Komórkowe podejścia do modelowania i leczenia ataksji-teleangiektazji

Ataksja-teleangiektazja (A-T) to wyniszczający genetyczny zespół neurodegeneracji, niedoboru odporności i predyspozycji do raka, spowodowany mutacjami w locus kodującym ATM (zmutowana ataksja-teleangiektazja). Obecny standard opieki nad A-T obejmuje agresywne środki wspomagające, a rokowanie pozostaje złe. Istnieje zatem pilna potrzeba opracowania nowych eksperymentalnych podejść i metod leczenia tej choroby. W tej aplikacji proponujemy odpowiedzieć na tę potrzebę poprzez opracowanie po raz pierwszy technologii opartych na ludzkich komórkach macierzystych w celu: 1) wygenerowania nowych modeli eksperymentalnych dla A-T, które wiernie podsumowują cechy choroby w całym jej złożonym spektrum objawów klinicznych (Cel 1 ); oraz 2) rozpocząć testowanie wykonalności terapii regeneracyjnych dla A-T, poprzez generowanie autologicznych komórek macierzystych, które zostały uwolnione od choroby przez korekcję mutacji (Cel 2). Mutacje powodujące AT są prywatne, co skutkuje zmiennym zmniejszeniem aktywności ATM i odpowiednio szerokim spektrum objawów klinicznych. Chociaż najcięższa postać choroby („klasyczna” A-T, bez wykrywalnego ATM) została wymodelowana u myszy („nokaut ATM”), podejście to nie podsumowuje neurologicznych objawów choroby i jej charakterystycznego spektrum nowotworów. Co więcej, obecnie brakuje nam modeli eksperymentalnych dla tych pacjentów, których mutacje skutkują zmniejszoną aktywnością ATM („wariant” AT). Aby rozwiązać te problemy, eksperymenty w Celu 1 przetestują hipotezę, że korelacja genotyp-fenotyp w AT jest utrzymywana w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) pochodzących od pacjentów. Aby przetestować tę hipotezę, przeprogramujemy fibroblasty pacjentów z AT ze zmienną redukcją poziomów ATM i ustalimy, czy: 1) ekspresja i aktywność ATM w iPSC koreluje bezpośrednio z tymi obserwowanymi w fibroblastach pacjentów, z których pochodzą; 2) iPSC rekapitulują fenotypy obserwowane w fibroblastach, w tym upośledzoną aktywację punktu kontrolnego cyklu komórkowego, naprawę uszkodzonego pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB), wrażliwość na promieniowanie i niestabilność genomową; i 3) te fenotypy w iPSC bezpośrednio korelują z ich poziomem ekspresji / aktywności ATM. Jeśli stwierdzimy, że korelacja genotyp-fenotyp jest utrzymywana w AT iPSC, praca ta potwierdziłaby bardziej ogólne zastosowanie autologicznych iPSC do przedklinicznych badań AT, w tym oceny biomarkerów choroby, testowania leków lub genetycznych badań przesiewowych. Kliniczne objawy AT wynikają z postępującej utraty komórek i degeneracji tkanek, co sprawia, że ​​AT jest chorobą kandydującą do terapii regeneracyjnych. Eksperymenty w Celu 2 sprawdzą hipotezę, że korekta mutacji ATM w komórkach somatycznych A-T uratuje ich poważny defekt przeprogramowania i umożliwi generowanie wolnych od choroby iPSC. Aby przetestować tę hipotezę, proponujemy serię eksperymentów potwierdzających zasadę przy użyciu dobrze scharakteryzowanej złożonej heterozygotycznej linii komórkowej fibroblastów AT. Najpierw „naprawimy” jedną lub dwie mutacje ATM w tej linii przez rekombinację z egzogennym plazmidem dawcy niosącym nienaruszoną sekwencję, aby wygenerować „nośniki” (jeden normalny allel i jeden zmutowany allel) lub „nienaruszone” komórki ( dwa normalne allele). Aby zwiększyć wydajność rekombinacji, wprowadzimy DSB w bliskiej odległości od mutacji przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALENS), które wiążą się specyficznie ze zmutowanym regionem. We wstępnych eksperymentach stwierdziliśmy, że możemy z powodzeniem indukować DSB i rekombinację specyficzną dla miejsca w ludzkim locus „bezpiecznej przystani”, jak również w samym locus ATM. Po sprawdzeniu, czy rekombinacja przywraca ekspresję i funkcję ATM, przeprogramujemy skorygowane komórki na iPSC i scharakteryzujemy ich poziom ekspresji, aktywności i funkcji ATM za pomocą pasażu. Ponieważ linie „zerowe”, „nośne” i „nienaruszone” są izogeniczne, w tych eksperymentach można ocenić wpływ dawki genu ATM na przeprogramowanie i funkcję iPSC. Pod tym względem około 1% ogólnej populacji Stanów Zjednoczonych jest „nosicielem” AT, co rozszerza znaczenie tej pracy daleko poza pacjentów z AT. Ogólnie rzecz biorąc, ukończenie tego Projektu Eksploracyjnego zapewni uzasadnienie, wiedzę fachową i odczynniki do długoterminowych badań mających na celu modelowanie i leczenie AT za pomocą autologicznych iPSC i/lub ich produktów pochodnych oraz optymalizację stosowania terapii regeneracyjnych w populacji ogólnej.