Cellebaserede tilgange til modellering og behandling af ataksi-telangiektasi

Ataxia-Telangiectasia (A-T) er et ødelæggende genetisk syndrom af neurodegeneration, immundefekt og kræftprædisposition forårsaget af mutationer i locus-kodende ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Den nuværende standard for pleje for A-T består af aggressive støtteforanstaltninger, og prognosen er fortsat dårlig. Der er derfor et presserende behov for at udvikle nye eksperimentelle tilgange og behandlinger for denne sygdom. I denne ansøgning foreslår vi at imødekomme dette behov ved for første gang at udvikle humane stamcelle-baserede teknologier til: 1) at generere nye eksperimentelle modeller for A-T, der trofast rekapitulerer sygdommens træk på tværs af dens komplekse spektrum af kliniske manifestationer (Mål 1 ); og 2) begynde at teste gennemførligheden af ​​regenerative terapier for A-T via generering af autologe stamceller, der er blevet gjort sygdomsfri ved korrektion af mutationen (mål 2). Mutationer, der forårsager A-T, er private, hvilket resulterer i variabel reduktion i ATM-aktivitet og tilsvarende et bredt spektrum af kliniske manifestationer. Selvom den mest alvorlige form af sygdommen ("klassisk" A-T, uden påviselig ATM) er blevet modelleret i musen (ATM "knock out"), formår denne tilgang ikke at rekapitulere de neurologiske symptomer på sygdommen og dens karakteristiske tumorspektrum. Desuden mangler vi i øjeblikket eksperimentelle modeller for de patienter, hvis mutationer resulterer i reduceret ATM-aktivitet ("variant" A-T). For at løse disse problemer vil eksperimenter i mål 1 teste hypotesen om, at genotype-fænotype-korrelationen i A-T opretholdes i patient-afledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). For at teste denne hypotese vil vi omprogrammere fibroblaster fra A-T-patienter med variabel reduktion af ATM-niveauer og bestemme om: 1) ATM-ekspression og aktivitet i iPSC'erne korrelerer direkte med dem, der observeres i patientfibroblasterne, de er afledt af; 2) iPSC'erne rekapitulerer fænotyperne observeret i fibroblasterne, herunder svækket cellecykluskontrolpunktaktivering, defekt DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB) reparation, radiosensitivitet og genomisk ustabilitet; og 3) disse fænotyper i iPSC'erne korrelerer direkte med deres niveau af ATM-ekspression/aktivitet. Hvis vi finder ud af, at genotype-fænotype-korrelationen opretholdes i A-T iPSC'er, ville dette arbejde validere en mere generel brug af autologe iPSC'er til prækliniske undersøgelser af A-T, herunder evaluering af sygdomsbiomarkører, lægemiddeltestning eller genetisk screening. De kliniske manifestationer af A-T skyldes progressivt celletab og vævsdegeneration, hvilket gør A-T til en kandidatsygdom til regenerative terapier. Eksperimenter i mål 2 vil teste hypotesen om, at korrektion af ATM-mutationen i A-T somatiske celler vil redde deres alvorlige omprogrammeringsdefekt og tillade generering af sygdomsfri iPSC'er. For at teste denne hypotese foreslår vi en række proof-of-principle eksperimenter ved hjælp af en velkarakteriseret sammensat heterozygot A-T fibroblastcellelinje. Først vil vi "reparere" enten en eller de to ATM-mutationer i denne linje ved rekombination med et eksogent donorplasmid, der bærer den intakte sekvens, for at generere enten "bærere" (en normal allel og en muteret allel) eller "intakte" celler ( to normale alleler). For at øge effektiviteten af ​​rekombination vil vi introducere en DSB i umiddelbar nærhed af mutationen ved hjælp af Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS), der binder specifikt til den muterede region. I foreløbige eksperimenter finder vi ud af, at vi med succes kan inducere DSB'er og stedspecifik rekombination på et menneskeligt "safe harbor"-locus såvel som på selve ATM-locuset. Efter at have verificeret, at rekombination genopretter ATM-ekspression og funktion, omprogrammerer vi de korrigerede celler til iPSC'er og karakteriserer deres niveau af ATM-ekspression, aktivitet og funktion med passage. Fordi "nul", "bærer" og "intakt" linjer er isogene, kan effekten af ​​ATM-gendosis på omprogrammering og iPSC-funktion evalueres i disse eksperimenter. I denne henseende er ca. 1% af den generelle befolkning i USA en A-T-"bærer", hvilket udvider betydningen af ​​dette arbejde langt ud over A-T-patienter. Samlet set vil afslutningen af ​​dette udforskningsprojekt give rationalet, ekspertisen og reagenserne til længerevarende undersøgelser rettet mod modellering og behandling af A-T med autologe iPSC'er og/eller deres afledte produkter og optimere brugen af ​​regenerative terapier for den generelle befolkning.