Op cellen gebaseerde benaderingen voor het modelleren en behandelen van ataxie-teleangiëctasie

Ataxia-Telangiectasia (A-T) is een verwoestend genetisch syndroom van neurodegeneratie, immunodeficiëntie en aanleg voor kanker, veroorzaakt door mutaties in de locus die codeert voor ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). De huidige zorgstandaard voor A-T bestaat uit agressieve ondersteunende maatregelen en de prognose blijft slecht. Er is daarom een ​​dringende behoefte om nieuwe experimentele benaderingen en behandelingen voor deze ziekte te ontwikkelen. In deze toepassing stellen we voor om aan deze behoefte te voldoen door voor het eerst op menselijke stamcellen gebaseerde technologieën te ontwikkelen om: 1) nieuwe experimentele modellen voor A-T te genereren die de kenmerken van de ziekte getrouw recapituleren over het complexe spectrum van klinische manifestaties (Doelstelling 1 ); en 2) beginnen met het testen van de haalbaarheid van regeneratieve therapieën voor A-T, via het genereren van autologe stamcellen die ziektevrij zijn gemaakt door correctie van de mutatie (doel 2). Mutaties die A-T veroorzaken zijn privé, resulterend in variabele vermindering van ATM-activiteit en dienovereenkomstig een breed spectrum van klinische manifestaties. Hoewel de meest ernstige vorm van de ziekte ("klassieke" A-T, zonder detecteerbare ATM) is gemodelleerd in de muis (ATM "knock-out"), slaagt deze benadering er niet in om de neurologische symptomen van de ziekte en het kenmerkende tumorspectrum samen te vatten. Bovendien missen we momenteel experimentele modellen voor die patiënten bij wie de mutaties resulteren in verminderde ATM-activiteit ("variant" A-T). Om deze problemen aan te pakken, zullen experimenten in Aim 1 de hypothese testen dat de genotype-fenotype-correlatie in A-T behouden blijft in van de patiënt afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Om deze hypothese te testen, zullen we fibroblasten van AT-patiënten herprogrammeren met variabele verlaging van ATM-niveaus en bepalen of: 1) ATM-expressie en -activiteit in de iPSC's direct correleren met die waargenomen in de fibroblasten van de patiënt waarvan ze zijn afgeleid; 2) de iPSC's recapituleren de fenotypes waargenomen in de fibroblasten, waaronder verminderde celcyclus-controlepuntactivering, defecte DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB) -reparatie, radiosensitiviteit en genomische instabiliteit; en 3) deze fenotypes in de iPSC's correleren direct met hun niveau van ATM-expressie/activiteit. Als we vinden dat de genotype-fenotype-correlatie behouden blijft in AT iPSC's, zou dit werk een meer algemeen gebruik van autologe iPSC's valideren voor preklinische studies van AT, inclusief de evaluatie van ziektebiomarkers, medicijntesten of genetische screening. De klinische manifestaties van AT zijn het gevolg van progressief celverlies en weefseldegeneratie, waardoor AT een kandidaat-ziekte is voor regeneratieve therapieën. Experimenten in Aim 2 zullen de hypothese testen dat correctie van de ATM-mutatie in A-T somatische cellen hun ernstige herprogrammeringsdefect zal redden en het genereren van ziektevrije iPSC's mogelijk zal maken. Om deze hypothese te testen, stellen we een reeks proof-of-principle-experimenten voor met behulp van een goed gekarakteriseerde samengestelde heterozygote AT-fibroblastcellijn. Eerst zullen we één of de twee ATM-mutaties in deze lijn "repareren" door recombinatie met een exogeen donorplasmide dat de intacte sequentie draagt, om ofwel "dragers" (één normaal allel en één gemuteerd allel) of "intacte" cellen ( twee normale allelen). Om de efficiëntie van recombinatie te vergroten, zullen we een DSB introduceren in de nabijheid van de mutatie met behulp van Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS) die specifiek binden aan het gemuteerde gebied. In Voorlopige Experimenten vinden we dat we met succes DSB's en plaatsspecifieke recombinatie kunnen induceren op een menselijke "veilige haven" -locus, evenals op de ATM-locus zelf. Nadat we hebben geverifieerd dat recombinatie ATM-expressie en -functie herstelt, zullen we de gecorrigeerde cellen herprogrammeren in iPSC's en hun niveau van ATM-expressie, activiteit en functie karakteriseren met passage. Omdat de lijnen "null", "carrier" en "intact" isogeen zijn, kan het effect van de ATM-gendosis op herprogrammering en iPSC-functie in deze experimenten worden geëvalueerd. In dit opzicht is ongeveer 1% van de algemene bevolking van de VS een A-T-"drager", waardoor de betekenis van dit werk veel verder gaat dan A-T-patiënten. Over het algemeen zal de voltooiing van dit verkennende project de grondgedachte, expertise en reagentia bieden voor langetermijnstudies gericht op het modelleren en behandelen van AT met autologe iPSC's en/of hun afgeleide producten en het optimaliseren van het gebruik van regeneratieve therapieën voor de algemene bevolking.