Microbiota e Metaboloma Relacionado em Dietas Omnívoras, Vegetarianas ou Veganas (MRMOVVD)

O objetivo geral deste projeto é encontrar a relação entre dieta e saliva e microbiota fecal, por meio de análises meta-ômicas de alto rendimento e integradas (genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica). Várias questões ainda são debatidas neste contexto. Por exemplo, qual é a ingestão diária de micróbios e seu papel no equilíbrio da microbiota intestinal? Como a microbiota intestinal é afetada pelos principais tipos de dieta (onívora, vegetariana e vegana)? Quais são os grupos microbianos predominantes a nível intestinal, dependendo do tipo de dieta? Qual é a contribuição presumida de cada grupo microbiano na manutenção da saúde do hospedeiro? A determinação quantitativa e qualitativa dos principais grupos microbianos presentes nos alimentos, em função dos hábitos alimentares, responde a uma questão anterior e coincide com um dos objetivos deste projeto. A estimativa da diversidade (genômica), atividade funcional (transcriptômica e proteômica) e metabólitos (metabolômica) de, especialmente, a microbiota fecal coincide com a abordagem holística deste projeto e responde a várias das questões anteriores. Considerando a estreita correlação entre o equilíbrio de diferentes populações microbianas em vários nichos do corpo humano e o aparecimento de patologias metabólicas, este projeto deve fornecer novos conhecimentos que possam destacar possíveis relações entre dieta e desmetabolismo. A dieta deve ser considerada como a ferramenta mais adequada e barata para determinar uma microbiota oral e intestinal estável e favorável, que previna doenças e garanta a longevidade humana. Esses objetivos gerais do projeto serão alcançados com base em metas específicas, tais como: (i) a identificação de marcadores biológicos, moleculares e metabólicos específicos para o tipo de dieta; (ii) a estimativa das diferenças na microbiota e metaboloma da saliva e das fezes, tanto entre indivíduos como entre tipos de dieta; (iii) a estimativa das diferenças qualitativas e quantitativas na ingestão microbiana ligada ao tipo de dieta; e (iv) a identificação das características funcionais das amostras fecais relacionadas ao tipo de dieta, que podem ser consideradas como indicadores de suscetibilidade a doenças.

Com o objetivo de atingir o objetivo geral deste projeto, dez Unidades de Pesquisa (RUs; RU1-10) estão envolvidas na proposta, com a parceria de 16 Instituições Nacionais e, principalmente, estrangeiras, abrangendo 12 países diferentes. Os líderes de cada RU são relatados a seguir:

• RU1. Marco Gobbetti é o Investigador Principal da proposta e líder do RU1. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 188 publicações que foram citadas 4.075 vezes, com uma média de citações por publicação de 21,68 e um índice h de 39. Ele foi recentemente listado no Top Italian Scientists pela VIA Academy (avaliação anual para cientistas com um valor de índice h superior a 30). O RU1 tem adquirido uma boa experiência no estudo da microbiota intestinal de celíacos, e na proteómica aplicada a bactérias lácticas e alimentos. RU1 desempenhará o papel de coordenador do projeto. Neste projeto, o RU1 está envolvido em: recrutamento de voluntários; administração de diários; manipulação e preparação de amostras biológicas; determinação dos principais grupos microbianos nas amostras fecais por métodos dependentes da cultura; caracterização meta-proteômica de amostras fecais selecionadas de indivíduos com diferentes hábitos alimentares; e elaboração estatística dos resultados. Neste projeto, o RU1 colaborará com o Instituto de Investigação em Ciências da Alimentação, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Espanha, para a atribuição específica de atividades funcionais e/ou vias metabólicas às proteínas identificadas e com o Departamento de Microbiology da University College Cork, Irlanda, pela abordagem bioinformática para estudos de proteomas.
• RU2. Gianluigi Cardinali é o líder do RU2. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 38 publicações com um índice h de 11. A RU2 atua há aproximadamente vinte anos na área de biodiversidade e taxonomia de leveduras, que são analisadas por meio de técnicas microbiológicas e moleculares. Neste projeto, o RU2 está envolvido em: caracterização da diversidade da micobiota alimentar através da abordagem PCR-DGGE; caracterização da micobiota de amostras fecais através da abordagem PCR-DGGE; e, como líder, na gestão da elaboração estatística dos resultados de todas as RUs, disponibilizando uma base de dados comum. O RU2 colaborará com o Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Holanda, para a elaboração bioinformática dos dados.
• RU3. Danilo Ercolini é o líder da RU3. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 58 publicações, com um número total de citações de 1.354 e um índice h de 21. O RU3 está envolvido há anos em estudos de ecologia microbiana de ecossistemas complexos, principalmente ecossistemas alimentares. A microbiota alimentar sempre foi estudada por abordagens moleculares avançadas e por métodos independentes de cultura que não requerem cultivo de microrganismos em meios sintéticos. Neste projeto, o RU3 está envolvido em: caracterização da diversidade da microbiota em amostras de saliva; sequenciamento profundo de amostras de alimentos selecionados; sequenciamento profundo de amostras selecionadas de fezes e saliva; caracterização metagenômica de amostras fecais selecionadas de indivíduos com diferentes hábitos alimentares; e elaboração estatística dos resultados. Dentro deste projeto, o RU3 irá colaborar com o Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) que é executado no Argonne National Laboratory, Lemont, Estados Unidos, para criar conjuntos de dados que descrevem microrganismos de uma ampla gama de ecossistemas.
• RU4. Erasmo Neviani é o líder do RU4. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 111 publicações, com um número total de citações de 1.508 e um índice h de 22. O RU4 adquiriu boa experiência em ecologia microbiana alimentar para uma avaliação abrangente e integrada das populações microbianas, dinâmica e estado fisiológico das células em vários estágios da fabricação de alimentos. Neste projeto, o RU4 está envolvido em: elaboração de diários; recrutamento de voluntários; administração de diários; manipulação e preparação de amostras biológicas; determinação dos principais grupos microbianos nas amostras fecais por métodos dependentes da cultura; elaboração dos resultados dos diários; determinação dos principais grupos microbianos em alimentos por métodos dependentes e independentes de cultura; e elaboração estatística dos resultados. Dentro deste projeto, o RU4 irá colaborar com o Departamento de Ciência e Tecnologia Alimentar da Agricultural University of Athens, Grécia, para a determinação microbiana em alimentos e, especialmente, em produtos lácteos, com a Unidade de Epidemiologia da Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori de Milão, Itália, pela assistência no registro dos hábitos alimentares, e ao Instituto Nacional de Pesquisa de Alimentos e Nutrição de Roma, Itália, pelo monitoramento das supostas deficiências relacionadas a regimes alimentares restritivos.
• RU5. Aldo Corsetti é o líder do RU5. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 81 publicações com um número total de citações de 2.084 e um índice h de 28. RU5 tem uma boa experiência no campo da ecologia microbiana de alimentos e bebidas, bem como na caracterização de cepas para aspectos biotecnológicos e funcionais, a fim de selecionar culturas iniciadoras para diferentes aplicações. Neste projeto, o RU5 está envolvido em: determinação dos principais grupos microbianos em alimentos através de métodos dependentes de cultura; identificação e tipagem de microrganismos isolados de alimentos; caracterização da genotoxicidade de amostras fecais; caracterização da atividade antigenotoxigênica de isolados microbianos de alimentos; e elaboração estatística dos resultados. Dentro deste projeto, o RU5 colaborará com o Departamento de Ciências Agrícolas, Alimentares e Nutricionais da Universidade de Alberta, Canadá, para a tipagem molecular de microorganismos isolados de alimentos por um sequenciamento multi-locus.
• RU6. Patrizia Brigidi é a líder do RU6. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ela é autora de 102 publicações que foram citadas 3.158 vezes, com uma média de citações por publicação de 32,41 e um índice h de 26. A RU6 tem uma competência consolidada e alargada no domínio da identificação e quantificação molecular de bactérias de ecossistemas complexos (fezes e biópsias intestinais) e no domínio dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelos benefícios para a saúde das bactérias. Neste projeto, o RU6 está envolvido em: recrutamento de voluntários; administração de diários; manipulação e preparação de amostras biológicas; determinação dos principais grupos microbianos nas amostras fecais por métodos dependentes da cultura; caracterização metatranscriptômica de amostras fecais selecionadas de indivíduos com diferentes hábitos alimentares; e elaboração estatística dos resultados. No âmbito deste projeto, o RU6 irá colaborar com a Food Microbial Science Unit, University of Reading, Reino Unido, no desenvolvimento da plataforma metatranscriptómica e na análise bioinformática das sequências obtidas para a sua atribuição ao cluster de atividades funcionais KEGG e COG.
• RU7. Francesca Clementi é a líder do RU7. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ela é autora de 59 publicações que foram citadas 504 vezes, com uma média de citações por publicação de 11,25 e um índice h de 15. O RU7 possui uma experiência confiável no que diz respeito ao papel, monitoramento e controle de microorganismos de origem alimentar, especialmente bactérias ácido-láticas. Neste projeto, o RU7 está envolvido em: caracterização da diversidade da microbiota alimentar por PCR-DGGE; determinação da resistência a antibióticos em amostras fecais e de saliva; isolamento e identificação de bactérias lácticas resistentes a antibióticos a partir de amostras fecais e de saliva; caracterização dos genes envolvidos na resistência microbiana aos antibióticos; estudo dos mecanismos de transferência de resistência a antibióticos entre bactérias; e elaboração estatística dos resultados. Neste projeto, o RU7 colaborará com a Greek Democritus University of Thrace, Grécia, e com o Rowett Institute for Nutrition and Health da University of Aberdeen, Escócia, na investigação de genes transferíveis de resistência a antibióticos em alimentos e bactérias láticas isoladas de amostras de saliva e fezes.
• RU8. Luca Simone Cocolin é o líder do RU8. Conforme relatado pela Scopus, ele é autor de 131 publicações que foram citadas 2.036 vezes, resultando em um índice h de 25. A RU 8 tem uma vasta experiência na aplicação de métodos independentes de cultura para o estudo da biodiversidade e vitalidade microbiana em alimentos fermentados. Possui também conhecimento de PCR quantitativo (qPCR) para a quantificação de microrganismos específicos de ecossistemas complexos. Neste projeto, o RU8 está envolvido em: recrutamento de voluntários; administração de diários; manipulação e preparação de amostras biológicas; determinação dos principais grupos microbianos nas amostras fecais por métodos dependentes da cultura; caracterização da microbiota fecal por abordagens DGGE aplicadas tanto ao nível do ADN como do ARN; caracterização metagenômica de amostras fecais selecionadas de indivíduos com diferentes hábitos alimentares; e elaboração estatística dos resultados. Dentro deste projeto, o RU8 irá colaborar com a Universidade de Maribor (UM), Eslovênia, e a Universidade Democritus da Trácia (DUT), Alexandroupolis, Grécia, para aspectos relacionados à interação de patógenos-células hospedeiras e para possíveis modificações do dieta dos diferentes grupos de dieta, que podem explorar melhor o conhecido papel benéfico de certos grupos microbianos associados a alimentos específicos, respectivamente.
• RU9. Mauro Rossi é o líder do RU9. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ele é autor de 41 publicações, com um número total de citações de 1087 e um índice h de 19. O RU9 tem uma longa experiência (>25 anos) e fortes colaborações no campo da bioquímica e imunologia do intestino delgado. Neste projeto, o RU9 está envolvido em: isolamento de lactobacilos e bifidobactérias de amostras fecais; caracterização da resposta imune in vitro de isolados fecais utilizando células Caco-2; caracterização da resposta imune in vitro de isolados fecais utilizando células dendríticas; medição da secreção de citocinas em Caco-2 e células dendríticas; e elaboração estatística dos resultados. Dentro deste projeto, o RU9 colaborará com a Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valência, Espanha (anexo no Modelo B), para estabelecer se as peculiaridades da microbiota fecal podem desempenhar um papel no aparecimento de disfunções imunológicas intestinais.
• RU10. Lucia Vannini é a líder do RU10. Conforme relatado pelo ISI Web of Science, ela é autora de 27 publicações com um número total de citações de 322 e um índice h de 9. O RU10 tem adquirido uma boa experiência quer na área da microbiologia alimentar, quer na utilização de técnicas instrumentais, nomeadamente ressonância magnética nuclear, para análise de metabolomas de amostras biológicas. Neste projeto, o RU10 está envolvido em: caracterização metabolômica de alimentos selecionados; caracterização metabolômica de amostras de saliva; caracterização metabolômica de amostras fecais e urinárias e elaboração estatística dos resultados. Neste projeto, o R10 colaborará com o Instituto Sueco de Alimentos e Biotecnologia, Suécia, e o Instituto de Tecnologia Química, Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento, Praga, República Tcheca, para aspectos, respectivamente, relativos à caracterização metabolômica de alguns alimentos selecionados e amostras biológicas. A abordagem em cascata utilizada tornará cada atividade de investigação e cada RU indispensáveis ​​para atingir os objetivos principais do projeto.

Este estudo será composto por diferentes atividades (AI-VI) descritas abaixo:

• ACTIVIDADE I. Recrutamento de indivíduos, administração de diários, manuseamento, preparação e armazenamento de amostras biológicas e análises microbiológicas de amostras fecais.
• AI.1. Recrutamento de indivíduos e administração de diários (RU1, 4, 6, 8) Serão recrutados cerca de 50 voluntários onívoros, vegetarianos e veganos, para um total de 150 indivíduos. Os indivíduos vegetarianos e veganos serão recrutados com a cooperação da Sociedade Científica Italiana de Nutrição Vegetariana. Indivíduos onívoros serão recrutados por meio de anúncios publicados nas Universidades. Cerca de 50 voluntários saudáveis ​​serão recrutados, incluindo um número aproximadamente igual de onívoros, vegetarianos e veganos (idade 18-59 anos, proporção homem/mulher ca. 1:1). Os voluntários recrutados serão convidados a assinar um documento de consenso, para registrar seus hábitos alimentares. Os diários serão elaborados para obter informações detalhadas sobre as características dos alimentos, permitindo uma fácil identificação dos produtos no mercado e uma estimativa da presumível carga microbiana ingerida. O Comitê de Ética das Universidades será informado antes do início do projeto.
• AI.2. Manipulação, preparação e armazenamento de amostras biológicas (RU1, 4, 6, 8). Cada indivíduo fornecerá amostras de saliva, fezes e urina semanalmente, por um período de três semanas. Amostras triplicadas serão agrupadas antes das análises para limitar a variabilidade intraindividual. O manuseio será realizado de forma diferente, dependendo do tipo de amostras biológicas (saliva, fezes, urina) e análises subsequentes (por exemplo, DNA, RNA, proteoma). Simultaneamente ao recrutamento de indivíduos e recolha de amostras biológicas, a generalidade das RU estará envolvida na montagem das técnicas/métodos.
• AI.3. Análises microbiológicas de amostras fecais (RU1, 4, 6, 8). Na primeira vez, as contagens viáveis ​​serão realizadas por semeadura de material fecal fresco em diferentes meios de cultura seletivos, para enumerar os grupos microbianos fecais mais comuns.
• AI.4. Definição de técnicas/métodos (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Simultaneamente ao recrutamento de indivíduos e recolha de amostras biológicas, a generalidade das RU estará envolvida na montagem das técnicas/métodos. A fim de estabelecer uma plataforma independente e competitiva para análises meta-ômicas, a RU3 adquirirá equipamentos para sequenciamento de alto rendimento, que é o principal investimento econômico neste projeto.
• ATIVIDADE II. Microbiota alimentar e metaboloma. Com base nas informações dos diários dietéticos, os alimentos mais representativos das 3 dietas serão divididos em 3 categorias: (i) baixo (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) intermediário (TBC 10^3 - 10^6 cfu/g); e (iii) alta carga microbiana (TBC ³ 10^6 cfu/g). Para alimentos do grupo (i) o número microbiano será estimado com base em dados da literatura. Para alimentos dos grupos (ii) e (iii) o número microbiano será determinado com base em dados da literatura no caso de produtos bem conhecidos e com baixa diferenciação de mercado (por exemplo, queijo Parmigiano Reggiano), enquanto análises apropriadas serão feitas no caso de produtos com grande variabilidade de mercado (ex.: Queijo Mussarela). Neste último caso, as análises envolverão um grande número de produtos disponíveis no mercado. A diversidade microbiana dos alimentos será estudada mais a fundo primeiro por PCR-DGGE (Polimerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel eletroforese) e quando necessário por sequenciamento profundo com base no nível de complexidade e conhecimento atual da microbiota dos alimentos específicos.
• AII.1 Determinação quantitativa de microrganismos em alimentos (RU 4, 5; 7). A análise dos alimentos será compartilhada entre os RU4 e 5, e algumas amostras serão analisadas por ambos os RU para validar reciprocamente os resultados. Posteriormente, o RU4 caracterizará os alimentos selecionados pela análise LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) e os resultados serão comparados com os obtidos pelo RU7 utilizando PCR-DGGE. O RU5 identificará uma grande coleção de isolados de alimentos, visando encontrar possíveis relações com uma atividade antigenotóxica reduzida das águas fecais e presença de microrganismos específicos nos alimentos ingeridos.
• AII.2 Diversidade microbiana em alimentos (RU 2, 3). Em primeiro lugar, esta atividade considerará alimentos mal caracterizados que são especificamente consumidos por vegetarianos e veganos com base em registros de diários. Tanto a micro quanto a micobiota serão investigadas. As análises de PCR-DGGE para leveduras e fungos filamentosos serão baseadas na amplificação de partes do domínio D1/D2 que codificam a subunidade LSU ou 26S do rRNA e as regiões ITS (Internal transcrited spacer). A região V3 do gene 16S rRNA será direcionada para detectar bactérias. Após a análise DGGE, os géis resultantes serão digitalizados e analisados ​​pelo software Bionumerics. Os dendrogramas serão submetidos à análise de agrupamento para excluir do sequenciamento posterior aquelas amostras com coeficiente de similaridade de 85%; tal seleção economizará custos de sequenciamento de próxima geração e garantirá uma quantidade gerenciável de dados a serem analisados ​​via bioinformática. A RU3 fará o sequenciamento profundo utilizando bibliotecas de amplicons de genes variáveis ​​de interesse taxonômico e utilizando procedimentos específicos de acordo com o tipo de plataforma de sequenciamento que será adquirida. Os resultados do sequenciamento serão elaborados em base bioinformática pelo RU2.
• AII.3 Metaboloma alimentar (RU 10). Com base nas informações sobre hábitos alimentares, os alimentos fermentados mais representados nas três dietas serão analisados ​​para encontrar uma possível relação entre compostos químicos ingeridos (por exemplo, ácido salicílico) e presumivelmente recuperados em amostras biológicas. As análises dos metabolomas serão realizadas por GC-MS/SPME (Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas/Microextração em Fase Sólida) e FTIR (Fourier Transform Infrared).
• ATIVIDADE III. A microbiota das fezes e da saliva. Preliminarmente, todas as amostras de saliva e fezes de todos os ca. 150 voluntários serão submetidos a análises de PCR-DGGE para obter uma visão geral da diversidade microbiana. RT-PCR-DGGE (Real Time - Reação em Cadeia da Polimerase - Eletroforese em gel de gradiente desnaturante) também será considerado para estimar populações viáveis ​​nas fezes. Com base nessas análises, amostras representativas de cada hábito alimentar serão submetidas ao sequenciamento de próxima geração. A produção de todos estes resultados deve permitir, passo a passo, a seleção de 4/5 amostras fecais para cada uma das três dietas a serem submetidas a análises meta-ômicas.
• ATIVIDADE III.1. Estudo da biodiversidade.
• AIII.1.1. PCR-DGGE Profiling (RU 2, 3, 8) As análises de PCR-DGGE para leveduras e fungos filamentosos terão como alvo as regiões 26S rRNA e ITS, enquanto as regiões V3 e/ou V6-V8 do 16S rRNA serão estudadas para bactérias. Tanto DNA quanto RNA (após RT-PCR) serão usados ​​como alvo para investigar populações totais e viáveis, respectivamente. Nas mesmas condições experimentais, RU3 caracterizará a diversidade bacteriana de amostras de saliva. Após DGGE, análises de imagem e cluster de amostras de DNA e RNA, será possível definir uma diferença entre a população global e viável. Os dendrogramas de similaridade serão usados ​​para excluir da próxima atividade de sequenciamento aquelas amostras com coeficiente de similaridade ³ 85%; tal seleção economizará custos das análises de sequenciamento de próxima geração e garantirá a obtenção de uma quantidade gerenciável de dados a serem analisados ​​via bioinformática.
• AIII.1.2. Sequenciamento de Nova Geração (RU 3, 8) Sequenciamento profundo em amostras selecionadas de saliva e fezes será feito usando bibliotecas de amplicons de genes variáveis ​​de interesse taxonômico. Todos os resultados de sequenciamento obtidos tanto para bactérias quanto para fungos serão elaborados em base bioinformática pelo RU2.
• AIII.1.3. Resistência a antibióticos (RU 7) DNA extraído diretamente de amostras de saliva e fezes será rastreado para a ocorrência de genes que codificam para resistência a vários antibióticos usando ensaios de PCR. As amostras, com resultados positivos para genes de resistência a antibióticos (AR), serão usadas para isolar lactobacilos, lactococos e enterococos resistentes a antibióticos. Após a identificação, os isolados que apresentarem valores de concentração inibitória mínima (CIM) superiores aos correspondentes pontos de quebra serão confirmados por amplificação por PCR dos genes AR correspondentes. A possibilidade de transferência de genes AR localizados em elementos genéticos móveis de isolados para bactérias de interesse clínico será avaliada por ensaios de conjugação.
• AIII.2. Análises meta-ômicas de amostras fecais selecionadas De acordo com a abordagem em cascata, os resultados do estudo da diversidade microbiana das amostras fecais selecionarão 4/5 indivíduos representativos de cada um dos 3 tipos de dieta (4/5 x 3 = 12/ 15) para ser submetido a análises meta-ômicas. As abordagens meta-ômicas fornecerão um banco de dados interno, composto pelas sequências de DNA e RNA dos microbiomas fecais dos 12/15 indivíduos, o que permitirá uma visão completa das proteínas sintetizadas.
• AIII.2.1. Metagenômica (RU3, 8) O DNA fecal será quantificado e um protocolo de sequenciamento shotgun será aplicado para análise metagenômica. Esta tarefa deverá ser realizada pelo RU3, dependendo do desempenho e disponibilidade da plataforma de sequenciamento, que estará engajada em tempo integral na análise de DNA e cDNA amplicons de fezes e saliva. Alternativamente, empresas especializadas realizarão essa tarefa como um serviço.
• AIII.2.2. Metatranscriptômica (RU 6) O perfil geral de expressão gênica microbiana será caracterizado usando uma abordagem metatranscriptômica inovadora baseada em Illumina e o protocolo estabelecido durante os primeiros meses do projeto. O cDNA será sintetizado a partir do RNA de acordo com procedimentos otimizados. A amplificação aleatória do cDNA será realizada e o cDNA será sequenciado usando a plataforma Illumina HiSeq. Os metatranscriptomas sequenciados serão montados juntos usando os pacotes Velvet/MetaVelvet ou SOAPdenovo para alcançar a maior sequência de consenso possível. As sequências de transcrições serão anotadas usando pipelines bem estabelecidos e as transcrições serão pesquisadas usando RPS-BLAST (Reversed Position Specific- Basic Local Alignment Search Tool) contra KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) e bancos de dados do Genbank. Leituras semelhantes a bactérias identificadas por nr BLASTX serão mais pesquisadas no banco de dados COG. Os papéis funcionais das sequências serão atribuídos com base nas pesquisas KEGG e COG.
• AIII.2.3. Meta-proteômica (RU1) Com base no fluxo de trabalho desenhado nos primeiros meses de atividade, as proteínas serão extraídas de cada amostra fecal e analisadas por proteômica gel-free e/ou gel-based. A identificação dos peptídeos será realizada utilizando o espectrômetro de massa Finnigan LCQ Deca XP MAX. Análise proteômica diferencial será realizada. Para a identificação de peptídeos, o algoritmo Open Mass Spectra Search será usado para pesquisar espectros de MS/MS nos bancos de dados disponíveis. Para recuperar mais informações funcionais, as proteínas com base na classificação COG serão anotadas. Os COGs identificados serão mapeados no banco de dados de vias metabólicas KEGG e visualizados pelo aplicativo online do iPath. Após a correção do FDR, todos os peptídeos identificados serão pesquisados ​​contra UniProtKB e então mapeados. Para abordar o nível funcional mais alto de todas as proteínas identificadas, os COGs identificados nas vias KEGG serão mapeados. Além do núcleo microbiano comum, diferenças inter-individuais e inter-dietas serão determinadas em termos de função metabólica.
• ATIVIDADE IV. Caracterização funcional. A caracterização de algumas características funcionais de amostras fecais e de isolados microbianos de amostras fecais fortalecerá a ligação entre dieta e microbiota intestinal.
• AIV.1 Atividades genotóxicas e antigenotóxicas fecais (RU 5) Amostras de água fecal (FW) serão preparadas e a genotoxicidade será determinada pelo ensaio Cometa. Os enterócitos HT29 (10^6 células/ensaio) co-expostos ao FW e incorporados à lâmina LMA serão submetidos à eletroforese em gel de célula única (SCGE) e analisados ​​por epifluorescência. Vários isolados microbianos de alimentos serão investigados quanto à atividade inibitória de compostos genotóxicos e mutagênicos, potencialmente presentes no intestino. O efeito da co-incubação microrganismo-genotoxina será testado através da avaliação da atividade genotóxica residual dos compostos utilizando o SOS-Chromotest (target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) e, paralelamente, o ensaio Comet (target enterocytes HT29 ).
• AIV.2. Microorganismos fecais e modulação da resposta imune (RU 9) As condições de crescimento e diferenciação das células dendríticas (DC) e das células Caco-2 serão estabelecidas nos primeiros meses de atividade. Lactobacilos e bifidobactérias serão isolados de todas as amostras fecais e usados ​​como bactérias irradiadas para detectar a expressão de mediadores imunes em enterócitos. Serão determinados os níveis de secreção de proteína transcrita e cognata de IL-8 e TGF-beta tolerogênico (Transforming growth factor beta) e TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin). Bactérias irradiadas também serão usadas para estimular marcadores de superfície em células DC. O RNA total será extraído das células Caco-2 e DC, e o cDNA será preparado para observar a expressão gênica relativa de IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 e IL-10; a concentração dos produtos gênicos correspondentes será determinada por ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATIVIDADE V. Saliva, metaboloma fecal e urinário (RU10). Para completar a abordagem "ômica", o metaboloma de amostras de fezes, urina e saliva será analisado com três técnicas (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) e NMR (Nuclear Magnetic Resonance) de acordo com os protocolos previamente estabelecidos. Os compostos químicos serão identificados usando bancos de dados de espectros de massa, bem como dados de espectros de massa na literatura e/ou dados de compostos químicos puros. Após o descongelamento das amostras de urina e saliva, a análise de RMN será realizada em 2 h. Amostras fecais serão preparadas dando a máxima importância à completa recuperação das moléculas hidrossolúveis. Os espectros de RMN serão preparados para análise estatística corrigindo os pequenos picos desalinhados através do algoritmo iCoshift.
• ATIVIDADE VI. Elaboração estatística dos resultados (todas as RUs). Durante o desenvolvimento do projeto, RU2 cuidará da manutenção do site em colaboração com o parceiro CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), o site coletará todos os resultados das diferentes atividades de pesquisa. Esta base de dados será utilizada para análise no "modo R" para avaliar o impacto de vários descritores na determinação da diversidade das três dietas, e no "modo Q" para determinar a diferença entre as três dietas. Ao mesmo tempo, os resultados mais relevantes serão divulgados por meio de publicações científicas em periódicos revisados ​​por pares.

Tendo em conta o tema a estudar, este projeto aplicou, sem dúvida, aspetos potenciais. Por exemplo, o conhecimento do efeito da dieta na microbiota humana pode resultar na elaboração de orientações adequadas a serem distribuídas em campanhas de promoção de cuidados integrados. Preferências, atitudes, necessidades, comportamento, estilo de vida e educação dos consumidores serão atendidos, e a comunicação entre os consumidores e a comunidade de pesquisa da cadeia alimentar será aprimorada para melhorar a escolha informada e seu impacto na qualidade de vida. Capacitar os indivíduos para melhorar e gerenciar sua saúde por meio de hábitos alimentares corretos resultará em economia de custos para os sistemas de saúde.