Mikrobiota i pokrewny metabolizm w dietach wszystkożernych, wegetariańskich lub wegańskich (MRMOVVD)

Ogólnym celem tego projektu jest znalezienie związku między dietą a mikrobiomem śliny i kału za pomocą wysokowydajnych i zintegrowanych analiz metaomicznych (genomicznych, transkryptomicznych, proteomicznych i metabolomicznych). W tym kontekście nadal dyskutuje się nad kilkoma kwestiami. Na przykład, jakie jest dzienne spożycie drobnoustrojów i ich rola w równowadze mikroflory jelitowej? Jak na mikroflorę jelitową wpływają główne rodzaje diety (wszystkożerna, wegetariańska i wegańska)? Jakie są dominujące grupy drobnoustrojów na poziomie jelit, w zależności od rodzaju diety? Jaki jest przypuszczalny wkład każdej grupy drobnoustrojów w utrzymanie zdrowia gospodarza? Ilościowe i jakościowe określenie głównych grup drobnoustrojów występujących w żywności, w zależności od nawyków żywieniowych, jest odpowiedzią na wcześniejsze pytanie i pokrywa się z jednym z celów tego projektu. Ocena różnorodności (genomika), aktywności funkcjonalnej (transkryptomika i proteomika) oraz metabolitów (metabolomika), zwłaszcza mikroflory kałowej, pokrywa się z holistycznym podejściem tego projektu i odpowiada na kilka wcześniejszych pytań. Biorąc pod uwagę ścisłą korelację między równowagą różnych populacji drobnoustrojów w różnych niszach ciała ludzkiego a początkiem patologii metabolicznych, projekt ten dostarczy nowej wiedzy, która może uwydatnić możliwe związki między dietą a dysmetabolizmami. Dietę należy uznać za najbardziej odpowiednie i niedrogie narzędzie do ustalenia stabilnej i korzystnej mikroflory jamy ustnej i jelit, która zapobiega chorobom i gwarantuje długowieczność człowieka. Te ogólne cele projektu zostaną osiągnięte w oparciu o cele szczegółowe, takie jak: (i) identyfikacja biologicznych, molekularnych i metabolicznych markerów specyficznych dla danego rodzaju diety; (ii) oszacowanie różnic w mikrobiomie i metabolomie śliny i kału, zarówno między osobnikami, jak i między rodzajami diety; (iii) oszacowanie jakościowych i ilościowych różnic w pobraniu drobnoustrojów związanych z rodzajem diety; oraz (iv) określenie cech funkcjonalnych próbek kału związanych z rodzajem diety, które można uznać za wskaźniki podatności na choroby.

Aby osiągnąć ogólny cel tego projektu, we wniosku zaangażowanych jest dziesięć jednostek badawczych (RU; RU1-10) we współpracy z 16 instytucjami krajowymi, a zwłaszcza zagranicznymi, obejmującymi 12 różnych krajów. Liderzy każdego RU są przedstawieni poniżej:

• RU1. Marco Gobbetti jest głównym badaczem wniosku i liderem RU1. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorem 188 publikacji, które były cytowane 4075 razy, ze średnią cytowań na publikację 21,68 i indeksem h równym 39. Niedawno został wpisany na listę Top Italian Scientists przez VIA Academy (roczna ocena dla naukowców o wartości h-index wyższej niż 30). RU1 zdobył dobre doświadczenie w badaniu mikroflory jelitowej osób z celiakią oraz w proteomice stosowanej do bakterii kwasu mlekowego i żywności. RU1 będzie pełnić rolę koordynatora projektu. W ramach tego projektu RU1 zajmuje się: rekrutacją wolontariuszy; administrowanie pamiętnikami; obsługa i przygotowywanie próbek biologicznych; oznaczanie głównych grup drobnoustrojów w próbkach kału metodami zależnymi od hodowli; metaproteomiczna charakterystyka wybranych próbek kału od osób o różnych nawykach żywieniowych; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU1 będzie współpracować z Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madryt, Hiszpania, w celu szczegółowego przypisania czynności funkcjonalnych i/lub szlaków metabolicznych zidentyfikowanym białkom oraz z Departamentem Microbiology of the University College Cork, Irlandia, za bioinformatyczne podejście do badań proteomu.
• RU2. Gianluigi Cardinali jest liderem RU2. Jak donosi ISI Web of Science, jest autorem 38 publikacji z indeksem h równym 11. RU2 działa od około dwudziestu lat w dziedzinie różnorodności biologicznej i taksonomii drożdży, które są analizowane za pomocą technik mikrobiologicznych i molekularnych. W ramach tego projektu RU2 zajmuje się: charakterystyką różnorodności mikroflory pokarmowej metodą PCR-DGGE; charakterystyka mikrobiomu próbek kału metodą PCR-DGGE; oraz, jako lider, w zarządzaniu opracowaniem statystycznym wyników ze wszystkich RU, zapewniając wspólną bazę danych. RU2 będzie współpracować z Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) w Utrechcie w Holandii w celu bioinformatycznego opracowania danych.
• RU3. Danilo Ercolini jest liderem RU3. Jak donosi ISI Web of Science, jest autorem 58 publikacji, z łączną liczbą cytowań 1354 i indeksem h równym 21. RU3 od lat zajmuje się badaniami ekologii drobnoustrojów złożonych ekosystemów, głównie pokarmowych. Mikrobiota pokarmowa była zawsze badana przy użyciu zaawansowanych metod molekularnych i metod niezależnych od hodowli, które nie wymagają hodowli mikroorganizmów na syntetycznych pożywkach. W ramach tego projektu RU3 zajmuje się: charakterystyką różnorodności mikrobiomu w próbkach śliny; głębokie sekwencjonowanie wybranych próbek żywności; głębokie sekwencjonowanie wybranych próbek kału i śliny; metagenomiczna charakterystyka wybranych próbek kału od osób o odmiennych nawykach żywieniowych; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU3 będzie współpracować z Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) który jest prowadzony w Argonne National Laboratory w Lemont w Stanach Zjednoczonych w celu tworzenia zestawów danych opisujących mikroorganizmy z szerokiego zakresu ekosystemów.
• RU4. Erasmo Neviani jest liderem RU4. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorem 111 publikacji, z łączną liczbą cytowań 1508 i indeksem h równym 22. RU4 zdobył duże doświadczenie w ekologii mikrobiologicznej żywności w celu kompleksowej i zintegrowanej oceny populacji drobnoustrojów, dynamiki i stanu fizjologicznego komórek na różnych etapach produkcji żywności. W ramach tego projektu RU4 zajmuje się: przygotowywaniem pamiętników; rekrutacja wolontariuszy; administrowanie pamiętnikami; obsługa i przygotowywanie próbek biologicznych; oznaczanie głównych grup drobnoustrojów w próbkach kału metodami zależnymi od hodowli; opracowanie wyników z dzienników; oznaczanie głównych grup drobnoustrojów w żywności metodami zależnymi i niezależnymi od kultury; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU4 będzie współpracować z Wydziałem Nauk o Żywności i Technologii Uniwersytetu Rolniczego w Atenach w Grecji w celu oznaczania drobnoustrojów w żywności, a zwłaszcza w produktach mlecznych, z Jednostką Epidemiologii Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori z Mediolanu we Włoszech za pomoc w rejestrowaniu nawyków żywieniowych oraz z Narodowym Instytutem Badań nad Żywnością i Żywieniem w Rzymie we Włoszech za monitorowanie domniemanych braków związanych z restrykcyjnymi reżimami żywieniowymi.
• RU5. Aldo Corsetti jest liderem RU5. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorem 81 publikacji o łącznej liczbie cytowań 2084 i indeksie h równym 28. RU5 zdobył duże doświadczenie w dziedzinie ekologii drobnoustrojów żywności i napojów oraz charakteryzacji szczepów pod kątem aspektów biotechnologicznych i funkcjonalnych, w celu doboru kultur starterowych do różnych zastosowań. W ramach tego projektu RU5 zajmuje się: określaniem głównych grup drobnoustrojów w żywności metodami zależnymi od kultury; identyfikacja i typowanie drobnoustrojów wyizolowanych z żywności; charakterystyka genotoksyczności próbek kału; charakterystyka antygenotoksygennej aktywności izolatów drobnoustrojów z żywności; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU5 będzie współpracować z Wydziałem Nauk o Rolnictwie, Żywności i Żywieniu Uniwersytetu Alberty w Kanadzie w celu typowania molekularnego mikroorganizmów wyizolowanych z żywności za pomocą sekwencjonowania typu multi-locus.
• RU6. Patrizia Brigidi jest liderem RU6. Jak donosi ISI Web of Science, jest autorką 102 publikacji, które były cytowane 3158 razy, ze średnią cytowań na publikację 32,41 i indeksem h równym 26. RU6 posiada ugruntowane i szerokie kompetencje w zakresie identyfikacji i molekularnej oceny ilościowej bakterii ze złożonych ekosystemów (biopsje kału i jelit) oraz w zakresie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za prozdrowotne działanie bakterii. W ramach tego projektu RU6 zajmuje się: rekrutacją wolontariuszy; administrowanie pamiętnikami; obsługa i przygotowywanie próbek biologicznych; oznaczanie głównych grup drobnoustrojów w próbkach kału metodami zależnymi od hodowli; meta-transkryptomiczna charakterystyka wybranych próbek kału pochodzących od osób o odmiennych nawykach żywieniowych; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU6 będzie współpracować z Food Microbial Science Unit, University of Reading, Wielka Brytania, w celu opracowania platformy metatranskryptomicznej oraz analizy bioinformatycznej uzyskanych sekwencji w celu przypisania ich do klastra czynności funkcjonalnych KEGG i COG.
• RU7. Francesca Clementi jest liderem RU7. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorką 59 publikacji, które były cytowane 504 razy, ze średnią cytowań na publikację 11,25 i indeksem h równym 15. RU7 posiada godną zaufania wiedzę specjalistyczną dotyczącą roli, monitorowania i kontroli mikroorganizmów przenoszonych przez żywność, zwłaszcza bakterii kwasu mlekowego. W ramach tego projektu RU7 zajmuje się: charakterystyką różnorodności mikroflory pokarmowej metodą PCR-DGGE; oznaczanie antybiotykooporności w próbkach kału i śliny; izolacja i identyfikacja antybiotykoopornych bakterii kwasu mlekowego z próbek kału i śliny; charakterystyka genów zaangażowanych w oporność drobnoustrojów na antybiotyki; badanie mechanizmów przenoszenia oporności na antybiotyki między bakteriami; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU7 będzie współpracować z Greckim Uniwersytetem Demokryta w Tracji w Grecji oraz z Rowett Institute for Nutrition and Health na Uniwersytecie w Aberdeen w Szkocji w celu zbadania przenoszonych genów oporności na antybiotyki w żywności i wyizolowanych bakteriach kwasu mlekowego z próbek śliny i kału.
• RU8. Luca Simone Cocolin jest liderem RU8. Jak donosi Scopus, jest autorem 131 publikacji, które były cytowane 2036 razy, co daje indeks h równy 25. RU 8 ma duże doświadczenie w stosowaniu metod niezależnych od kultury do badania bioróżnorodności i żywotności mikroorganizmów w fermentowanej żywności. Posiada również wiedzę z zakresu ilościowego PCR (qPCR) do oznaczania ilościowego określonych mikroorganizmów ze złożonych ekosystemów. W ramach tego projektu RU8 zajmuje się: rekrutacją wolontariuszy; administrowanie pamiętnikami; obsługa i przygotowywanie próbek biologicznych; oznaczanie głównych grup drobnoustrojów w próbkach kału metodami zależnymi od hodowli; profilowanie mikroflory kałowej metodami DGGE stosowanymi zarówno na poziomie DNA, jak i RNA; metagenomiczna charakterystyka wybranych próbek kału od osób o różnych nawykach żywieniowych; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU8 będzie współpracować z Uniwersytetem w Mariborze (UM) w Słowenii oraz Uniwersytetem Demokryta w Tracji (DUT) w Alexandroupolis w Grecji w zakresie aspektów związanych z interakcją patogen-komórka gospodarza oraz w zakresie możliwych modyfikacji diety różnych grup diet, które mogą najlepiej wykorzystać znaną, korzystną rolę pewnych grup drobnoustrojów związanych odpowiednio z określoną żywnością.
• RU9. Mauro Rossi jest liderem RU9. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorem 41 publikacji, z łączną liczbą cytowań 1087 i indeksem h 19. RU9 ma wieloletnie doświadczenie (>25 lat) i silną współpracę w dziedzinie biochemii i immunologii jelita cienkiego. W ramach tego projektu RU9 zajmuje się: izolacją pałeczek kwasu mlekowego i bifidobakterii z próbek kału; charakterystyka odpowiedzi immunologicznej in vitro izolatów kałowych przy użyciu komórki Caco-2; charakterystyka odpowiedzi immunologicznej in vitro izolatów kałowych przy użyciu komórek dendrytycznych; pomiar wydzielania cytokin w komórkach Caco-2 i dendrytycznych; i statystyczne opracowanie wyników. W ramach tego projektu RU9 będzie współpracować z Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC) w Walencji w Hiszpanii (załącznik w modelu B), aby ustalić, czy osobliwości mikroflory kałowej mogą odgrywać rolę w powstawaniu zaburzenia immunologiczne jelit.
• RU10. Lucia Vannini jest liderem RU10. Jak podaje ISI Web of Science, jest autorką 27 publikacji o łącznej liczbie cytowań 322 i indeksie h równym 9. RU10 zdobył duże doświadczenie zarówno w dziedzinie mikrobiologii żywności, jak iw stosowaniu technik instrumentalnych, a zwłaszcza jądrowego rezonansu magnetycznego, do analizy metabolomu próbek biologicznych. W ramach tego projektu RU10 zajmuje się: charakterystyką metabolomu wybranych pokarmów; charakterystyka metabolomu próbek śliny; charakterystyka metabolomu próbek kału i moczu oraz opracowanie statystyczne wyników. W ramach tego projektu R10 będzie współpracować ze Szwedzkim Instytutem Żywności i Biotechnologii w Szwecji oraz Instytutem Technologii Chemicznej, Departamentem Badań i Rozwoju w Pradze, Republika Czeska, odpowiednio w zakresie aspektów dotyczących charakterystyki metabolomicznej niektórych wybranych produktów spożywczych i próbki biologiczne. Zastosowane podejście kaskadowe sprawi, że każde działanie badawcze i każde RU będzie niezbędne do osiągnięcia głównych celów projektu.

To badanie będzie się składać z różnych czynności (AI-VI) opisanych poniżej:

• CZYNNOŚĆ I. Rekrutacja osób, prowadzenie dzienniczków, postępowanie, przygotowywanie i przechowywanie próbek biologicznych oraz analizy mikrobiologiczne próbek kału.
• AI.1. Rekrutacja osób i prowadzenie dzienników (RU1, 4, 6, 8) Zrekrutowanych zostanie około 50 wszystkożernych, wegetariańskich i wegańskich wolontariuszy, w sumie 150 osób. Osoby wegetariańskie i wegańskie zostaną zrekrutowane we współpracy z Włoskim Towarzystwem Naukowym Żywienia Wegetariańskiego. Osoby wszystkożerne będą rekrutowane poprzez ogłoszenia publikowane na Uczelniach. Zrekrutowanych zostanie około 50 zdrowych ochotników, w tym mniej więcej taka sama liczba wszystkożerców, wegetarian i wegan (wiek 18-59 lat, stosunek mężczyzn do kobiet ok. 1:1). Zrekrutowani wolontariusze zostaną poproszeni o podpisanie dokumentu konsensusu, w którym zapiszą swoje nawyki żywieniowe. Dzienniki będą rozbudowane, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat właściwości żywności, umożliwiające łatwą identyfikację produktów na rynku i oszacowanie przypuszczalnego obciążenia mikrobiologicznego. Komisja Etyki Uczelni zostanie poinformowana przed rozpoczęciem projektu.
• AI.2. Postępowanie, przygotowywanie i przechowywanie próbek biologicznych (RU1, 4, 6, 8). Każda osoba będzie dostarczać co tydzień próbki śliny, kału i moczu przez okres trzech tygodni. Potrójne próbki zostaną połączone przed analizami w celu ograniczenia zmienności międzyosobniczej. Postępowanie będzie przebiegać różnie w zależności od rodzaju próbek biologicznych (ślina, kał, mocz) i kolejnych analiz (np. DNA, RNA, proteom). Równolegle z rekrutacją osób i pobieraniem próbek biologicznych większość RU będzie zaangażowana w tworzenie technik/metod.
• AI.3. Analizy mikrobiologiczne próbek kału (RU1, 4, 6, 8). Po raz pierwszy zliczenie żywych drobnoustrojów zostanie przeprowadzone poprzez wysianie świeżego materiału kałowego na różne selektywne pożywki hodowlane, aby wyliczyć najczęstsze grupy drobnoustrojów kałowych.
• AI.4. Zestaw technik/metod (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Równolegle z rekrutacją osób i pobieraniem próbek biologicznych większość RU będzie zaangażowana w tworzenie technik/metod. W celu stworzenia niezależnej i konkurencyjnej platformy do analiz metaomicznych, RU3 zakupi sprzęt do wysokowydajnego sekwencjonowania, co jest główną inwestycją ekonomiczną w tym projekcie.
• DZIAŁALNOŚĆ II. Mikrobiom pokarmowy i metabolom. Na podstawie informacji z dzienników dietetycznych, najbardziej reprezentatywne pokarmy z 3 diet zostaną podzielone na 3 kategorie: (i) niska (TBC, 10^3 jtk/g); (ii) półprodukt (TBC 10^3 - 10^6 jtk/g); oraz (iii) wysokie (TBC ³ 10^6 jtk/g) obciążenie mikrobiologiczne. W przypadku żywności z grupy (i) liczba drobnoustrojów zostanie oszacowana na podstawie danych literaturowych. Dla żywności z grup (ii) i (iii) liczba mikrobiologiczna zostanie określona na podstawie danych literaturowych w przypadku produktów dobrze znanych i mało zróżnicowanych rynkowo (np. ser Parmigiano Reggiano), natomiast odpowiednie analizy zostaną wykonane w przypadku produktów produkty o dużej zmienności rynkowej (np. ser Mozzarella). W tym drugim przypadku analizy obejmą dużą liczbę produktów dostępnych na rynku. Różnorodność mikrobiologiczna żywności zostanie dokładniej zbadana najpierw za pomocą PCR-DGGE (elektroforeza w żelu gradientowym denaturującym w reakcji łańcuchowej polimerazy), aw razie potrzeby za pomocą głębokiego sekwencjonowania na podstawie poziomu złożoności i aktualnej wiedzy o mikroflorze określonej żywności.
• AII.1 Ilościowe oznaczanie mikroorganizmów w żywności (RU 4, 5; 7). Analiza żywności zostanie udostępniona między RU4 i 5, a niektóre próbki zostaną przeanalizowane przez oba RU w celu wzajemnej walidacji wyników. Następnie RU4 scharakteryzuje wybraną żywność za pomocą analizy LH-PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy o heterogenności długości), a wyniki zostaną porównane z wynikami uzyskanymi przez RU7 przy użyciu PCR-DGGE. RU5 zidentyfikuje dużą kolekcję izolatów z żywności, mając na celu znalezienie możliwych związków ze zmniejszoną aktywnością antygenotoksyczną wód kałowych i obecnością określonych mikroorganizmów w spożywanej żywności.
• AII.2 Różnorodność drobnoustrojów w żywności (RU 2, 3). Po pierwsze, w tym ćwiczeniu uwzględnimy słabo scharakteryzowaną żywność, która jest szczególnie spożywana przez wegetarian i wegan na podstawie zapisów z pamiętników. Badana będzie zarówno mikro-, jak i mikroflora. Analizy PCR-DGGE dla drożdży i grzybów nitkowatych będą opierać się na amplifikacji części domeny D1/D2 kodującej podjednostkę LSU lub 26S rRNA oraz regionów ITS (ang. Internal Transcribed Spacer). Region V3 genu 16S rRNA będzie ukierunkowany na wykrywanie bakterii. Po analizie DGGE powstałe żele zostaną zdigitalizowane i przeanalizowane przez oprogramowanie Bionumerics. Dendrogramy zostaną poddane analizie skupień w celu wykluczenia z dalszego sekwencjonowania próbek o współczynniku podobieństwa 85%; taki wybór pozwoli zaoszczędzić na kosztach sekwencjonowania nowej generacji i zapewni uzyskanie rozsądnej ilości danych do analizy za pomocą bioinformatyki. RU3 przeprowadzi głębokie sekwencjonowanie przy użyciu bibliotek amplikonów genów zmiennych o znaczeniu taksonomicznym i przy użyciu określonych procedur zgodnie z typem zakupionej platformy do sekwencjonowania. Wyniki sekwencjonowania zostaną opracowane na podstawie danych bioinformatycznych przez RU2.
• AII.3 Metabolom pokarmowy (RU 10). W oparciu o informacje na temat nawyków żywieniowych, sfermentowana żywność najczęściej reprezentowana w trzech dietach zostanie przeanalizowana w celu znalezienia możliwego związku między spożytymi związkami chemicznymi (np. kwasem salicylowym) a przypuszczalnie odzyskanymi w próbkach biologicznych. Analizy metabolomu zostaną przeprowadzone metodami GC-MS/SPME (chromatografia gazowa-spektrometria mas/mikroekstrakcja do fazy stałej) oraz spektroskopią FTIR (w podczerwieni z transformacją Fouriera).
• DZIAŁALNOŚĆ III. Mikrobiom kału i śliny. Wstępnie wszystkie próbki śliny i kału z ok. 150 ochotników zostanie poddanych analizom PCR-DGGE, aby uzyskać przegląd różnorodności drobnoustrojów. RT-PCR-DGGE (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym - elektroforeza w gradiencie denaturującym) zostanie również rozważona w celu oszacowania żywotnych populacji w kale. Na podstawie tych analiz reprezentatywne próbki każdego nawyku żywieniowego zostaną poddane sekwencjonowaniu nowej generacji. Uzyskanie wszystkich tych wyników powinno pozwolić krok po kroku na wybranie 4/5 próbek kału dla każdej z trzech diet do analizy metaomicznej.
• DZIAŁALNOŚĆ III.1. Badanie różnorodności biologicznej.
• III.1.1. Profilowanie PCR-DGGE (RU 2, 3, 8) Analizy PCR-DGGE dla drożdży i grzybów nitkowatych będą ukierunkowane na regiony 26S rRNA i ITS, podczas gdy regiony V3 i/lub V6-V8 rRNA 16S będą badane pod kątem bakterii. Zarówno DNA, jak i RNA (po RT-PCR) zostaną użyte jako cel do zbadania odpowiednio populacji całkowitej i zdolnej do życia. W tych samych warunkach eksperymentalnych RU3 będzie charakteryzować różnorodność bakteryjną próbek śliny. Po analizie DGGE, obrazu i klastrów z próbek DNA i RNA możliwe będzie zdefiniowanie różnicy między populacją globalną a populacją zdolną do życia. Dendrogramy podobieństwa posłużą do wykluczenia z dalszego sekwencjonowania próbek o współczynniku podobieństwa ≥ 85%; taki wybór pozwoli zaoszczędzić koszty analiz sekwencjonowania nowej generacji i zapewni uzyskanie rozsądnej ilości danych do analizy za pomocą bioinformatyki.
• III.1.2. Sekwencjonowanie nowej generacji (RU 3, 8) Głębokie sekwencjonowanie wybranych próbek śliny i kału zostanie przeprowadzone przy użyciu bibliotek amplikonów genów zmiennych o znaczeniu taksonomicznym. Wszystkie wyniki sekwencjonowania uzyskane zarówno dla bakterii, jak i grzybów zostaną opracowane w oparciu o bioinformatykę przez RU2.
• III.1.3. Oporność na antybiotyki (RU 7) DNA wyekstrahowane bezpośrednio z próbek śliny i kału zostanie poddane badaniu przesiewowemu pod kątem występowania genów kodujących oporność na kilka antybiotyków przy użyciu testów PCR. Próbki, w wyniku których uzyskano wynik pozytywny na obecność genów oporności na antybiotyki (AR), zostaną użyte do wyizolowania opornych na antybiotyki pałeczek kwasu mlekowego, laktokoków i enterokoków. Po identyfikacji izolaty wykazujące wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) wyższe niż odpowiadające im wartości graniczne zostaną potwierdzone przez amplifikację PCR odpowiednich genów AR. Możliwość przeniesienia genów AR zlokalizowanych na ruchomych elementach genetycznych z izolatów do bakterii o znaczeniu klinicznym zostanie oceniona za pomocą prób koniugacyjnych.
• AIII.2. Analizy metaomiczne wybranych próbek kału Zgodnie z podejściem kaskadowym wyniki badań różnorodności mikrobiologicznej próbek kału wybiorą 4/5 osobników reprezentatywnych dla każdego z 3 rodzajów diety (4/5 x 3 = 12/ 15) poddać analizom metaomicznym. Podejścia metaomiczne zapewnią wewnętrzną bazę danych, składającą się z sekwencji DNA i RNA z mikrobiomów kałowych 12/15 osobników, co pozwoli na pełny wgląd w zsyntetyzowane białka.
• III.2.1. Metagenomika (RU3, 8) DNA w kale zostanie określone ilościowo, a do analizy metagenomicznej zostanie zastosowany protokół sekwencjonowania shotgun. Zadanie to powinno być wykonywane przez RU3, w zależności od wydajności i dostępności platformy sekwencjonowania, która będzie w pełnym wymiarze czasu zaangażowana w analizę amplikonów DNA i cDNA kału i śliny. Alternatywnie wyspecjalizowane firmy wykonają to zadanie jako usługę.
• III.2.2. Meta-transkryptomika (RU 6) Ogólny profil ekspresji genów drobnoustrojów zostanie scharakteryzowany przy użyciu innowacyjnego podejścia metatranskryptomicznego opartego na technologii Illumina i protokołu opracowanego w pierwszych miesiącach projektu. cDNA zostanie zsyntetyzowane z RNA zgodnie ze zoptymalizowanymi procedurami. Zostanie przeprowadzona losowa amplifikacja cDNA i sekwencjonowanie cDNA przy użyciu platformy Illumina HiSeq. Zsekwencjonowane meta-transkryptomy zostaną połączone razem przy użyciu pakietów Velvet/MetaVelvet lub SOAPdenovo, aby uzyskać jak największą sekwencję konsensusową. Sekwencje transkryptów będą opatrzone adnotacjami przy użyciu dobrze ugruntowanych potoków, a transkrypty będą przeszukiwane przy użyciu RPS-BLAST (narzędzie do wyszukiwania odwróconych pozycji specyficznych dla podstawowego dopasowania lokalnego) względem KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) i baz danych Genbanku. Odczyty podobne do bakterii zidentyfikowane przez nr BLASTX będą dalej przeszukiwane w bazie danych COG. Funkcjonalne role sekwencji zostaną przypisane na podstawie wyszukiwania KEGG i COG.
• III.2.3. Meta-proteomika (RU1) W oparciu o przepływ pracy zaprojektowany w ciągu pierwszych miesięcy działalności, białka będą ekstrahowane z każdej próbki kału i analizowane za pomocą proteomiki bezżelowej i/lub żelowej. Identyfikacja peptydów zostanie przeprowadzona przy użyciu spektrometru masowego Finnigan LCQ Deca XP MAX. Przeprowadzona zostanie różnicowa analiza proteomiczna. W celu identyfikacji peptydów zostanie wykorzystany algorytm wyszukiwania otwartych widm masowych do wyszukiwania widm MS/MS w dostępnych bazach danych. Aby uzyskać dalsze informacje funkcjonalne, białka oparte na klasyfikacji COG zostaną opatrzone adnotacjami. Zidentyfikowane COG zostaną zmapowane w bazie danych szlaków metabolicznych KEGG i zwizualizowane przez internetową aplikację iPath. Po korekcie FDR wszystkie zidentyfikowane peptydy zostaną przeszukane pod kątem UniProtKB, a następnie zmapowane. Aby zająć się najwyższym poziomem funkcjonalnym wszystkich zidentyfikowanych białek, zidentyfikowane COG na szlakach KEGG zostaną zmapowane. Oprócz wspólnego rdzenia mikrobiologicznego zostaną określone różnice międzyosobnicze i między dietami pod względem funkcji metabolicznych.
• DZIAŁANIE IV. Charakterystyka funkcjonalna. Charakterystyka niektórych cech funkcjonalnych próbek kału i izolatów drobnoustrojów z próbek kału wzmocni związek między dietą a mikroflorą jelitową.
• AIV.1 Czynności genotoksyczne i antygenotoksyczne w kale (RU 5) Przygotowane zostaną próbki wody w kale (FW), a genotoksyczność zostanie określona za pomocą testu Comet. Enterocyty HT29 (10^6 komórek/test) współeksponowane na FW i włączone do szkiełka LMA zostaną poddane jednokomórkowej elektroforezie żelowej (SCGE) i zanalizowane metodą epifluorescencji. Kilka izolatów drobnoustrojów z żywności zostanie zbadanych pod kątem działania hamującego wobec związków genotoksycznych i mutagennych, które potencjalnie występują w jelicie. Efekt wspólnej inkubacji mikroorganizmów z genotoksynami będzie oceniany poprzez ocenę resztkowej aktywności genotoksycznej związków za pomocą SOS-Chromotest (docelowy Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) i równolegle test Comet (docelowe enterocyty HT29 ).
• AIV.2. Drobnoustroje kałowe i modulacja odpowiedzi immunologicznej (RU 9) W ciągu pierwszych miesięcy aktywności zostaną stworzone warunki do wzrostu i różnicowania komórek dendrytycznych (DC) i komórek Caco-2. Lactobacilli i bifidobakterie zostaną wyizolowane ze wszystkich próbek kału i wykorzystane jako napromieniowane bakterie do wykrywania ekspresji mediatorów immunologicznych w enterocytach. Oznaczone zostaną poziomy wydzielania transkrypcji i pokrewnych białek IL-8 oraz tolerogennego TGF-beta (transformujący czynnik wzrostu beta) i TSLP (limfopoetyna zrębu grasicy). Napromieniowane bakterie zostaną również wykorzystane do stymulacji markerów powierzchniowych w komórkach DC. Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z komórek Caco-2 i DC, a cDNA zostanie przygotowany w celu zbadania względnej ekspresji genów IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 i IL-10; stężenie odpowiednich produktów genowych zostanie określone metodą ELISA (enzymatyczny test immunosorbentowy).
• ATTIVITY V. Metabolom śliny, kału i moczu (RU10). Aby zakończyć podejście „omiczne”, metabolom próbek kału, moczu i śliny zostanie przeanalizowany za pomocą trzech technik (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) i NMR (Nuclear Magnetic Resonance) zgodnie z ustalonymi wcześniej protokołami. Związki chemiczne będą identyfikowane za pomocą baz danych widm masowych, a także danych widm masowych w literaturze i/lub danych dotyczących czystych związków chemicznych. Po rozmrożeniu próbek moczu i śliny analiza NMR zostanie przeprowadzona w ciągu 2 godzin. Próbki kału zostaną przygotowane, przywiązując największą wagę do całkowitego odzyskania cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie. Widma NMR zostaną przygotowane do analizy statystycznej poprzez skorygowanie niewspółosiowości małych pików za pomocą algorytmu iCoshift.
• AKTYWNOŚĆ VI. Opracowanie statystyczne wyników (wszystkie RU). Podczas opracowywania projektu RU2 zajmie się utrzymaniem strony internetowej we współpracy z partnerem CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holandia), strona będzie gromadzić wszystkie wyniki różnych działań badawczych. Ta baza danych zostanie wykorzystana do analizy w „trybie R” w celu oceny wpływu różnych deskryptorów na określenie różnorodności trzech diet oraz w „trybie Q” w celu określenia różnic między trzema dietami. W tym samym czasie najistotniejsze wyniki zostaną rozpowszechnione w publikacjach naukowych w recenzowanych czasopismach.

Biorąc pod uwagę badany temat, projekt ten niewątpliwie wykorzystał potencjalne aspekty. Przykładowo, wiedza o wpływie diety na mikroflorę człowieka mogłaby zaowocować przygotowaniem odpowiednich wytycznych do dystrybucji w kampaniach promujących opiekę integrowaną. Zostaną uwzględnione preferencje, postawy, potrzeby, zachowania, styl życia i edukacja konsumentów, a komunikacja między konsumentami a środowiskiem badaczy łańcucha żywnościowego zostanie wzmocniona, aby poprawić świadomy wybór i jego wpływ na jakość życia. Umożliwienie jednostkom poprawy i zarządzania swoim zdrowiem poprzez prawidłowe nawyki żywieniowe spowoduje oszczędności w systemach opieki zdrowotnej.