Microbiota e relativo metaboloma nelle diete onnivore, vegetariane o vegane (MRMOVVD)

L'obiettivo generale di questo progetto è trovare la relazione tra dieta e saliva e microbiota fecale, attraverso analisi meta-omiche ad alto rendimento e integrate (genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica). Diverse questioni sono ancora dibattute in questo contesto. Ad esempio, qual è l'assunzione giornaliera di microbi e il loro ruolo sull'equilibrio del microbiota intestinale? Come viene influenzato il microbiota intestinale dai principali tipi di alimentazione (onnivora, vegetariana e vegana)? Quali sono i gruppi microbici prevalenti a livello intestinale, a seconda del tipo di dieta? Qual è il presunto contributo di ciascun gruppo microbico al mantenimento della salute dell'ospite? La determinazione quantitativa e qualitativa dei principali gruppi microbici presenti negli alimenti, in funzione delle abitudini alimentari, risponde ad una precedente domanda e coincide con uno degli obiettivi di questo progetto. La stima della diversità (genomica), dell'attività funzionale (trascrittomica e proteomica) e dei metaboliti (metabolomica) del microbiota fecale, in particolare, coincide con l'approccio olistico di questo progetto e risponde a molte delle domande precedenti. Considerando la stretta correlazione tra l'equilibrio di diverse popolazioni microbiche in varie nicchie del corpo umano e l'insorgenza di patologie metaboliche, questo progetto fornirà nuove conoscenze che possano evidenziare possibili relazioni tra dieta e dismetabolismi. La dieta deve essere considerata come lo strumento più appropriato ed economico per determinare un microbiota orale e intestinale stabile e favorevole, che prevenga le malattie e garantisca la longevità umana. Questi obiettivi generali del progetto saranno raggiunti sulla base di obiettivi specifici, quali: (i) l'identificazione di marcatori biologici, molecolari e metabolici specifici per il tipo di dieta; (ii) la stima delle differenze nel microbiota e nel metaboloma della saliva e delle feci, sia tra individui che tra tipi di dieta; (iii) la stima delle differenze qualitative e quantitative sull'apporto microbico legate al tipo di dieta; e (iv) l'identificazione delle caratteristiche funzionali dei campioni fecali legate al tipo di dieta, che possono essere considerate indicatori di suscettibilità alle malattie.

Al fine di raggiungere l'obiettivo generale di questo progetto, dieci Unità di Ricerca (UR; UR1-10) sono coinvolte nella proposta, con il partenariato di 16 Istituzioni nazionali e, soprattutto, estere, coprendo 12 diversi paesi. Di seguito si riportano i responsabili di ciascuna UR:

• RU1. Marco Gobbetti è il Principal Investigator della proposta e leader dell'UR1. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 188 pubblicazioni che sono state citate 4.075 volte, con una media di citazioni per pubblicazione di 21,68 e un indice h di 39. Recentemente è stato inserito tra i Top Italian Scientists dalla VIA Academy (valutazione annuale per scienziati con un valore di h-index superiore a 30). L'UR1 ha maturato una buona esperienza sullo studio del microbiota intestinale dei celiaci e sulla proteomica applicata ai fermenti lattici e agli alimenti. L'UR1 svolgerà il ruolo di coordinatore del progetto. Nell'ambito di questo progetto, l'UR1 si occupa di: reclutamento di volontari; amministrazione di agende; manipolazione e preparazione di campioni biologici; determinazione dei principali gruppi microbici nei campioni fecali mediante metodi coltura-dipendenti; caratterizzazione meta-proteomica di campioni fecali selezionati da individui con diverse abitudini alimentari; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR1 collaborerà con l'Instituto de Investigacìon en Ciencias de la Alimentacìon, CIAL (CSIC - UAM), Madrid, Spagna, per l'attribuzione specifica di attività funzionali e/o vie metaboliche alle proteine ​​identificate e con il Dipartimento di Microbiologia dell'University College Cork, Irlanda, per l'approccio bioinformatico agli studi sul proteoma.
• RU2. Gianluigi Cardinali è il leader di RU2. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 38 pubblicazioni con un indice h di 11. L'UR2 opera da circa vent'anni nel campo della biodiversità e della tassonomia dei lieviti, che vengono analizzati attraverso tecniche microbiologiche e molecolari. Nell'ambito di questo progetto, l'UR2 si occupa di: caratterizzazione della diversità del microbiota alimentare attraverso l'approccio PCR-DGGE; caratterizzazione del microbiota di campioni fecali mediante approccio PCR-DGGE; e, in qualità di capofila, nella gestione dell'elaborazione statistica dei risultati di tutte le UR, fornendo un database comune. L'UR2 collaborerà con il Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, Paesi Bassi, per l'elaborazione bioinformatica dei dati.
• RU3. Danilo Ercolini è il leader di RU3. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 58 pubblicazioni, con un numero totale di citazioni di 1.354 e un indice h di 21. L'UR3 è impegnata ormai da anni in studi di ecologia microbica di ecosistemi complessi, principalmente ecosistemi alimentari. Il microbiota alimentare è sempre stato studiato mediante approcci molecolari avanzati e metodi indipendenti dalla coltura che non richiedono la coltura di microrganismi su terreni sintetici. Nell'ambito di questo progetto, l'UR3 si occupa di: caratterizzazione della diversità del microbiota nei campioni di saliva; sequenziamento profondo di campioni alimentari selezionati; sequenziamento profondo di campioni fecali e di saliva selezionati; caratterizzazione metagenomica di campioni fecali selezionati da individui con differenti abitudini alimentari; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR3 collaborerà con l'Earth Microbiome Project (EMP, www.earthmicrobiome.org) che viene eseguito nell'Argonne National Laboratory, Lemont, Stati Uniti, per creare set di dati che descrivono i microrganismi da un'ampia gamma di ecosistemi.
• RU4. Erasmo Neviani è il leader della RU4. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 111 pubblicazioni, con un numero totale di citazioni di 1.508 e un indice h di 22. L'UR4 ha maturato una buona esperienza nell'ecologia microbica degli alimenti per una valutazione completa e integrata delle popolazioni microbiche, della dinamica e dello stato fisiologico delle cellule nelle varie fasi della produzione alimentare. All'interno di questo progetto, l'UR4 si occupa di: preparazione dei diari; reclutamento di volontari; amministrazione di agende; manipolazione e preparazione di campioni biologici; determinazione dei principali gruppi microbici nei campioni fecali mediante metodi coltura-dipendenti; elaborazione dei risultati dei diari; determinazione dei principali gruppi microbici negli alimenti mediante metodi coltura-dipendenti e non-indipendenti; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR4 collaborerà con il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari dell'Università Agraria di Atene, Grecia, per la determinazione microbica negli alimenti e, in particolare, nei prodotti lattiero-caseari, con l'Unità di Epidemiologia della Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori di Milano, Italia, per l'assistenza alla registrazione delle abitudini alimentari, e con l'Istituto Nazionale per la Ricerca sugli Alimenti e la Nutrizione di Roma, Italia, per il monitoraggio delle presunte carenze legate a regimi alimentari restrittivi.
• RU5. Aldo Corsetti è il leader di RU5. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 81 pubblicazioni con un numero totale di citazioni di 2.084 e un indice h di 28. L'UR5 ha maturato una buona esperienza nel campo dell'ecologia microbica di alimenti e bevande nonché in quello della caratterizzazione dei ceppi per aspetti biotecnologici e funzionali, al fine di selezionare colture starter per diverse applicazioni. Nell'ambito di questo progetto, l'UR5 si occupa di: determinazione dei principali gruppi microbici negli alimenti mediante metodi coltura-dipendenti; identificazione e tipizzazione di microbi isolati da alimenti; caratterizzazione della genotossicità di campioni fecali; caratterizzazione dell'attività antigenotossigena di isolati microbici da alimenti; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR5 collaborerà con il Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Nutrizionali, Università di Alberta, Canada, per la tipizzazione molecolare di microrganismi isolati dagli alimenti mediante un sequenziamento di tipo multi-locus.
• RU6. Patrizia Brigidi è la leader di RU6. Come riportato da ISI Web of Science, è autrice di 102 pubblicazioni che sono state citate 3.158 volte, con una media di citazioni per pubblicazione di 32,41 e un indice h di 26. L'UR6 ha una consolidata e ampia competenza nel campo dell'identificazione e quantificazione molecolare di batteri provenienti da ecosistemi complessi (feci e biopsie intestinali) e nel campo dei meccanismi molecolari responsabili dei benefici per la salute dei batteri. Nell'ambito di questo progetto, l'UR6 si occupa di: reclutamento di volontari; amministrazione di agende; manipolazione e preparazione di campioni biologici; determinazione dei principali gruppi microbici nei campioni fecali mediante metodi coltura-dipendenti; caratterizzazione meta-trascrittomica di campioni fecali selezionati da individui con differenti abitudini alimentari; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR6 collaborerà con la Food Microbial Science Unit, University of Reading, Regno Unito, per lo sviluppo della piattaforma metatrascrittomica e nell'analisi bioinformatica delle sequenze ottenute per la loro assegnazione a KEGG e COG cluster di attività funzionali.
• RU7. Francesca Clementi è la leader di RU7. Come riportato da ISI Web of Science, è autrice di 59 pubblicazioni che sono state citate 504 volte, con una media di citazioni per pubblicazione di 11,25 e un indice h di 15. L'UR7 ha una competenza affidabile riguardo al ruolo, al monitoraggio e al controllo dei microrganismi di origine alimentare, in particolare dei batteri lattici. Nell'ambito di questo progetto, l'UR7 si occupa di: caratterizzazione della diversità del microbiota alimentare mediante PCR-DGGE; determinazione della resistenza agli antibiotici in campioni fecali e di saliva; isolamento e identificazione di batteri lattici resistenti agli antibiotici da campioni fecali e di saliva; caratterizzazione dei geni coinvolti nella resistenza microbica agli antibiotici; studio dei meccanismi di trasferimento della resistenza agli antibiotici tra batteri; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR7 collaborerà con la Greek Democritus University of Thrace, Grecia, e con il Rowett Institute for Nutrition and Health dell'Università di Aberdeen, Scozia, allo studio di geni trasferibili di resistenza agli antibiotici in alimenti e batteri lattici isolati da campioni di saliva e feci.
• RU8. Luca Simone Cocolin è il leader di RU8. Come riportato da Scopus, è autore di 131 pubblicazioni che sono state citate 2.036 volte, risultando in un indice h di 25. L'UR 8 ha una vasta esperienza nell'applicazione di metodi culture-independent per lo studio della biodiversità microbica e della vitalità negli alimenti fermentati. Ha inoltre conoscenze di PCR quantitativa (qPCR) per la quantificazione di specifici microrganismi da ecosistemi complessi. Nell'ambito di questo progetto, l'UR8 si occupa di: reclutamento di volontari; amministrazione di agende; manipolazione e preparazione di campioni biologici; determinazione dei principali gruppi microbici nei campioni fecali mediante metodi coltura-dipendenti; profiling del microbiota fecale mediante approcci DGGE applicati sia a livello di DNA che di RNA; caratterizzazione metagenomica di campioni fecali selezionati da individui con differenti abitudini alimentari; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR8 collaborerà con l'Università di Maribor (UM), Slovenia, e l'Università Democrito di Tracia (DUT), Alexandroupolis, Grecia, per gli aspetti relativi all'interazione patogeni-cellule ospiti e per eventuali modifiche del dieta dei diversi gruppi dietetici, che possono sfruttare al meglio il noto ruolo benefico di alcuni gruppi microbici associati rispettivamente a specifici alimenti.
• RU9. Mauro Rossi è il leader di RU9. Come riportato da ISI Web of Science, è autore di 41 pubblicazioni, con un numero totale di citazioni di 1087 e un indice h di 19. L'UR9 ha una lunga esperienza (>25 anni) e solide collaborazioni nel campo della biochimica e dell'immunologia dell'intestino tenue. Nell'ambito di questo progetto, l'UR9 si occupa di: isolamento di lattobacilli e bifidobatteri da campioni fecali; caratterizzazione della risposta immunitaria in vitro di isolati fecali utilizzando cellule Caco-2; caratterizzazione della risposta immunitaria in vitro di isolati fecali utilizzando cellule dendritiche; misurazione della secrezione di citochine in Caco-2 e cellule dendritiche; ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, l'UR9 collaborerà con l'Ecofisiología Microbiana y Nutriciòn, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, Spagna (allegato nel Modello B), per stabilire se le peculiarità del microbiota fecale potrebbero svolgere un ruolo nell'insorgenza di disfunzioni immunitarie intestinali.
• RU10. Lucia Vannini è la leader di RU10. Come riportato da ISI Web of Science, è autrice di 27 pubblicazioni con un numero totale di citazioni di 322 e un indice h di 9. L'UR10 ha maturato una buona esperienza sia nell'area della microbiologia degli alimenti che nell'utilizzo di tecniche strumentali, ed in particolare la risonanza magnetica nucleare, per l'analisi del metaboloma di campioni biologici. Nell'ambito di questo progetto, l'UR10 si occupa di: caratterizzazione del metaboloma di alimenti selezionati; caratterizzazione del metaboloma di campioni di saliva; caratterizzazione del metaboloma di campioni fecali e urinari ed elaborazione statistica dei risultati. Nell'ambito di questo progetto, R10 collaborerà con lo Swedish Institute for Food and Biotechnology, Svezia, e l'Institute of Chemical Technology, Department of Research and Development, Prague, Czech Republic, per gli aspetti, rispettivamente, riguardanti la caratterizzazione metabolomica di alcuni alimenti selezionati e campioni biologici. L'approccio a cascata utilizzato renderà ogni attività di ricerca e ogni UR indispensabile per raggiungere gli obiettivi principali del progetto.

Questo studio sarà composto da diverse attività (AI-VI) descritte di seguito:

• ATTIVITÀ I. Reclutamento delle persone, somministrazione dei diari, manipolazione, preparazione e conservazione dei campioni biologici, analisi microbiologiche dei campioni fecali.
• AI.1. Reclutamento individui e somministrazione diari (RU1, 4, 6, 8) Saranno reclutati circa 50 volontari onnivori, vegetariani e vegani, per un totale di 150 soggetti. I soggetti vegetariani e vegani saranno reclutati con la collaborazione della Società Scientifica Italiana di Nutrizione Vegetariana. Gli individui onnivori saranno reclutati attraverso annunci pubblicati presso le Università. Verranno reclutati circa 50 volontari sani di cui un numero approssimativamente uguale di onnivori, vegetariani e vegani (età 18-59 anni, rapporto maschi/femmine ca. 1:1). Ai volontari reclutati verrà chiesto di firmare un documento di consenso, per registrare le loro abitudini alimentari. I diari saranno elaborati per ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche degli alimenti, consentendo una facile identificazione dei prodotti sul mercato e una stima della presunta carica microbica ingerita. Il Comitato Etico delle Università sarà informato prima dell'inizio del progetto.
• AI.2. Manipolazione, preparazione e conservazione dei campioni biologici (UR1, 4, 6, 8). Ogni individuo fornirà settimanalmente campioni di saliva, feci e urine, per un arco temporale di tre settimane. I campioni in triplicato verranno raggruppati prima delle analisi al fine di limitare la variabilità intra-individuale. La manipolazione sarà effettuata in modo diverso a seconda del tipo di campioni biologici (saliva, feci, urine) e delle successive analisi (es. DNA, RNA, proteoma). Contemporaneamente al reclutamento degli individui e alla raccolta dei campioni biologici, la maggior parte delle UR sarà coinvolta nella messa a punto delle tecniche/metodi.
• AI.3. Analisi microbiologiche su campioni fecali (UR1, 4, 6, 8). In un primo tempo le conte vitali saranno effettuate piastrando materiale fecale fresco su diversi terreni di coltura selettivi, per enumerare i gruppi microbici fecali più comuni.
• AI.4. Messa a punto di tecniche/metodi (RU1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Contemporaneamente al reclutamento degli individui e alla raccolta dei campioni biologici, la maggior parte delle UR sarà coinvolta nella messa a punto delle tecniche/metodi. Al fine di stabilire una piattaforma indipendente e competitiva per le analisi meta-omiche, l'UR3 acquisterà apparecchiature per il sequenziamento ad alto rendimento, che rappresenta un investimento economico principale in questo progetto.
• ATTIVITÀ II. Microbiota alimentare e metaboloma. Sulla base delle informazioni dei diari alimentari, gli alimenti più rappresentativi delle 3 diete saranno suddivisi in 3 categorie: (i) basso (TBC, 10^3 cfu/g); (ii) intermedio (TBC 10^3 - 10^6 ufc/g); e (iii) carica microbica elevata (TBC ³ 10^6 cfu/g). Per gli alimenti del gruppo (i) il numero microbico sarà stimato sulla base dei dati della letteratura. Per gli alimenti dei gruppi (ii) e (iii) il numero microbico sarà determinato sulla base dei dati di letteratura nel caso di prodotti ben noti con bassa differenziazione di mercato (es. Parmigiano Reggiano), mentre opportune analisi saranno effettuate nel caso di prodotti con grande variabilità di mercato (es. Mozzarella). In quest'ultimo caso, le analisi riguarderanno un gran numero di prodotti disponibili sul mercato. La diversità microbica degli alimenti sarà studiata in modo più approfondito prima mediante PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel electrophoresis) e quando necessario mediante deep sequencing sulla base del livello di complessità e della conoscenza attuale del microbiota degli alimenti specifici.
• AII.1 Determinazione quantitativa dei microrganismi negli alimenti (UR 4, 5; 7). L'analisi degli alimenti sarà condivisa tra UR4 e 5, e alcuni campioni saranno analizzati da entrambe le UR per validare reciprocamente i risultati. Successivamente, l'UR4 caratterizzerà gli alimenti selezionati mediante analisi LH-PCR (Length Heterogeneity Polymerase Chain Reaction) ei risultati saranno confrontati con quelli ottenuti dall'UR7 mediante PCR-DGGE. L'UR5 identificherà un'ampia raccolta di isolati da alimenti, con l'obiettivo di trovare possibili relazioni con una ridotta attività antigenotossica delle acque fecali e la presenza di microrganismi specifici negli alimenti ingeriti.
• AII.2 Diversità microbica negli alimenti (UR 2, 3). In primo luogo, questa attività prenderà in considerazione alimenti scarsamente caratterizzati che sono specificatamente consumati da vegetariani e vegani sulla base di registrazioni tratte da diari. Saranno studiati sia il micro- che il mico-biota. Le analisi PCR-DGGE per lieviti e funghi filamentosi saranno basate sull'amplificazione di parti del dominio D1/D2 codificanti per la subunità LSU o 26S dell'rRNA e delle regioni ITS (Internal transcription spacer). La regione V3 del gene 16S rRNA sarà mirata per rilevare i batteri. Dopo l'analisi DGGE, i gel risultanti saranno digitalizzati e analizzati dal software Bionumerics. I dendrogrammi saranno sottoposti ad analisi cluster per escludere dall'ulteriore sequenziamento quei campioni aventi un coefficiente di similarità dell'85%; tale selezione consentirà di risparmiare sui costi del sequenziamento di nuova generazione e garantirà di ottenere una quantità gestibile di dati da analizzare tramite bioinformatica. L'UR3 eseguirà il sequenziamento profondo utilizzando librerie di ampliconi di geni variabili di interesse tassonomico e utilizzando procedure specifiche in base al tipo di piattaforma di sequenziamento che verrà acquistata. I risultati del sequenziamento saranno elaborati su base bioinformatica dall'UR2.
• AII.3 Metaboloma alimentare (UR 10). Sulla base delle informazioni sulle abitudini alimentari, verranno analizzati gli alimenti fermentati maggiormente rappresentati nelle tre diete, per trovare una possibile relazione tra i composti chimici ingeriti (es. acido salicilico) e presumibilmente recuperati in campioni biologici. Le analisi del metaboloma saranno effettuate mediante spettroscopia GC-MS/SPME (Gascromatografia-spettrometria di massa/microestrazione in fase solida) e FTIR (Fourier Transform Infrared).
• ATTIVITÀ III. Il microbiota delle feci e della saliva. In via preliminare, tutti i campioni di saliva e feci di tutti i ca. 150 volontari saranno sottoposti ad analisi PCR-DGGE per avere una panoramica della diversità microbica. RT-PCR-DGGE (Real Time- Polymerase Chain Reaction- Denaturing gradient gel electrophoresis) sarà anche considerato per stimare le popolazioni vitali nelle feci. Sulla base di queste analisi, campioni rappresentativi di ciascuna abitudine alimentare saranno sottoposti a sequenziamento di nuova generazione. L'output di tutti questi risultati dovrebbe consentire, passo dopo passo, la selezione di 4/5 campioni fecali per ciascuna delle tre diete da sottoporre ad analisi meta-omiche.
• ATTIVITÀ III.1. Studio della biodiversità.
• AIII.1.1. PCR-DGGE Profiling (UR 2, 3, 8) Le analisi PCR-DGGE per lieviti e funghi filamentosi prenderanno di mira le regioni 26S rRNA e ITS, mentre le regioni V3 e/o V6-V8 del 16S rRNA saranno studiate per i batteri. Sia il DNA che l'RNA (dopo RT-PCR) saranno usati come target per studiare rispettivamente le popolazioni totali e vitali. Nelle stesse condizioni sperimentali, l'UR3 caratterizzerà la diversità batterica dei campioni di saliva. Dopo DGGE, analisi di immagini e cluster da campioni di DNA e RNA sarà possibile definire una differenza tra la popolazione globale e quella vitale. I dendrogrammi di similarità verranno utilizzati per escludere dall'ulteriore attività di sequenziamento quei campioni aventi un coefficiente di similarità ≥ 85%; tale selezione consentirà di risparmiare sui costi delle analisi di sequenziamento di nuova generazione e garantirà di ottenere una quantità gestibile di dati da analizzare tramite bioinformatica.
• AIII.1.2. Sequenziamento di nuova generazione (UR 3, 8) Il sequenziamento profondo di campioni salivari e fecali selezionati sarà effettuato utilizzando librerie di ampliconi di geni variabili di interesse tassonomico. Tutti i risultati di sequenziamento ottenuti sia per batteri che per funghi saranno elaborati su base bioinformatica dall'UR2.
• AIII.1.3. Resistenza agli antibiotici (UR 7) Il DNA estratto direttamente da campioni di saliva e feci sarà sottoposto a screening per la presenza di geni che codificano per la resistenza a diversi antibiotici utilizzando saggi di PCR. I campioni risultati positivi per i geni di resistenza agli antibiotici (AR) saranno utilizzati per isolare lattobacilli, lattococchi ed enterococchi resistenti agli antibiotici. Dopo l'identificazione, gli isolati che mostrano valori di concentrazione minima inibente (MIC) superiori ai corrispondenti breakpoint saranno confermati mediante amplificazione PCR dei corrispondenti geni AR. La possibilità di trasferire geni AR localizzati su elementi genetici mobili da isolati a batteri di interesse clinico sarà valutata mediante prove di coniugazione.
• AIII.2. Analisi meta-omiche di campioni fecali selezionati Secondo l'approccio a cascata, i risultati dello studio della diversità microbica dei campioni fecali selezioneranno 4/5 individui rappresentativi di ciascuno dei 3 tipi di dieta (4/5 x 3 = 12/ 15) da sottoporre ad analisi meta-omiche. Gli approcci meta-omici forniranno un database interno, costituito dalle sequenze di DNA e RNA dei microbiomi fecali dei 12/15 individui, che consentirà una visione completa delle proteine ​​sintetizzate.
• AIII.2.1. Meta-genomica (UR3, 8) Il DNA fecale sarà quantificato e verrà applicato un protocollo di sequenziamento shotgun per l'analisi meta-genomica. Questo compito dovrebbe essere svolto dall'UR3, a seconda delle prestazioni e della disponibilità della piattaforma di sequenziamento, che sarà impegnata a tempo pieno nell'analisi di ampliconi di DNA e cDNA di feci e saliva. In alternativa, società specializzate svolgeranno questo compito come servizio.
• AIII.2.2. Meta-trascrittomica (UR 6) Il profilo generale di espressione genica microbica sarà caratterizzato utilizzando un innovativo approccio metatrascrittomico basato su Illumina e il protocollo messo a punto durante i primi mesi del progetto. Il cDNA sarà sintetizzato dall'RNA secondo procedure ottimizzate. Verrà eseguita l'amplificazione casuale del cDNA e il cDNA sarà sequenziato utilizzando la piattaforma Illumina HiSeq. I meta-trascrittomi sequenziati saranno assemblati insieme utilizzando i pacchetti Velvet/MetaVelvet o SOAPdenovo per ottenere la sequenza di consenso più ampia possibile. Le sequenze dei trascritti saranno annotate utilizzando pipeline consolidate e i trascritti saranno ricercati utilizzando RPS-BLAST (Reversed Position Specific-Basic Local Alignment Search Tool) rispetto a KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), COG (Clusters of Orthologous Groups) e i database Genbank. Le letture simili a batteri identificate da nr BLASTX saranno ulteriormente ricercate nel database COG. I ruoli funzionali delle sequenze saranno assegnati in base alle ricerche KEGG e COG.
• AIII.2.3. Meta-proteomica (UR1) Sulla base del flusso di lavoro progettato entro i primi mesi di attività, le proteine ​​saranno estratte da ciascun campione fecale e analizzate mediante proteomica gel-free e/o gel-based. L'identificazione dei peptidi sarà effettuata utilizzando lo spettrometro di massa Finnigan LCQ Deca XP MAX. Verrà effettuata l'analisi di proteomica differenziale. Per l'identificazione dei peptidi, verrà utilizzato l'Open Mass Spectra Search Algorithm per ricercare gli spettri MS/MS nei database disponibili. Per recuperare ulteriori informazioni funzionali, le proteine ​​basate sulla classificazione COG saranno annotate. I COG identificati saranno mappati sul database delle vie metaboliche KEGG e visualizzati dall'applicazione online di iPath. Dopo la correzione FDR, tutti i peptidi identificati saranno ricercati su UniProtKB e quindi mappati. Per affrontare il più alto livello funzionale di tutte le proteine ​​identificate, i COG identificati sui percorsi KEGG saranno mappati. Oltre al nucleo microbico comune, saranno determinate le differenze inter-individuali e inter-dieta in termini di funzione metabolica.
• ATTIVITÀ IV. Caratterizzazione funzionale. La caratterizzazione di alcune caratteristiche funzionali di campioni fecali e di isolati microbici da campioni fecali rafforzerà il legame tra dieta e microbiota intestinale.
• AIV.1 Attività genotossica e antigenotossica fecale (UR 5) Saranno preparati campioni di acqua fecale (FW) e la genotossicità sarà determinata mediante Comet assay. Gli enterociti HT29 (10^6 cellule/dosaggio) co-esposti a FW e incorporati nel vetrino LMA saranno sottoposti a Single-Cell Gel-Electrophoresis (SCGE) e analizzati mediante epifluorescenza. Diversi isolati microbici da alimenti saranno studiati per l'attività inibitoria nei confronti di composti genotossici e mutageni, potenzialmente presenti nell'intestino. L'effetto della co-incubazione microrganismo-genotossina sarà saggiato attraverso la valutazione dell'attività genotossica residua dei composti utilizzando il SOS-Chromotest (target Escherichia coli PQ37 sfiA:lacZ) e, in parallelo, il Comet assay (target enterocytes HT29 ).
• AIV.2. Microrganismi fecali e modulazione della risposta immunitaria (UR 9) Entro i primi mesi di attività verranno predisposte le condizioni per la crescita e il differenziamento delle cellule dendritiche (DC) e delle cellule Caco-2. Lattobacilli e bifidobatteri saranno isolati da tutti i campioni fecali e usati come batteri irradiati per rilevare l'espressione di mediatori immunitari negli enterociti. Saranno determinati i livelli di secrezione del trascritto e della proteina affine di IL-8 e TGF-beta tolerogenico (Transforming growth factor beta) e TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin). I batteri irradiati saranno utilizzati anche per stimolare marcatori di superficie nelle cellule DC. L'RNA totale sarà estratto dalle cellule Caco-2 e DC, e il cDNA sarà preparato per esaminare l'espressione genica relativa di IL-8, TGF-beta, TSLP, TNF-alfa, IL-12p40 e IL-10; la concentrazione dei corrispondenti prodotti genici sarà determinata mediante ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• ATTIVITÀ V. Metabolima salivare, fecale e urinario (UR10). Per completare l'approccio "omics", il metaboloma di campioni di feci, urine e saliva sarà analizzato con tre tecniche (GC-MS/SPME, FTIR/ATR (Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance) e NMR (Nuclear Magnetic Resonance) secondo i protocolli precedentemente predisposti. I composti chimici saranno identificati utilizzando database di spettri di massa così come dati di spettri di massa in letteratura e/o dati da composti chimici puri. Dopo lo scongelamento dei campioni di urina e saliva, l'analisi NMR verrà eseguita entro 2 ore. Verranno preparati campioni fecali dando la massima importanza al completo recupero delle molecole idrosolubili. Gli spettri NMR saranno preparati per l'analisi statistica correggendo i piccoli disallineamenti dei picchi attraverso l'algoritmo iCoshift.
• ATTIVITÀ VI. Elaborazione statistica dei risultati (tutte le UR). Durante lo sviluppo del progetto, l'UR2 si occuperà della manutenzione del sito web in collaborazione con il partner CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, NL), il sito raccoglierà tutti i risultati delle diverse attività di ricerca. Questo database verrà utilizzato per l'analisi in "modalità R" per valutare l'impatto dei vari descrittori nel determinare la diversità delle tre diete e in "modalità Q" per determinare la differenza tra le tre diete. Allo stesso tempo, i risultati più rilevanti saranno divulgati attraverso pubblicazioni scientifiche su riviste peer-reviewed.

Tenendo conto dell'argomento da studiare, questo progetto ha indubbiamente applicato potenziali aspetti. Ad esempio, la conoscenza dell'effetto della dieta sul microbiota umano potrebbe portare alla preparazione di apposite linee guida da distribuire in campagne di promozione della cura integrata. Saranno presi in considerazione le preferenze, gli atteggiamenti, i bisogni, il comportamento, lo stile di vita e l'istruzione dei consumatori e la comunicazione tra i consumatori e la comunità di ricerca sulla filiera alimentare sarà rafforzata al fine di migliorare la scelta informata e il suo impatto sulla qualità della vita. Consentire alle persone di migliorare e gestire la propria salute attraverso corrette abitudini alimentari si tradurrà in risparmi sui costi per i sistemi sanitari.