Approcci cellulari per la modellazione e il trattamento dell'atassia-teleangectasia

Atassia-Telangectasia (A-T) è una devastante sindrome genetica di neurodegenerazione, immunodeficienza e predisposizione al cancro causata da mutazioni nel locus che codifica ATM (Ataxia-Telangectasia Mutated). L'attuale standard di cura per l'AT consiste in misure di supporto aggressive e la prognosi rimane infausta. Vi è quindi un urgente bisogno di sviluppare nuovi approcci sperimentali e trattamenti per questa malattia. In questa domanda, proponiamo di rispondere a questa esigenza sviluppando per la prima volta tecnologie basate su cellule staminali umane per: 1) generare nuovi modelli sperimentali per A-T che ricapitolino fedelmente le caratteristiche della malattia attraverso il suo complesso spettro di manifestazioni cliniche (Obiettivo 1 ); e 2) iniziare a testare la fattibilità di terapie rigenerative per A-T, attraverso la generazione di cellule staminali autologhe che sono state rese libere da malattia mediante correzione della mutazione (Obiettivo 2). Le mutazioni che causano A-T sono private, determinando una riduzione variabile dell'attività ATM e, di conseguenza, un ampio spettro di manifestazioni cliniche. Sebbene la forma più grave della malattia (AT "classica", senza ATM rilevabile) sia stata modellata nel topo ("knock out" dell'ATM), questo approccio non riesce a ricapitolare i sintomi neurologici della malattia e il suo caratteristico spettro tumorale. Inoltre, al momento mancano modelli sperimentali per quei pazienti le cui mutazioni determinano una ridotta attività ATM ("variante" A-T). Per affrontare questi problemi, gli esperimenti nell'Aim 1 verificheranno l'ipotesi che la correlazione genotipo-fenotipo in A-T sia mantenuta nelle cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal paziente (iPSC). Per testare questa ipotesi, riprogrammeremo i fibroblasti di pazienti A-T con riduzione variabile dei livelli di ATM e determineremo se: 1) l'espressione e l'attività di ATM nelle iPSC correlano direttamente con quelle osservate nei fibroblasti dei pazienti da cui derivano; 2) le iPSC ricapitolano i fenotipi osservati nei fibroblasti, tra cui alterata attivazione del checkpoint del ciclo cellulare, riparazione difettosa della rottura del doppio filamento del DNA (DSB), radiosensibilità e instabilità genomica; e 3) questi fenotipi nelle iPSC sono direttamente correlati al loro livello di espressione/attività ATM. Se scopriamo che la correlazione genotipo-fenotipo è mantenuta nelle iPSC AT, questo lavoro convaliderebbe un uso più generale delle iPSC autologhe per gli studi preclinici sull'AT, inclusa la valutazione dei biomarcatori della malattia, i test antidroga o lo screening genetico. Le manifestazioni cliniche dell'AT derivano dalla progressiva perdita cellulare e dalla degenerazione dei tessuti, rendendo l'AT una malattia candidata per le terapie rigenerative. Gli esperimenti nell'Aim 2 testeranno l'ipotesi che la correzione della mutazione ATM nelle cellule somatiche A-T salverà il loro grave difetto di riprogrammazione e consentirà la generazione di iPSCs libere da malattia. Per verificare questa ipotesi, proponiamo una serie di esperimenti di prova di principio utilizzando una linea cellulare di fibroblasti A-T eterozigoti composti ben caratterizzati. In primo luogo, "ripareremo" una o due mutazioni ATM in questa linea mediante ricombinazione con un plasmide donatore esogeno che porta la sequenza intatta, per generare cellule "portatrici" (un allele normale e un allele mutato) o cellule "intatta" ( due alleli normali). Per aumentare l'efficienza della ricombinazione, introdurremo un DSB in prossimità della mutazione utilizzando transcription activator-like effector nucleases (TALENS) che si legano specificamente alla regione mutata. In esperimenti preliminari, scopriamo che possiamo indurre con successo DSB e ricombinazione sito-specifica in un locus "porto sicuro" umano così come nel locus ATM stesso. Dopo aver verificato che la ricombinazione ripristina l'espressione e la funzione dell'ATM, riprogrammeremo le cellule corrette in iPSC e caratterizzeremo il loro livello di espressione, attività e funzione dell'ATM con il passaggio. Poiché le linee "null", "carrier" e "intact" sono isogeniche, in questi esperimenti è possibile valutare l'effetto della dose del gene ATM sulla riprogrammazione e sulla funzione iPSC. A questo proposito, circa l'1% della popolazione generale degli Stati Uniti è un "portatore" di AT, estendendo il significato di questo lavoro ben oltre i pazienti affetti da AT. Nel complesso, il completamento di questo progetto esplorativo fornirà le motivazioni, le competenze e i reagenti per studi a più lungo termine volti a modellare e trattare l'AT con iPSC autologhe e/o i loro prodotti derivati ​​e ottimizzare l'uso di terapie rigenerative per la popolazione generale.