Přístupy založené na buňkách pro modelování a léčbu ataxie-Telangiektázie

Ataxie-Telangiectasia (A-T) je devastující genetický syndrom neurodegenerace, imunodeficience a predispozice k rakovině způsobený mutacemi v lokusu kódujícím ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Současný standard péče o A-T sestává z agresivních podpůrných opatření a prognóza zůstává špatná. Existuje proto naléhavá potřeba vyvinout nové experimentální přístupy a léčby tohoto onemocnění. V této aplikaci navrhujeme řešit tuto potřebu tím, že poprvé vyvineme technologie založené na lidských kmenových buňkách s cílem: 1) generovat nové experimentální modely pro AT, které věrně rekapitulují rysy onemocnění napříč jeho komplexním spektrem klinických projevů (Cíl 1 ); a 2) začít testovat proveditelnost regeneračních terapií pro A-T prostřednictvím generování autologních kmenových buněk, které byly opraveny bez onemocnění korekcí mutace (cíl 2). Mutace způsobující A-T jsou soukromé, což má za následek různé snížení aktivity ATM a odpovídajícím způsobem široké spektrum klinických projevů. Přestože nejtěžší forma onemocnění ("klasická" A-T, bez detekovatelného ATM) byla modelována na myši (ATM "knock out"), tento přístup nedokáže rekapitulovat neurologické příznaky onemocnění a jeho charakteristické nádorové spektrum. Navíc nám v současné době chybí experimentální modely pro ty pacienty, jejichž mutace vedou ke snížení aktivity ATM ("varianta" A-T). K vyřešení těchto problémů budou experimenty v cíli 1 testovat hypotézu, že korelace genotyp-fenotyp u A-T je zachována v pluripotentních kmenových buňkách (iPSC) indukovaných pacientem. Abychom tuto hypotézu otestovali, přeprogramujeme fibroblasty od pacientů s AT s proměnlivým snížením hladin ATM a určíme, zda: 1) exprese a aktivita ATM v iPSC přímo koreluje s těmi, které byly pozorovány ve fibroblastech pacientů, ze kterých pocházejí; 2) iPSC rekapitulují fenotypy pozorované ve fibroblastech, včetně narušené aktivace kontrolního bodu buněčného cyklu, opravy defektního dvouřetězcového zlomu DNA (DSB), radiosenzitivity a genomové nestability; a 3) tyto fenotypy v iPSC přímo korelují s jejich úrovní exprese/aktivity ATM. Pokud zjistíme, že korelace genotyp-fenotyp je u A-T iPSC zachována, tato práce by potvrdila obecnější použití autologních iPSC pro preklinické studie A-T, včetně hodnocení biomarkerů onemocnění, testování léků nebo genetického screeningu. Klinické projevy AT jsou výsledkem progresivního úbytku buněk a tkáňové degenerace, díky čemuž je A-T kandidátním onemocněním pro regenerační terapie. Experimenty v cíli 2 otestují hypotézu, že korekce mutace ATM v somatických buňkách AT zachrání jejich závažný defekt přeprogramování a umožní generování iPSC bez onemocnění. Abychom tuto hypotézu otestovali, navrhujeme řadu experimentů s důkazem principu s použitím dobře charakterizované složené heterozygotní buněčné linie A-T fibroblastů. Nejprve „opravíme“ jednu nebo dvě ATM mutace v této linii rekombinací s exogenním donorovým plazmidem nesoucím neporušenou sekvenci, abychom vytvořili buď „přenašeče“ (jedna normální alela a jedna mutovaná alela) nebo „intaktní“ buňky ( dvě normální alely). Pro zvýšení účinnosti rekombinace zavedeme DSB do těsné blízkosti mutace pomocí efektorových nukleáz podobných transkripčnímu aktivátoru (TALENS), které se specificky vážou na mutovanou oblast. V předběžných experimentech jsme zjistili, že můžeme úspěšně vyvolat DSB a místně specifickou rekombinaci v lokusu lidského "bezpečného přístavu" i v samotném lokusu ATM. Po ověření, že rekombinace obnovuje expresi a funkci ATM, přeprogramujeme opravené buňky na iPSC a charakterizujeme jejich úroveň exprese, aktivity a funkce ATM s pasáží. Protože "nulové", "nosné" a "intaktní" linie jsou isogenní, lze v těchto experimentech vyhodnotit účinek dávky genu ATM na přeprogramování a funkci iPSC. V tomto ohledu je přibližně 1 % obecné populace USA „přenašečem AT“, čímž se význam této práce rozšiřuje daleko za pacienty s A-T. Celkově dokončení tohoto průzkumného projektu poskytne zdůvodnění, odborné znalosti a reagencie pro dlouhodobé studie zaměřené na modelování a léčbu AT pomocí autologních iPSC a/nebo z nich odvozených produktů a na optimalizaci využití regeneračních terapií pro běžnou populaci.