毛細血管拡張性運動失調症のモデリングと治療のための細胞ベースのアプローチ

毛細血管拡張性運動失調症 (A-T) は、ATM をコードする遺伝子座の変異 (Ataxia-Telangiectasia Mutated) によって引き起こされる、神経変性、免疫不全、およびがん素因の壊滅的な遺伝的症候群です。 A-T の現在の標準治療は積極的な支持療法で構成されており、予後は依然として不良です。 したがって、この病気の新しい実験的アプローチと治療法を開発することが急務です。 このアプリケーションでは、初めてヒト幹細胞ベースの技術を開発することにより、このニーズに対処することを提案します。 ); 2) A-T の再生療法の実現可能性をテストするために、突然変異の修正によって無病性になった自家幹細胞の生成を開始します (目的 2)。 A-T の原因となる変異は個人的なものであり、その結果、ATM 活性がさまざまに低下し、それに応じて幅広い臨床症状が現れます。 疾患の最も重篤な形態 (ATM が検出されない「古典的」A-T) はマウスでモデル化されていますが (ATM の「ノックアウト」)、このアプローチでは疾患の神経学的症状とその特徴的な腫瘍スペクトルを再現できません。 さらに、現在、ATM 活性の低下をもたらす突然変異 (「バリアント」A-T) の患者の実験モデルが不足しています。 これらの問題に対処するために、目的 1 の実験では、患者由来の人工多能性幹細胞 (iPSC) で A-T の遺伝子型と表現型の相関関係が維持されているという仮説を検証します。 この仮説を検証するために、A-T 患者の線維芽細胞を再プログラムし、ATM レベルをさまざまに低下させ、次のいずれかを判断します。 2) iPSC は、細胞周期チェックポイント活性化の障害、DNA 二重鎖切断 (DSB) 修復の欠陥、放射線感受性およびゲノム不安定性など、線維芽細胞で観察される表現型を再現します。 3) iPSC のこれらの表現型は、ATM の発現/活性のレベルと直接相関します。 遺伝子型と表現型の相関が A-T iPSC で維持されていることが判明した場合、この研究は、疾患バイオマーカーの評価、薬物検査、または遺伝子スクリーニングを含む、A-T の前臨床研究のための自家 iPSC のより一般的な使用を検証することになります。 A-T の臨床症状は、進行性の細胞喪失と組織変性に起因するため、A-T は再生療法の候補疾患となっています。 目的 2 の実験では、A-T 体細胞の ATM 変異を修正することで、深刻な初期化欠陥が救済され、無病 iPSC の生成が可能になるという仮説が検証されます。 この仮説を検証するために、十分に特徴付けられた複合ヘテロ接合性 A-T 線維芽細胞株を使用した一連の原理実証実験を提案します。 最初に、この系統の 1 つまたは 2 つの ATM 変異を、無傷の配列を保持する外因性ドナー プラスミドとの組換えによって「修復」し、「保因者」(1 つの正常な対立遺伝子と 1 つの変異した対立遺伝子) または「無傷の」細胞 ( 2 つの正常な対立遺伝子)。 組換えの効率を高めるために、変異領域に特異的に結合する Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS) を使用して、変異のすぐ近くに DSB を導入します。 予備実験では、ATM 遺伝子座自体だけでなく、ヒトの「セーフ ハーバー」遺伝子座でも DSB と部位特異的組換えをうまく誘導できることがわかりました。 組換えによって ATM の発現と機能が回復することを確認した後、修正された細胞を iPSC に再プログラムし、ATM の発現、活性、機能のレベルを継代とともに特徴付けます。 「ヌル」、「キャリア」、および「インタクト」ラインは同質遺伝子であるため、リプログラミングおよび iPSC 機能に対する ATM 遺伝子量の影響をこれらの実験で評価できます。 この点で、米国の一般人口の約 1% が A-T の「キャリア」であり、この研究の重要性は A-T 患者をはるかに超えています。 全体として、この探索的プロジェクトの完了は、自家 iPSC および/またはその派生製品による A-T のモデリングと治療、および一般集団に対する再生療法の使用の最適化を目的とした長期研究の理論的根拠、専門知識、および試薬を提供します。