Approches cellulaires pour la modélisation et le traitement de l'ataxie-télangiectasie

L'ataxie-télangiectasie (A-T) est un syndrome génétique dévastateur de neurodégénérescence, d'immunodéficience et de prédisposition au cancer causé par des mutations dans le locus codant ATM (ataxie-télangiectasie mutée). La norme actuelle de soins pour A-T consiste en des mesures de soutien agressives et le pronostic reste médiocre. Il y a donc un besoin pressant de développer de nouvelles approches expérimentales et des traitements pour cette maladie. Dans cette application, nous proposons de répondre à ce besoin en développant pour la première fois des technologies basées sur les cellules souches humaines pour : 1) générer de nouveaux modèles expérimentaux pour A-T qui récapitulent fidèlement les caractéristiques de la maladie à travers son spectre complexe de manifestations cliniques (Objectif 1 ); et 2) commencer à tester la faisabilité des thérapies régénératives pour A-T, via la génération de cellules souches autologues qui ont été rendues indemnes par la correction de la mutation (Objectif 2). Les mutations provoquant A-T sont privées, entraînant une réduction variable de l'activité ATM et, par conséquent, un large éventail de manifestations cliniques. Bien que la forme la plus sévère de la maladie (A-T "classique", sans ATM détectable) ait été modélisée chez la souris (ATM "knock out"), cette approche ne parvient pas à récapituler les symptômes neurologiques de la maladie et son spectre tumoral caractéristique. De plus, nous manquons actuellement de modèles expérimentaux pour les patients dont les mutations entraînent une réduction de l'activité ATM ("variante" A-T). Pour résoudre ces problèmes, les expériences du but 1 testeront l'hypothèse selon laquelle la corrélation génotype-phénotype dans A-T est maintenue dans les cellules souches pluripotentes induites dérivées de patients (iPSC). Pour tester cette hypothèse, nous allons reprogrammer des fibroblastes de patients A-T présentant une réduction variable des niveaux d'ATM et déterminer si : 1) l'expression et l'activité de l'ATM dans les CSPi sont directement corrélées à celles observées dans les fibroblastes de patients dont ils sont dérivés ; 2) les iPSC récapitulent les phénotypes observés dans les fibroblastes, y compris l'activation altérée du point de contrôle du cycle cellulaire, la réparation défectueuse de la rupture double brin (DSB) de l'ADN, la radiosensibilité et l'instabilité génomique ; et 3) ces phénotypes dans les CSPi sont directement corrélés à leur niveau d'expression/activité ATM. Si nous constatons que la corrélation génotype-phénotype est maintenue dans les iPSC A-T, ce travail validerait une utilisation plus générale des iPSC autologues pour les études précliniques de l'A-T, y compris l'évaluation des biomarqueurs de la maladie, les tests de dépistage de médicaments ou le dépistage génétique. Les manifestations cliniques de l'A-T résultent d'une perte cellulaire progressive et d'une dégénérescence tissulaire, faisant de l'A-T une maladie candidate pour les thérapies régénératives. Les expériences de l'objectif 2 testeront l'hypothèse selon laquelle la correction de la mutation ATM dans les cellules somatiques A-T sauvera leur grave défaut de reprogrammation et permettra la génération d'iPSC sans maladie. Pour tester cette hypothèse, nous proposons une série d'expériences de preuve de principe utilisant une lignée de cellules de fibroblastes A-T hétérozygotes composées bien caractérisées. Dans un premier temps, nous allons "réparer" soit une soit les deux mutations ATM de cette lignée par recombinaison avec un plasmide donneur exogène portant la séquence intacte, pour générer soit des "porteurs" (un allèle normal et un allèle muté) soit des cellules "intactes" ( deux allèles normaux). Pour augmenter l'efficacité de la recombinaison, nous introduirons un DSB à proximité immédiate de la mutation en utilisant des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENS) qui se lient spécifiquement à la région mutée. Dans les expériences préliminaires, nous constatons que nous pouvons induire avec succès des DSB et une recombinaison spécifique au site au niveau d'un locus "safe harbour" humain ainsi qu'au locus ATM lui-même. Après avoir vérifié que la recombinaison restaure l'expression et la fonction ATM, nous allons reprogrammer les cellules corrigées en iPSC et caractériser leur niveau d'expression, d'activité et de fonction ATM avec passage. Étant donné que les lignées "nulles", "porteuses" et "intactes" sont isogéniques, l'effet de la dose de gène ATM sur la reprogrammation et la fonction iPSC peut être évalué dans ces expériences. À cet égard, environ 1 % de la population générale des États-Unis est un « porteur » A-T, ce qui étend l'importance de ce travail bien au-delà des patients A-T. Dans l'ensemble, l'achèvement de ce projet exploratoire fournira la justification, l'expertise et les réactifs pour des études à plus long terme visant à modéliser et à traiter l'A-T avec des CSPi autologues et/ou leurs produits dérivés et à optimiser l'utilisation des thérapies régénératives pour la population générale.