모세혈관확장성 운동실조증 모델링 및 치료를 위한 세포 기반 접근법

모세혈관확장실조증(A-T)은 ATM(모세혈관확장실조증 돌연변이)을 암호화하는 유전자좌의 돌연변이로 인해 발생하는 신경변성, 면역결핍 및 암 소인의 파괴적인 유전 증후군입니다. A-T에 대한 현재 치료 표준은 공격적인 지원 조치로 구성되어 있으며 예후는 여전히 좋지 않습니다. 따라서 이 질병에 대한 새로운 실험적 접근법과 치료법을 개발할 긴급한 필요성이 있습니다. 이 응용 프로그램에서 우리는 인간 줄기 세포 기반 기술을 처음으로 개발하여 이러한 요구를 해결하기 위해 제안합니다. ); 2) 돌연변이를 수정하여 질병이 없는 자가 줄기 세포를 생성하여 A-T에 대한 재생 요법의 타당성을 테스트하기 시작합니다(목표 2). A-T를 유발하는 돌연변이는 사적이어서 ATM 활동의 다양한 감소와 이에 따라 광범위한 임상 징후를 초래합니다. 질병의 가장 심각한 형태("고전적인" A-T, 감지할 수 있는 ATM이 없음)가 마우스에서 모델링되었지만(ATM "녹아웃"), 이 접근 방식은 질병의 신경학적 증상과 특징적인 종양 스펙트럼을 요약하지 못합니다. 더욱이, 우리는 현재 돌연변이로 인해 ATM 활동이 감소된 환자("변형" A-T)에 대한 실험 모델이 부족합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 목표 1의 실험은 A-T의 유전자형-표현형 상관 관계가 환자 유래 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유지된다는 가설을 테스트합니다. 이 가설을 테스트하기 위해 우리는 ATM 수준의 다양한 감소로 A-T 환자의 섬유아세포를 재프로그래밍하고 다음 여부를 결정할 것입니다. 2) iPSC는 세포 주기 검사점 활성화 장애, DNA DSB(double-strand break) 복구 결함, 방사선 민감성 및 게놈 불안정성을 포함하여 섬유아세포에서 관찰되는 표현형을 요약합니다. 3) iPSC의 이러한 표현형은 ATM 발현/활성 수준과 직접적인 상관관계가 있습니다. 유전자형-표현형 상관관계가 A-T iPSC에서 유지되는 것을 발견하면, 이 작업은 질병 바이오마커 평가, 약물 테스트 또는 유전자 스크리닝을 포함하여 A-T의 전임상 연구를 위한 자가 iPSC의 보다 일반적인 사용을 검증할 것입니다. A-T의 임상 증상은 진행성 세포 손실 및 조직 변성으로 인해 A-T를 재생 요법의 후보 질병으로 만듭니다. 목표 2의 실험은 A-T 체세포의 ATM 돌연변이를 수정하면 심각한 리프로그래밍 결함을 복구하고 질병이 없는 iPSC를 생성할 수 있다는 가설을 테스트할 것입니다. 이 가설을 테스트하기 위해 잘 특성화 된 복합 이형 접합 A-T 섬유 아세포 세포주를 사용하여 일련의 원리 증명 실험을 제안합니다. 먼저, 온전한 서열을 지닌 외인성 기증자 플라스미드와 재조합하여 이 라인에서 하나 또는 두 개의 ATM 돌연변이를 "수리"하여 "캐리어"(하나의 정상 대립유전자와 하나의 돌연변이 대립유전자) 또는 "온전한" 세포를 생성합니다( 2개의 정상 대립유전자). 재조합 효율을 높이기 위해 돌연변이 영역에 특이적으로 결합하는 Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALENS)를 사용하여 돌연변이에 근접한 DSB를 도입합니다. 예비 실험에서 우리는 DSB와 ATM 위치 자체뿐만 아니라 인간의 "안전한 항구" 위치에서 사이트별 재조합을 성공적으로 유도할 수 있음을 발견했습니다. 재조합이 ATM 발현 및 기능을 회복시키는 것을 확인한 후, 우리는 수정된 세포를 iPSC로 재프로그래밍하고 계대에 따라 ATM 발현, 활성 및 기능의 수준을 특성화할 것입니다. "널(null)", "캐리어(carrier)" 및 "손상되지 않은(intact)" 라인은 동질성이므로 재프로그래밍 및 iPSC 기능에 대한 ATM 유전자 용량의 효과를 이 실험에서 평가할 수 있습니다. 이와 관련하여 미국 일반 인구의 약 1%가 A-T "캐리어"이며, 이 작업의 중요성은 A-T 환자를 훨씬 넘어서 확장됩니다. 전반적으로 이 탐색 프로젝트의 완료는 자가 iPSC 및/또는 파생 제품으로 A-T를 모델링 및 치료하고 일반 인구를 위한 재생 요법 사용을 최적화하는 것을 목표로 하는 장기 연구를 위한 근거, 전문 지식 및 시약을 제공할 것입니다.