基于细胞的方法建模和治疗共济失调-毛细血管扩张症

共济失调-毛细血管扩张症 (A-T) 是由编码 ATM 的基因座突变（共济失调-毛细血管扩张症突变）引起的神经变性、免疫缺陷和癌症易感性的破坏性遗传综合征。 目前 A-T 的护理标准包括积极的支持措施，预后仍然很差。 因此，迫切需要为这种疾病开发新的实验方法和治疗方法。 在此应用中，我们建议通过首次开发基于人类干细胞的技术来满足这一需求：1) 为 A-T 生成新的实验模型，忠实地概括疾病在其复杂的临床表现范围内的特征（目标 1 ); 2) 开始测试 A-T 再生疗法的可行性，方法是生成自体干细胞，这些干细胞通过纠正突变而变得无病（目标 2）。 导致 A-T 的突变是私有的，导致 ATM 活动的可变减少，相应地，广泛的临床表现。 虽然最严重的疾病形式（“经典”A-T，没有可检测的 ATM）已在小鼠（ATM“敲除”）中建模，但这种方法无法概括该疾病的神经系统症状及其特征性肿瘤谱。 此外，我们目前缺乏针对那些突变导致 ATM 活性降低（“变体”A-T）的患者的实验模型。 为了解决这些问题，目标 1 中的实验将检验 A-T 基因型-表型相关性在患者来源的诱导多能干细胞 (iPSC) 中得以维持的假设。 为了检验这一假设，我们将对 A-T 患者的成纤维细胞进行重新编程，ATM 水平有不同程度的降低，并确定：1）iPSC 中的 ATM 表达和活性是否与它们所来源的患者成纤维细胞中观察到的直接相关； 2) iPSCs 概括了在成纤维细胞中观察到的表型，包括细胞周期检查点激活受损、DNA 双链断裂 (DSB) 修复缺陷、放射敏感性和基因组不稳定性；和 3) iPSC 中的这些表型与其 ATM 表达/活动水平直接相关。 如果我们发现基因型-表型相关性在 A-T iPSC 中得以维持，则这项工作将验证自体 iPSC 在 A-T 临床前研究中更普遍的用途，包括疾病生物标志物的评估、药物测试或基因筛查。 A-T 的临床表现是由进行性细胞丢失和组织退化引起的，使 A-T 成为再生疗法的候选疾病。 目标 2 中的实验将检验这样一个假设，即纠正 A-T 体细胞中的 ATM 突变将挽救其严重的重编程缺陷并允许产生无病 iPSC。 为了检验这一假设，我们提出了一系列使用充分表征的复合杂合 A-T 成纤维细胞系的原理验证实验。 首先，我们将通过与携带完整序列的外源供体质粒重组来“修复”该细胞系中的一个或两个 ATM 突变，以生成“携带者”（一个正常等位基因和一个突变等位基因）或“完整”细胞（两个正常等位基因）。 为了提高重组效率，我们将使用特异性结合突变区域的转录激活因子样效应核酸酶 (TALENS) 在突变附近引入 DSB。 在初步实验中，我们发现我们可以在人类“安全港”位点以及 ATM 位点本身成功诱导 DSB 和位点特异性重组。 在验证重组恢复 ATM 表达和功能后，我们将纠正后的细胞重新编程为 iPSC，并随传代表征其 ATM 表达水平、活性和功能。 由于“无效”、“载体”和“完整”系是等基因的，因此可以在这些实验中评估 ATM 基因剂量对重编程和 iPSC 功能的影响。 在这方面，大约 1% 的美国总人口是 A-T“携带者”，将这项工作的意义扩展到 A-T 患者之外。 总的来说，这个探索性项目的完成将为长期研究提供基本原理、专业知识和试剂，旨在用自体 iPSC 和/或其衍生产品建模和治疗 A-T，并优化一般人群再生疗法的使用。