Zellbasierte Ansätze zur Modellierung und Behandlung von Ataxie-Telangiektasie

Ataxia-Telangiectasia (A-T) ist ein verheerendes genetisches Syndrom von Neurodegeneration, Immunschwäche und Krebsprädisposition, das durch Mutationen im Locus verursacht wird, der für ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) kodiert. Der derzeitige Behandlungsstandard für A-T besteht aus aggressiven unterstützenden Maßnahmen, und die Prognose bleibt schlecht. Es besteht daher ein dringender Bedarf, neue experimentelle Ansätze und Behandlungen für diese Krankheit zu entwickeln. In diesem Antrag schlagen wir vor, diesen Bedarf zu decken, indem wir zum ersten Mal auf menschlichen Stammzellen basierende Technologien entwickeln, um: 1) neue experimentelle Modelle für A-T zu generieren, die die Merkmale der Krankheit über ihr komplexes Spektrum klinischer Manifestationen hinweg originalgetreu rekapitulieren (Ziel 1 ); und 2) Beginn der Erprobung der Durchführbarkeit regenerativer Therapien für A-T durch die Generierung von autologen Stammzellen, die durch Korrektur der Mutation krankheitsfrei gemacht wurden (Ziel 2). Mutationen, die A-T verursachen, sind privat, was zu einer variablen Verringerung der ATM-Aktivität und dementsprechend zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen führt. Obwohl die schwerste Form der Krankheit ("klassisches" A-T, ohne nachweisbares ATM) in der Maus modelliert wurde (ATM "knock out"), kann dieser Ansatz die neurologischen Symptome der Krankheit und ihr charakteristisches Tumorspektrum nicht rekapitulieren. Außerdem fehlen uns derzeit experimentelle Modelle für jene Patienten, deren Mutationen zu einer reduzierten ATM-Aktivität führen ("Variante" A-T). Um diese Probleme anzugehen, werden Experimente in Ziel 1 die Hypothese testen, dass die Genotyp-Phänotyp-Korrelation in A-T in von Patienten stammenden induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aufrechterhalten wird. Um diese Hypothese zu testen, werden wir Fibroblasten von A-T-Patienten mit variabler Reduktion der ATM-Spiegel umprogrammieren und bestimmen, ob: 1) ATM-Expression und -Aktivität in den iPSCs direkt mit denen korrelieren, die in den Patientenfibroblasten beobachtet werden, von denen sie stammen; 2) die iPSCs rekapitulieren die in den Fibroblasten beobachteten Phänotypen, einschließlich einer gestörten Zellzyklus-Checkpoint-Aktivierung, Reparatur eines defekten DNA-Doppelstrangbruchs (DSB), Strahlenempfindlichkeit und genomischer Instabilität; und 3) diese Phänotypen in den iPSCs korrelieren direkt mit ihrem Grad an ATM-Expression/-Aktivität. Wenn wir feststellen, dass die Genotyp-Phänotyp-Korrelation in A-T-iPSCs aufrechterhalten wird, würde diese Arbeit eine allgemeinere Verwendung von autologen iPSCs für präklinische Studien von A-T validieren, einschließlich der Bewertung von Krankheitsbiomarkern, Arzneimitteltests oder genetischem Screening. Die klinischen Manifestationen von A-T resultieren aus fortschreitendem Zellverlust und Gewebedegeneration, was A-T zu einem Krankheitskandidaten für regenerative Therapien macht. Experimente in Ziel 2 werden die Hypothese testen, dass die Korrektur der ATM-Mutation in somatischen A-T-Zellen ihren schwerwiegenden Reprogrammierungsdefekt rettet und die Erzeugung von krankheitsfreien iPSCs ermöglicht. Um diese Hypothese zu testen, schlagen wir eine Reihe von Proof-of-Principle-Experimenten mit einer gut charakterisierten zusammengesetzten heterozygoten A-T-Fibroblasten-Zelllinie vor. Zuerst „reparieren“ wir entweder eine oder die beiden ATM-Mutationen in dieser Linie durch Rekombination mit einem exogenen Spenderplasmid, das die intakte Sequenz trägt, um entweder „Träger“ (ein normales Allel und ein mutiertes Allel) oder „intakte“ Zellen ( zwei normale Allele). Um die Effizienz der Rekombination zu erhöhen, werden wir mithilfe von Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS), die spezifisch an die mutierte Region binden, ein DSB in unmittelbarer Nähe der Mutation einführen. In vorläufigen Experimenten stellen wir fest, dass wir erfolgreich DSBs und ortsspezifische Rekombination an einem menschlichen "Safe Harbor"-Locus sowie am ATM-Locus selbst induzieren können. Nachdem wir verifiziert haben, dass die Rekombination die ATM-Expression und -Funktion wiederherstellt, werden wir die korrigierten Zellen in iPSCs umprogrammieren und ihr Niveau der ATM-Expression, -Aktivität und -Funktion mit Passage charakterisieren. Da die Linien "Null", "Träger" und "Intakt" isogen sind, kann die Wirkung der ATM-Gendosis auf die Reprogrammierung und die iPSC-Funktion in diesen Experimenten bewertet werden. In dieser Hinsicht ist ungefähr 1 % der US-Allgemeinbevölkerung ein A-T-"Träger", was die Bedeutung dieser Arbeit weit über A-T-Patienten hinaus ausdehnt. Insgesamt wird der Abschluss dieses Explorationsprojekts die Gründe, das Fachwissen und die Reagenzien für längerfristige Studien liefern, die darauf abzielen, A-T mit autologen iPSCs und/oder ihren abgeleiteten Produkten zu modellieren und zu behandeln und den Einsatz regenerativer Therapien für die allgemeine Bevölkerung zu optimieren.