся метаболической характеристики некоторых отдельных пищевых продуктов и продуктов питания. биологические образцы. Используемый каскадный подход сделает каждую исследовательскую деятельность и каждую RU незаменимой для достижения основных целей проекта.

Это исследование будет состоять из различных действий (AI-VI), описанных ниже:

• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ I. Подбор лиц, ведение дневников, обработка, подготовка и хранение биологических образцов, а также микробиологические анализы образцов фекалий.
• АИ.1. Набор людей и ведение дневников (RU1, 4, 6, 8) Будет набрано около 50 всеядных, вегетарианцев и веганов-добровольцев, всего 150 субъектов. Вегетарианцы и веганы будут набраны в сотрудничестве с Итальянским научным обществом. вегетарианского питания. Всеядные люди будут набираться через объявления, опубликованные в университетах. Будет набрано около 50 здоровых добровольцев, в том числе примерно равное количество всеядных, вегетарианцев и веганов (возраст 18-59 лет, соотношение мужчин и женщин ок. 1:1). Набранных добровольцев попросят подписать консенсусный документ, чтобы записать свои диетические привычки. Дневники будут разработаны для получения подробной информации о характеристиках пищевых продуктов, что позволит легко идентифицировать продукты на рынке и оценить предполагаемую микробную нагрузку. Комитет по этике университетов будет проинформирован до начала проекта.
• АИ.2. Обработка, подготовка и хранение биологических образцов (РУ1, 4, 6, 8). Каждый человек будет предоставлять образцы слюны, кала и мочи еженедельно в течение трех недель. Тройные образцы будут объединены перед анализом, чтобы ограничить индивидуальную изменчивость. Обращение будет осуществляться по-разному в зависимости от типа биологических образцов (слюна, фекалии, моча) и последующих анализов (например, ДНК, РНК, протеом). Одновременно с вербовкой людей и сбором биологических образцов большинство РО будут участвовать в разработке методов/методов.
• АИ.3. Микробиологические анализы образцов кала (РУ1, 4, 6, 8). В первый раз будет проведен подсчет жизнеспособности путем посева свежего фекального материала на различные селективные питательные среды для подсчета наиболее распространенных групп фекальных микробов.
• АИ.4. Постановка техник/методов (РУ1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Одновременно с вербовкой людей и сбором биологических образцов большинство РО будут участвовать в разработке методов/методов. Чтобы создать независимую и конкурентоспособную платформу для метаомического анализа, RU3 закупит оборудование для высокопроизводительного секвенирования, что является основным экономическим вложением в этот проект.
• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ II. Пищевая микробиота и метаболом. Основываясь на информации из диетических дневников, наиболее репрезентативные продукты из трех рационов будут разделены на 3 категории: (i) низкий (ОСЧ, 10^3 КОЕ/г); (ii) промежуточный (ТБС 10^3 - 10^6 КОЕ/г); и (iii) высокая (TBC ³ 10^6 КОЕ/г) микробная нагрузка. Для пищевых продуктов группы (i) микробное число будет оцениваться на основе литературных данных. Для пищевых продуктов групп (ii) и (iii) микробное число будет определяться на основе литературных данных в случае хорошо известных продуктов с низкой рыночной дифференциацией (например, сыр Пармиджано-Реджано), тогда как соответствующие анализы будут проводиться в случае продукты с большим разнообразием рынка (например, сыр моцарелла). В последнем случае в анализ будет вовлечено большое количество продуктов, доступных на рынке. Микробное разнообразие пищевых продуктов будет изучаться более подробно сначала с помощью ПЦР-ДГГЭ (полимеразная цепная реакция-денатурирующий градиентный гель-электрофорез), а при необходимости — путем глубокого секвенирования на основе уровня сложности и текущих знаний о микробиоте конкретных продуктов.
• АII.1 Количественное определение микроорганизмов в пищевых продуктах (РУ 4, 5; 7). Анализ пищевых продуктов будет совместно проводиться между RU4 и 5, а некоторые образцы будут проанализированы обоими RU для взаимной проверки результатов. Затем RU4 будет характеризовать выбранные продукты с помощью анализа LH-PCR (длинная гетерогенность полимеразной цепной реакции), и результаты будут сравниваться с результатами, полученными RU7 с использованием PCR-DGGE. RU5 идентифицирует большую коллекцию изолятов из пищевых продуктов, стремясь найти возможные связи со сниженной антигенотоксической активностью фекальных вод и присутствием специфических микроорганизмов в проглоченных пищевых продуктах.
• AII.2 Микробное разнообразие пищевых продуктов (RU 2, 3). Во-первых, в этом упражнении будут рассмотрены плохо охарактеризованные продукты, которые специально едят вегетарианцы и веганы, основываясь на дневниковых записях. Будут исследованы как микробиота, так и микобиота. Анализ PCR-DGGE для дрожжей и мицелиальных грибов будет основан на амплификации частей домена D1/D2, кодирующих субъединицу LSU или 26S рРНК, и областей ITS (внутреннего транскрибируемого спейсера). Область V3 гена 16S рРНК будет нацелена на обнаружение бактерий. После анализа DGGE полученные гели будут оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения Bionumerics. Дендрограммы будут подвергнуты кластерному анализу для исключения из дальнейшего секвенирования образцов, имеющих коэффициент подобия 85%; такой выбор сэкономит затраты на секвенирование следующего поколения и обеспечит получение управляемого количества данных для анализа с помощью биоинформатики. RU3 проведет глубокое секвенирование с использованием библиотек ампликонов вариабельных генов, представляющих таксономический интерес, и с использованием конкретных процедур в зависимости от типа приобретаемой платформы для секвенирования. Результаты секвенирования будут обработаны RU2 на основе биоинформатики.
• AII.3 Пищевой метаболизм (RU 10). Основываясь на информации о пищевых привычках, ферментированные продукты, наиболее представленные в трех диетах, будут проанализированы, чтобы найти возможную связь между химическими соединениями, поступившими внутрь (например, салициловой кислотой), и предположительно обнаруженными в биологических образцах. Анализы метаболома будут проводиться с помощью ГХ-МС/ТФМЭ (газовая хроматография-масс-спектрометрия/твердофазная микроэкстракция) и ИК-Фурье-спектроскопии (ИК-Фурье).
• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ III. Микробиота фекалий и слюны. Предварительно все образцы слюны и кала со всех ca. 150 добровольцев будут подвергнуты анализу ПЦР-ДГГЭ, чтобы получить общее представление о микробном разнообразии. RT-PCR-DGGE (полимеразная цепная реакция в реальном времени - денатурирующий градиентный гель-электрофорез) также будет рассматриваться для оценки жизнеспособных популяций в фекалиях. На основе этих анализов репрезентативные образцы каждой диетической привычки будут подвергнуты секвенированию следующего поколения. Вывод всех этих результатов должен позволить шаг за шагом отобрать 4/5 образцов фекалий для каждого из трех рационов для проведения метаомического анализа.
• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ III.1. Изучение биоразнообразия.
• АIII.1.1. Профилирование PCR-DGGE (RU 2, 3, 8) Анализы PCR-DGGE для дрожжей и мицелиальных грибов будут нацелены на области 26S рРНК и ITS, тогда как области V3 и/или V6-V8 16S рРНК будут изучены для бактерий. И ДНК, и РНК (после ОТ-ПЦР) будут использоваться в качестве мишеней для исследования общей и жизнеспособной популяций соответственно. В тех же экспериментальных условиях RU3 будет характеризовать бактериальное разнообразие образцов слюны. После DGGE, анализа изображений и кластерного анализа образцов ДНК и РНК можно будет определить разницу между глобальной и жизнеспособной популяцией. Дендрограммы подобия будут использоваться для исключения из дальнейшего секвенирования образцов, имеющих коэффициент подобия ³ 85%; такой выбор сэкономит затраты на анализы секвенирования следующего поколения и обеспечит получение управляемого количества данных для анализа с помощью биоинформатики.
• АIII.1.2. Секвенирование следующего поколения (RU 3, 8) Глубокое секвенирование выбранных образцов слюны и фекалий будет выполнено с использованием библиотек ампликонов вариабельных генов, представляющих таксономический интерес. Все результаты секвенирования, полученные как для бактерий, так и для грибов, будут обрабатываться RU2 на основе биоинформатики.
• АIII.1.3. Устойчивость к антибиотикам (RU 7) ДНК, извлеченная непосредственно из образцов слюны и фекалий, будет проверена на наличие генов, кодирующих устойчивость к нескольким антибиотикам, с использованием ПЦР-анализа. Образцы с положительным результатом на гены устойчивости к антибиотикам (AR) будут использоваться для выделения устойчивых к антибиотикам лактобацилл, лактококков и энтерококков. После идентификации изоляты, демонстрирующие значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) выше соответствующих контрольных точек, будут подтверждены с помощью ПЦР-амплификации соответствующих генов AR. Возможность переноса генов AR, локализованных на генетических мобильных элементах, от изолятов к бактериям, представляющим клинический интерес, будет оцениваться с помощью испытаний конъюгации.
• АIII.2. Метаомический анализ отобранных образцов фекалий. Согласно каскадному подходу, результаты исследования микробного разнообразия образцов фекалий позволят выбрать 4/5 особей, представляющих каждый из 3 типов рациона (4/5 x 3 = 12/ 15) для проведения метаомического анализа. Подходы метаомики обеспечат внутреннюю базу данных, состоящую из последовательностей ДНК и РНК из фекальных микробиомов 12/15 человек, что позволит получить полное представление о синтезированных белках.
• АIII.2.1. Метагеномика (RU3, 8) ДНК фекалий будет определена количественно, и для метагеномного анализа будет применен протокол секвенирования дробовика. Эту задачу должен выполнять RU3, в зависимости от производительности и доступности платформы для секвенирования, который будет полностью занят анализом ампликонов ДНК и кДНК фекалий и слюны. В качестве альтернативы, специализированные компании будут выполнять эту задачу в качестве услуги.
• АIII.2.2. Метатранскриптомика (RU 6) Общий профиль экспрессии микробных генов будет охарактеризован с использованием инновационного метатранскриптомного подхода Illumina и протокола, установленного в течение первых месяцев проекта. кДНК будет синтезирована из РНК в соответствии с оптимизированными процедурами. Производится случайная амплификация кДНК, и кДНК секвенируется с использованием платформы Illumina HiSeq. Секвенированные мета-транскриптомы будут собраны вместе с использованием пакетов Velvet/MetaVelvet или SOAPdenovo для достижения максимально возможной консенсусной последовательности. Последовательности транскриптов будут аннотированы с использованием хорошо зарекомендовавших себя конвейеров, а поиск транскриптов будет выполняться с использованием RPS-BLAST (инструмент поиска с специфическим обратным положением — базовое локальное выравнивание) по KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов), COG (кластеры ортологичных групп) и Базы данных Генбанка. Бактериоподобные чтения, идентифицированные nr BLASTX, будут дополнительно искать в базе данных COG. Функциональные роли последовательностей будут назначены на основе поиска KEGG и COG.
• АIII.2.3. Метапротеомика (RU1) На основе рабочего процесса, разработанного в течение первых месяцев деятельности, белки будут извлечены из каждого образца фекалий и проанализированы с помощью протеомики без геля и/или на основе геля. Идентификацию пептидов будут проводить с использованием масс-спектрометра Finnigan LCQ Deca XP MAX. Будет проведен дифференциальный протеомный анализ. Для идентификации пептидов будет использоваться открытый алгоритм поиска масс-спектров для поиска спектров МС/МС в доступных базах данных. Чтобы получить дополнительную функциональную информацию, белки, основанные на классификации COG, будут аннотированы. Идентифицированные COG будут отображены в базе данных метаболических путей KEGG и визуализированы с помощью онлайн-приложения iPath. После коррекции FDR все идентифицированные пептиды будут сравниваться с UniProtKB, а затем картированы. Чтобы достичь самого высокого функционального уровня всех идентифицированных белков, идентифицированные COG на пути KEGG будут сопоставлены. Помимо общего микробного ядра, межиндивидуальные и междиетические различия будут определяться с точки зрения метаболической функции.
• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ IV. Функциональная характеристика. Характеристика некоторых функциональных особенностей образцов фекалий и микробных изолятов из образцов фекалий укрепит связь между диетой и кишечной микробиотой.
• AIV.1 Фекальная генотоксическая и антигенотоксическая активность (RU 5) Будут подготовлены образцы фекальной воды (ФВ), и генотоксичность будет определена с помощью анализа Comet. Энтероциты HT29 (10 ^ 6 клеток/анализ), подвергнутые совместному воздействию FW и включенные в предметное стекло LMA, будут подвергнуты одноклеточному гель-электрофорезу (SCGE) и проанализированы с помощью эпифлуоресценции. Несколько микробных изолятов из пищевых продуктов будут исследованы на ингибирующую активность в отношении генотоксических и мутагенных соединений, которые потенциально присутствуют в кишечнике. Эффект совместной инкубации микроорганизма и генотоксина будет оцениваться посредством оценки остаточной генотоксической активности соединений с использованием SOS-Chromotest (мишень Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) и, параллельно, анализа Comet (целевые энтероциты HT29). ).
• АIV.2. Фекальные микроорганизмы и модуляция иммунного ответа (РУ 9) Условия для роста и дифференцировки дендритных клеток (ДК) и клеток Сасо-2 будут созданы в течение первых месяцев активности. Лактобациллы и бифидобактерии будут выделены из всех образцов фекалий и использованы в качестве облученных бактерий для определения экспрессии иммунных медиаторов в энтероцитах. Будут определять уровни секреции транскрипта и родственного белка IL-8 и толерогенного TGF-бета (трансформирующий фактор роста бета) и TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин). Облученные бактерии также будут использоваться для стимуляции поверхностных маркеров в клетках DC. Суммарная РНК будет извлечена из клеток Caco-2 и DC, и будет подготовлена ​​кДНК для изучения относительной экспрессии генов IL-8, TGF-бета, TSLP, TNF-альфа, IL-12p40 и IL-10; концентрацию соответствующих генных продуктов определяют с помощью ELISA (иммуноферментного анализа).
• АКТИВНОСТЬ V. Метаболом слюны, кала и мочи (RU10). Чтобы завершить «омический» подход, метаболом образцов фекалий, мочи и слюны будет проанализирован с помощью трех методов (ГХ-МС/ТФМЭ, FTIR/ATR (инфракрасное преобразование Фурье/ослабленное полное отражение) и ЯМР (ядерно-магнитный резонанс). в соответствии с ранее установленными протоколами. Химические соединения будут идентифицированы с использованием баз данных масс-спектров, а также данных масс-спектров в литературе и/или данных о чистых химических соединениях. После оттаивания образцов мочи и слюны ЯМР-анализ будет выполнен в течение 2 часов. Образцы фекалий будут подготовлены с учетом максимального значения полного восстановления водорастворимых молекул. Спектры ЯМР будут подготовлены для статистического анализа путем корректировки небольших рассогласований пиков с помощью алгоритма iCoshift.
• ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ VI. Статистическая обработка результатов (все RU). Во время разработки проекта RU2 позаботится о поддержке веб-сайта в сотрудничестве с партнером CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Утрехт, Нидерланды), сайт будет собирать все результаты различных исследований. Эта база данных будет использоваться для анализа в «режиме R» для оценки влияния различных дескрипторов на определение разнообразия трех рационов и в «режиме Q» для определения различий между тремя рационами. В то же время наиболее актуальные результаты будут распространяться через научные публикации в рецензируемых журналах.

Принимая во внимание изучаемую тему, этот проект, несомненно, имеет прикладные аспекты. Например, знание влияния диеты на микробиоту человека может привести к подготовке соответствующих руководств для распространения в рамках кампаний по продвижению комплексного ухода. Предпочтения, отношения, потребности, поведение, образ жизни и образование потребителей будут учитываться, а общение между потребителями и сообществом, занимающимся исследованиями пищевых цепей, будет улучшено, чтобы улучшить осознанный выбор и его влияние на качество жизни. Предоставление людям возможности улучшать свое здоровье и управлять им с помощью правильных пищевых привычек приведет к экономии средств для систем здравоохранения.