Microbiote et métabolome associé dans les régimes omnivores, végétariens ou végétaliens (MRMOVVD)

L'objectif global de ce projet est de trouver la relation entre l'alimentation et la salive et le microbiote fécal, grâce à des analyses méta-omiques à haut débit et intégrées (génomique, transcriptomique, protéomique et métabolomique). Plusieurs questions sont encore débattues dans ce contexte. Par exemple, quel est l'apport quotidien en microbes et leur rôle sur l'équilibre du microbiote intestinal ? Comment le microbiote intestinal est-il affecté par les principaux types de régime (omnivore, végétarien et végétalien) ? Quels sont les groupes microbiens prédominants au niveau intestinal, selon le type de régime alimentaire ? Quelle est la contribution présumée de chaque groupe microbien au maintien de la santé de l'hôte ? La détermination quantitative et qualitative des principaux groupes microbiens hébergés dans les aliments, en fonction des habitudes alimentaires, répond à une question précédente et coïncide avec l'un des objectifs de ce projet. L'estimation de la diversité (génomique), de l'activité fonctionnelle (transcriptomique et protéomique) et des métabolites (métabolomique) du microbiote fécal, en particulier, coïncide avec l'approche holistique de ce projet et répond à plusieurs des questions précédentes. Compte tenu de l'étroite corrélation entre l'équilibre des différentes populations microbiennes dans diverses niches du corps humain et l'apparition de pathologies métaboliques, ce projet apportera de nouvelles connaissances susceptibles de mettre en évidence d'éventuelles relations entre alimentation et démétabolismes. L'alimentation doit être considérée comme l'outil le plus approprié et le moins cher pour déterminer un microbiote oral et intestinal stable et favorable, qui prévient les maladies et garantit la longévité humaine. Ces objectifs généraux du projet seront atteints sur la base de cibles spécifiques telles que : (i) l'identification de marqueurs biologiques, moléculaires et métaboliques spécifiques au type de régime alimentaire ; (ii) l'estimation des différences de microbiote et de métabolome de la salive et des matières fécales, à la fois entre les individus et entre les types de régime alimentaire ; (iii) l'estimation des différences qualitatives et quantitatives sur l'apport microbien lié au type de régime alimentaire ; et (iv) l'identification des caractéristiques fonctionnelles des échantillons fécaux liées au type de régime alimentaire, qui peuvent être considérées comme des indicateurs de sensibilité aux maladies.

Dans le but d'atteindre l'objectif global de ce projet, dix unités de recherche (UR; RU1-10) sont impliquées dans la proposition, avec le partenariat de 16 institutions nationales et, surtout, étrangères, couvrant 12 pays différents. Les dirigeants de chaque RU sont indiqués ci-dessous :

• RU1. Marco Gobbetti est le chercheur principal de la proposition et le chef de RU1. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 188 publications qui ont été citées 4 075 fois, avec une moyenne de citations par publication de 21,68 et un indice h de 39. Il a récemment été répertorié dans le Top Italian Scientists par VIA Academy (évaluation annuelle pour les scientifiques ayant une valeur d'indice h supérieure à 30). L'UR1 a acquis une bonne expérience sur l'étude du microbiote intestinal des coeliaques, et sur la protéomique appliquée aux bactéries lactiques et aux aliments. RU1 jouera le rôle de coordinateur du projet. Dans le cadre de ce projet, RU1 s'implique dans : le recrutement de volontaires ; administration d'agendas; manipulation et préparation d'échantillons biologiques; détermination des principaux groupes microbiens dans les échantillons fécaux par des méthodes dépendantes de la culture ; caractérisation méta-protéomique d'échantillons fécaux sélectionnés provenant d'individus ayant des habitudes alimentaires différentes ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, l'UR1 collaborera avec l'Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Espagne, pour l'attribution spécifique d'activités fonctionnelles et/ou de voies métaboliques à des protéines identifiées et avec le Département de Microbiologie de l'University College Cork, Irlande, pour l'approche bioinformatique des études sur le protéome.
• RU2. Gianluigi Cardinali est le leader de RU2. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 38 publications avec un indice h de 11. L'UR2 opère depuis une vingtaine d'années dans le domaine de la biodiversité et de la taxonomie des levures, qui sont analysées par des techniques microbiologiques et moléculaires. Au sein de ce projet, l'UR2 est impliquée dans : la caractérisation de la diversité du microbiote alimentaire par approche PCR-DGGE ; caractérisation du microbiote d'échantillons fécaux par approche PCR-DGGE ; et, en tant que chef de file, dans la gestion de l'élaboration statistique des résultats de toutes les EF, fournissant une base de données commune. Le RU2 collaborera avec le Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Pays-Bas, pour l'élaboration bioinformatique des données.
• RU3. Danilo Ercolini est le leader du RU3. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 58 publications, avec un nombre total de citations de 1 354 et un indice h de 21. L'UR3 est impliquée depuis des années dans des études d'écologie microbienne d'écosystèmes complexes, principalement des écosystèmes alimentaires. Le microbiote alimentaire a toujours été étudié par des approches moléculaires avancées et par des méthodes indépendantes de la culture qui ne nécessitent pas la culture de microorganismes sur des milieux synthétiques. Au sein de ce projet, l'UR3 est impliquée dans : la caractérisation de la diversité du microbiote dans des échantillons de salive ; séquençage approfondi d'échantillons alimentaires sélectionnés ; séquençage en profondeur d'échantillons de matières fécales et de salive sélectionnés ; caractérisation métagénomique d'échantillons fécaux sélectionnés d'individus ayant des habitudes alimentaires différentes ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, le RU3 collaborera avec le Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) qui est exécuté dans le laboratoire national d'Argonne, à Lemont, aux États-Unis, pour créer des ensembles de données décrivant les micro-organismes d'un large éventail d'écosystèmes.
• RU4. Erasmo Neviani est le leader du RU4. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 111 publications, avec un nombre total de citations de 1 508 et un indice h de 22. L'UR4 a acquis une bonne expérience en écologie microbienne alimentaire pour une évaluation complète et intégrée des populations microbiennes, de la dynamique et de l'état physiologique des cellules à différentes étapes de la fabrication des aliments. Dans le cadre de ce projet, RU4 est impliqué dans : la préparation des agendas ; recrutement de bénévoles; administration d'agendas; manipulation et préparation d'échantillons biologiques; détermination des principaux groupes microbiens dans les échantillons fécaux par des méthodes dépendantes de la culture ; élaboration des résultats à partir des agendas ; détermination des principaux groupes microbiens dans les aliments par des méthodes dépendantes et indépendantes de la culture ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, l'UR4 collaborera avec le Département des sciences et technologies alimentaires de l'Université agricole d'Athènes, Grèce, pour la détermination microbienne dans les aliments et, en particulier, dans les produits laitiers, avec l'Unité d'épidémiologie de la Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori de Milan, Italie, pour l'assistance à l'enregistrement des habitudes alimentaires, et avec l'Institut national de recherche sur l'alimentation et la nutrition de Rome, Italie, pour le suivi des carences présumées liées aux régimes alimentaires restrictifs.
• RU5. Aldo Corsetti est le leader du RU5. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 81 publications avec un nombre total de citations de 2 084 et un indice h de 28. RU5 a acquis une bonne expérience dans le domaine de l'écologie microbienne des aliments et boissons ainsi que dans celui de la caractérisation des souches pour les aspects biotechnologiques et fonctionnels, afin de sélectionner des cultures starter pour différentes applications. Au sein de ce projet, l'UR5 est impliquée dans : la détermination des principaux groupes microbiens dans les aliments par des méthodes culture-dépendantes ; identification et typage des microbes isolés des aliments ; caractérisation de la génotoxicité des échantillons fécaux ; caractérisation de l'activité anti-génotoxigène des isolats microbiens d'aliments ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, l'UR5 collaborera avec le Département des sciences agricoles, alimentaires et nutritionnelles de l'Université d'Alberta, Canada, pour le typage moléculaire des micro-organismes isolés dans les aliments par un séquençage de type multi-locus.
• RU6. Patrizia Brigidi est la dirigeante du RU6. Comme le rapporte ISI Web of Science, elle est l'auteur de 102 publications qui ont été citées 3 158 fois, avec une moyenne de citations par publication de 32,41 et un indice h de 26. RU6 possède une compétence consolidée et étendue dans le domaine de l'identification et de la quantification moléculaire des bactéries d'écosystèmes complexes (fèces et biopsies intestinales) et dans le domaine des mécanismes moléculaires responsables des bienfaits des bactéries sur la santé. Dans le cadre de ce projet, RU6 s'implique dans : le recrutement de volontaires ; administration d'agendas; manipulation et préparation d'échantillons biologiques; détermination des principaux groupes microbiens dans les échantillons fécaux par des méthodes dépendantes de la culture ; caractérisation méta-transcriptomique d'échantillons fécaux sélectionnés d'individus ayant des habitudes alimentaires différentes ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, le RU6 collaborera avec la Food Microbial Science Unit, University of Reading, Royaume-Uni, pour le développement de la plateforme métatranscriptomique et dans l'analyse bioinformatique des séquences obtenues pour leur affectation au cluster d'activités fonctionnelles KEGG et COG.
• RU7. Francesca Clementi est la dirigeante de RU7. Comme le rapporte ISI Web of Science, elle est l'auteur de 59 publications qui ont été citées 504 fois, avec une moyenne de citations par publication de 11,25 et un indice h de 15. L'UR7 dispose d'une expertise de confiance concernant le rôle, la surveillance et le contrôle des micro-organismes d'origine alimentaire, en particulier les bactéries lactiques. Au sein de ce projet, l'UR7 est impliquée dans : la caractérisation de la diversité du microbiote alimentaire par PCR-DGGE ; détermination de la résistance aux antibiotiques dans des échantillons fécaux et salivaires ; isolement et identification de bactéries lactiques résistantes aux antibiotiques à partir d'échantillons fécaux et de salive ; caractérisation des gènes impliqués dans la résistance microbienne aux antibiotiques ; étude des mécanismes de transfert de résistance aux antibiotiques entre bactéries ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, le RU7 collaborera avec l'Université grecque Democritus de Thrace, en Grèce, et avec l'Institut Rowett pour la nutrition et la santé de l'Université d'Aberdeen, en Écosse, sur l'étude des gènes de résistance aux antibiotiques transférables dans les aliments et les bactéries lactiques isolées. à partir d'échantillons de salive et de matières fécales.
• RU8. Luca Simone Cocolin est le leader de RU8. Comme le rapporte Scopus, il est l'auteur de 131 publications qui ont été citées 2 036 fois, ce qui donne un indice h de 25. L'UR 8 possède une vaste expérience dans l'application de méthodes indépendantes de la culture pour l'étude de la biodiversité et de la vitalité microbienne dans les aliments fermentés. Il a également des connaissances en PCR quantitative (qPCR) pour la quantification de microorganismes spécifiques d'écosystèmes complexes. Dans le cadre de ce projet, RU8 s'implique dans : le recrutement de volontaires ; administration d'agendas; manipulation et préparation d'échantillons biologiques; détermination des principaux groupes microbiens dans les échantillons fécaux par des méthodes dépendantes de la culture ; profilage du microbiote fécal par des approches DGGE appliquées à la fois au niveau de l'ADN et de l'ARN ; caractérisation méta-génomique d'échantillons fécaux sélectionnés provenant d'individus ayant des habitudes alimentaires différentes ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, RU8 collaborera avec l'Université de Maribor (UM), Slovénie, et l'Université Démocrite de Thrace (DUT), Alexandroupolis, Grèce, pour les aspects traitant de l'interaction pathogènes-cellules hôtes et pour d'éventuelles modifications du régime alimentaire des différents groupes alimentaires, qui peuvent exploiter au mieux le rôle bénéfique connu de certains groupes microbiens associés à des aliments spécifiques, respectivement.
• RU9. Mauro Rossi est le leader du RU9. Comme le rapporte ISI Web of Science, il est l'auteur de 41 publications, avec un nombre total de citations de 1087 et un indice h de 19. L'UR9 a une longue expérience (>25 ans) et de fortes collaborations dans le domaine de la biochimie et de l'immunologie de l'intestin grêle. Au sein de ce projet, RU9 est impliqué dans : l'isolement de lactobacilles et de bifidobactéries à partir d'échantillons fécaux ; caractérisation de la réponse immunitaire in vitro d'isolats fécaux à l'aide de cellules Caco-2 ; caractérisation de la réponse immunitaire in vitro d'isolats fécaux à l'aide de cellules dendritiques ; mesure de la sécrétion de cytokines dans les cellules Caco-2 et dendritiques ; et l'élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, RU9 collaborera avec l'Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valence, Espagne (pièce jointe dans le modèle B), pour déterminer si les particularités du microbiote fécal pourraient jouer un rôle dans l'apparition de dysfonctionnements immunitaires intestinaux.
• RU10. Lucia Vannini est la dirigeante du RU10. Comme le rapporte ISI Web of Science, elle est l'auteur de 27 publications avec un nombre total de citations de 322 et un indice h de 9. L'UR10 a acquis une bonne expérience tant dans le domaine de la microbiologie alimentaire que dans l'utilisation des techniques instrumentales, et notamment la résonance magnétique nucléaire, pour l'analyse des métabolomes d'échantillons biologiques. Au sein de ce projet, l'UR10 est impliquée dans : la caractérisation du métabolome d'aliments sélectionnés ; caractérisation du métabolome des échantillons de salive ; caractérisation du métabolome d'échantillons fécaux et urinaires et élaboration statistique des résultats. Dans le cadre de ce projet, R10 collaborera avec l'Institut suédois de l'alimentation et de la biotechnologie, Suède, et l'Institut de technologie chimique, Département de recherche et développement, Prague, République tchèque, pour les aspects, respectivement, concernant la caractérisation métabolomique de certains aliments sélectionnés et échantillons biologiques. L'approche en cascade utilisée rendra chaque activité de recherche et chaque UR indispensables pour atteindre les principaux objectifs du projet.

Cette étude sera composée de différentes activités (AI-VI) décrites ci-dessous :

• ACTIVITÉ I. Recrutement des individus, administration des agendas, manipulation, préparation et stockage des échantillons biologiques et analyses microbiologiques des échantillons fécaux.
• AI.1. Recrutement des individus et administration des journaux (RU1, 4, 6, 8) Environ 50 volontaires omnivores, végétariens et végétaliens, pour un total de 150 sujets seront recrutés. Les individus végétariens et végétaliens seront recrutés avec la coopération de la Société scientifique italienne de la nutrition végétarienne. Les individus omnivores seront recrutés par le biais d'annonces publiées dans les universités. Environ 50 volontaires sains seront recrutés, dont un nombre approximativement égal d'omnivores, de végétariens et de végétaliens (âge 18-59 ans, ratio hommes/femmes env. 1:1). Les volontaires recrutés seront invités à signer un document de consensus, pour consigner leurs habitudes alimentaires. Les journaux seront élaborés pour obtenir des informations détaillées sur les caractéristiques des aliments, permettant une identification facile des produits sur le marché et une estimation de la charge microbienne présumée ingérée. Le comité d'éthique des universités sera informé avant le démarrage du projet.
• AI.2. Manipulation, préparation et stockage des échantillons biologiques (RU1, 4, 6, 8). Chaque individu fournira des échantillons de salive, de matières fécales et d'urine chaque semaine, pendant une période de trois semaines. Les échantillons en triple seront regroupés avant les analyses afin de limiter la variabilité intra-individuelle. La manipulation sera effectuée différemment selon le type d'échantillons biologiques (salive, fèces, urine) et les analyses subséquentes (p. ex. ADN, ARN, protéome). Parallèlement au recrutement des individus et à la collecte des échantillons biologiques, la plupart des EF seront impliquées dans la mise en place des techniques/méthodes.
• AI.3. Analyses microbiologiques d'échantillons fécaux (RU1, 4, 6, 8). Dans un premier temps, les comptages viables seront effectués en étalant des matières fécales fraîches sur différents milieux de culture sélectifs, afin d'énumérer les groupes microbiens fécaux les plus courants.
• AI.4. Mise en place des techniques/méthodes (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Parallèlement au recrutement des individus et à la collecte des échantillons biologiques, la plupart des EF seront impliquées dans la mise en place des techniques/méthodes. Afin d'établir une plate-forme indépendante et compétitive pour les analyses méta-omiques, RU3 achètera des équipements de séquençage à haut débit, ce qui constitue un investissement économique majeur dans ce projet.
• ACTIVITÉ II. Microbiote alimentaire et métabolome. Sur la base des informations des journaux alimentaires, les aliments les plus représentatifs des 3 régimes seront répartis en 3 catégories : (i) faible (TBC, 10^3 ufc/g) ; (ii) intermédiaire (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); et (iii) charge microbienne élevée (TBC ³ 10^6 ufc/g). Pour les aliments du groupe (i), le nombre microbien sera estimé sur la base des données de la littérature. Pour les aliments des groupes (ii) et (iii), le nombre microbien sera déterminé sur la base des données de la littérature dans le cas de produits bien connus avec une faible différenciation sur le marché (par exemple, le fromage Parmigiano Reggiano), tandis que des analyses appropriées seront effectuées dans le cas de produits avec une grande variabilité du marché (par exemple, le fromage Mozzarella). Dans ce dernier cas, les analyses porteront sur un grand nombre de produits disponibles sur le marché. La diversité microbienne des aliments sera étudiée plus en profondeur d'abord par PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel electrophoresis) et si nécessaire par séquençage en profondeur sur la base du niveau de complexité et des connaissances actuelles du microbiote des aliments spécifiques.
• AII.1 Détermination quantitative des micro-organismes dans les aliments (RU 4, 5 ; 7). L'analyse des aliments sera partagée entre les RU4 et 5, et certains échantillons seront analysés par les deux RU pour valider réciproquement les résultats. Par la suite, RU4 caractérisera les aliments sélectionnés par analyse LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction), et les résultats seront comparés à ceux obtenus par RU7 en utilisant PCR-DGGE. RU5 identifiera une large collection d'isolats provenant d'aliments, visant à trouver des relations possibles avec une activité anti-génotoxique réduite des eaux fécales et la présence de micro-organismes spécifiques dans les aliments ingérés.
• AII.2 Diversité microbienne dans les aliments (RU 2, 3). Premièrement, cette activité examinera les aliments mal caractérisés qui sont spécifiquement consommés par les végétariens et les végétaliens sur la base des enregistrements des journaux. Le microbiote et le microbiote seront étudiés. Les analyses PCR-DGGE pour les levures et les champignons filamenteux seront basées sur l'amplification de parties du domaine D1/D2 codant pour la sous-unité LSU ou 26S de l'ARNr, et les régions ITS (Internal tranrated spacer). La région V3 du gène de l'ARNr 16S sera ciblée pour détecter les bactéries. Après analyse DGGE, les gels obtenus seront numérisés et analysés par le logiciel Bionumerics. Les dendrogrammes seront soumis à une analyse par grappes pour exclure du séquençage ultérieur les échantillons ayant un coefficient de similarité de 85 % ; une telle sélection permettra d'économiser les coûts du séquençage de nouvelle génération et assurera d'obtenir une quantité gérable de données à analyser via la bio-informatique. RU3 effectuera le séquençage en profondeur en utilisant des bibliothèques d'amplicons de gènes variables d'intérêt taxonomique et en utilisant des procédures spécifiques selon le type de plateforme de séquençage qui sera achetée. Les résultats du séquençage seront élaborés sur une base bioinformatique par l'UR2.
• AII.3 Métabolome alimentaire (RU 10). Sur la base des informations sur les habitudes alimentaires, les aliments fermentés les plus représentés dans les trois régimes seront analysés pour trouver une éventuelle relation entre les composés chimiques ingérés (par exemple, l'acide salycilique) et présumément récupérés dans les échantillons biologiques. Les analyses du métabolome seront réalisées par GC-MS/SPME (Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse/microextraction en phase solide) et spectroscopie FTIR (Fourier Transform Infrared).
• ACTIVITÉ III. Le microbiote des matières fécales et de la salive. Au préalable, tous les échantillons de salive et de matières fécales de tous les ca. 150 volontaires seront soumis à des analyses PCR-DGGE pour avoir un aperçu de la diversité microbienne. La RT-PCR-DGGE (réaction en chaîne par polymérase en temps réel - électrophorèse sur gel à gradient dénaturant) sera également envisagée pour estimer les populations viables dans les matières fécales. Sur la base de ces analyses, des échantillons représentatifs de chaque habitude alimentaire seront soumis à un séquençage de nouvelle génération. La sortie de l'ensemble de ces résultats devrait permettre, étape par étape, la sélection de 4/5 échantillons fécaux pour chacun des trois régimes à soumettre à des analyses méta-omiques.
• ACTIVITÉ III.1. Etude de la biodiversité.
• AIII.1.1. Profilage PCR-DGGE (RU 2, 3, 8) Les analyses PCR-DGGE pour les levures et les champignons filamenteux cibleront les régions ARNr 26S et ITS, tandis que les régions V3 et/ou V6-V8 de l'ARNr 16S seront étudiées pour les bactéries. L'ADN et l'ARN (après RT-PCR) seront utilisés comme cible pour étudier les populations totales et viables, respectivement. Dans les mêmes conditions expérimentales, RU3 caractérisera la diversité bactérienne des échantillons de salive. Après des analyses DGGE, image et cluster à partir d'échantillons d'ADN et d'ARN, il sera possible de définir une différence entre la population globale et viable. Les dendrogrammes de similarité seront utilisés pour exclure de l'activité de séquençage ultérieure les échantillons ayant un coefficient de similarité ³ 85 % ; une telle sélection réduira les coûts des analyses de séquençage de nouvelle génération et assurera d'obtenir une quantité gérable de données à analyser via la bio-informatique.
• AIII.1.2. Séquençage de nouvelle génération (RU 3, 8) Le séquençage en profondeur sur des échantillons sélectionnés de salive et de matières fécales sera effectué à l'aide de bibliothèques d'amplicons de gènes variables d'intérêt taxonomique. Tous les résultats de séquençage obtenus à la fois pour les bactéries et les champignons seront élaborés sur une base bioinformatique par l'UR2.
• AIII.1.3. Résistance aux antibiotiques (RU 7) L'ADN extrait directement d'échantillons de salive et de matières fécales sera criblé pour détecter la présence de gènes codant pour des résistances à plusieurs antibiotiques à l'aide de tests PCR. Les échantillons, qui se sont avérés positifs pour les gènes de résistance aux antibiotiques (AR), seront utilisés pour isoler les lactobacilles, les lactocoques et les entérocoques résistants aux antibiotiques. Après identification, les isolats présentant des valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) supérieures aux seuils correspondants seront confirmés par amplification PCR des gènes AR correspondants. La possibilité de transférer des gènes AR localisés sur des éléments génétiques mobiles d'isolats vers des bactéries d'intérêt clinique sera évaluée par des essais de conjugaison.
• AIII.2. Analyses méta-omiques d'échantillons fécaux sélectionnés Selon l'approche en cascade, les résultats de l'étude de la diversité microbienne d'échantillons fécaux sélectionneront 4/5 individus représentatifs de chacun des 3 types de régime (4/5 x 3 = 12/ 15) pour être soumis à des analyses méta-omiques. Les approches méta-omiques fourniront une base de données interne, constituée des séquences d'ADN et d'ARN des microbiomes fécaux des 12/15 individus, ce qui permettra une vision complète des protéines synthétisées.
• AIII.2.1. Méta-génomique (RU3, 8) L'ADN fécal sera quantifié et un protocole de séquençage shotgun sera appliqué pour l'analyse méta-génomique. Cette tâche devrait être effectuée par l'UR3, en fonction des performances et de la disponibilité de la plate-forme de séquençage, qui sera engagée à plein temps dans l'analyse des amplicons d'ADN et d'ADNc des matières fécales et de la salive. Alternativement, des entreprises spécialisées effectueront cette tâche en tant que service.
• AIII.2.2. Méta-transcriptomique (RU 6) Le profil global d'expression des gènes microbiens sera caractérisé à l'aide d'une approche métatranscriptomique innovante basée sur Illumina et du protocole mis en place au cours des premiers mois du projet. L'ADNc sera synthétisé à partir de l'ARN selon des procédures optimisées. Une amplification aléatoire de l'ADNc sera effectuée et l'ADNc sera séquencé à l'aide de la plateforme Illumina HiSeq. Les méta-transcriptomes séquencés seront assemblés à l'aide de packages Velvet/MetaVelvet ou SOAPdenovo pour obtenir la plus grande séquence consensus possible. Les séquences de transcriptions seront annotées à l'aide de pipelines bien établis et les transcriptions seront recherchées à l'aide de RPS-BLAST (Reversed Position Specific-Basic Local Alignment Search Tool) par rapport à KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) et les bases de données Genbank. Les lectures de type bactérie identifiées par nr BLASTX seront recherchées plus avant dans la base de données COG. Les rôles fonctionnels des séquences seront attribués en fonction des recherches KEGG et COG.
• AIII.2.3. Méta-protéomique (RU1) Sur la base du flux de travail conçu au cours des premiers mois d'activité, les protéines seront extraites de chaque échantillon fécal et analysées par protéomique sans gel et/ou à base de gel. L'identification des peptides sera réalisée à l'aide du spectromètre de masse Finnigan LCQ Deca XP MAX. Une analyse protéomique différentielle sera effectuée. Pour l'identification des peptides, l'algorithme de recherche de spectres de masse ouverts sera utilisé pour rechercher les spectres MS/MS dans les bases de données disponibles. Pour récupérer d'autres informations fonctionnelles, les protéines basées sur la classification COG seront annotées. Les COG identifiés seront cartographiés sur la base de données des voies métaboliques KEGG et visualisés par l'application en ligne d'iPath. Après correction FDR, tous les peptides identifiés seront recherchés par rapport à UniProtKB puis cartographiés. Pour aborder le niveau fonctionnel le plus élevé de toutes les protéines identifiées, les COG identifiés sur les voies KEGG seront cartographiés. Outre le noyau microbien commun, les différences inter-individuelles et inter-régimes seront déterminées en termes de fonction métabolique.
• ACTIVITÉ IV. Caractérisation fonctionnelle. La caractérisation de certaines caractéristiques fonctionnelles d'échantillons fécaux et d'isolats microbiens provenant d'échantillons fécaux renforcera le lien entre l'alimentation et le microbiote intestinal.
• AIV.1 Activités fécales génotoxiques et anti-génotoxiques (RU 5) Des échantillons d'eau fécale (EF) seront préparés et la génotoxicité sera déterminée par le test Comet. Les entérocytes HT29 (10^6 cellules/test) co-exposés au FW et incorporés dans la lame LMA seront soumis à une électrophorèse sur gel monocellulaire (SCGE) et analysés par épifluorescence. Plusieurs isolats microbiens provenant d'aliments seront étudiés pour leur activité inhibitrice vis-à-vis des composés génotoxiques et mutagènes potentiellement présents dans l'intestin. L'effet de la co-incubation microorganisme-génotoxine sera dosé par l'évaluation de l'activité génotoxique résiduelle des composés à l'aide du SOS-Chromotest (cible Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) et, en parallèle, du test Comet (cible entérocytes HT29 ).
• AIV.2. Micro-organismes fécaux et modulation de la réponse immunitaire (RU 9) Les conditions de croissance et de différenciation des cellules dendritiques (CD) et des cellules Caco-2 seront mises en place dès les premiers mois d'activité. Des lactobacilles et des bifidobactéries seront isolés de tous les échantillons fécaux et utilisés comme bactéries irradiées pour détecter l'expression de médiateurs immunitaires dans les entérocytes. Les niveaux de sécrétion de transcription et de protéines apparentées d'IL-8 et de TGF-bêta tolérogène (transforming growth factor beta) et de TSLP (thymic stromal lymphopoïétine) seront déterminés. Les bactéries irradiées seront également utilisées pour stimuler les marqueurs de surface dans les cellules DC. L'ARN total sera extrait des cellules Caco-2 et DC, et l'ADNc sera préparé pour examiner l'expression relative des gènes de l'IL-8, du TGF-bêta, du TSLP, du TNF-alpha, de l'IL-12p40 et de l'IL-10 ; la concentration des produits géniques correspondants sera déterminée par ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITÉ V. Salive, métabolome fécal et urinaire (RU10). Pour compléter l'approche « omique », le métabolome d'échantillons de fèces, d'urine et de salive sera analysé avec trois techniques (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) et RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) selon les protocoles préalablement mis en place. Les composés chimiques seront identifiés en utilisant des bases de données de spectres de masse ainsi que des données de spectres de masse dans la littérature et/ou des données de composés chimiques purs. Après décongélation des échantillons d'urine et de salive, l'analyse RMN sera effectuée dans les 2 h. Des échantillons fécaux seront préparés en accordant la plus grande importance à la récupération complète des molécules solubles dans l'eau. Les spectres RMN seront préparés pour l'analyse statistique en corrigeant les désalignements des petits pics grâce à l'algorithme iCoshift.
• ATTIVITÉ VI. Elaboration statistique des résultats (toutes EF). Pendant le développement du projet, RU2 s'occupera de la maintenance du site web en collaboration avec le partenaire CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), le site collectera tous les résultats des différentes activités de recherche. Cette base de données sera utilisée pour l'analyse en "mode R" pour évaluer l'impact de divers descripteurs dans la détermination de la diversité des trois régimes, et en "mode Q" pour déterminer la différence entre les trois régimes. Dans le même temps, les résultats les plus pertinents seront diffusés par le biais de publications scientifiques dans des revues à comité de lecture.

Compte tenu du sujet à étudier, ce projet a sans aucun doute appliqué des aspects potentiels. Par exemple, la connaissance de l'effet de l'alimentation sur le microbiote humain pourrait aboutir à la préparation de lignes directrices appropriées à diffuser dans les campagnes de promotion des soins intégrés. Les préférences, les attitudes, les besoins, le comportement, le mode de vie et l'éducation des consommateurs seront pris en compte, et la communication entre les consommateurs et la communauté de recherche sur la chaîne alimentaire sera améliorée afin d'améliorer le choix éclairé et son impact sur la qualité de vie. Donner aux individus les moyens d'améliorer et de gérer leur santé grâce à de bonnes habitudes alimentaires se traduira par des économies de coûts pour les systèmes de santé.