Клеточные подходы к моделированию и лечению атаксии-телеангиэктазии

Атаксия-телеангиэктазия (АТ) — разрушительный генетический синдром нейродегенерации, иммунодефицита и предрасположенности к раку, вызванный мутациями в локусе, кодирующем АТМ (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Текущий стандарт лечения AT состоит из агрессивных поддерживающих мер, и прогноз остается неблагоприятным. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых экспериментальных подходов и методов лечения этого заболевания. В этой заявке мы предлагаем удовлетворить эту потребность, впервые разработав технологии на основе стволовых клеток человека, чтобы: 1) создать новые экспериментальные модели для A-T, которые точно воспроизводят особенности заболевания во всем его сложном спектре клинических проявлений (Цель 1). ); и 2) начать проверку возможности регенеративной терапии AT путем создания аутологичных стволовых клеток, которые избавились от болезней путем коррекции мутации (Цель 2). Мутации, вызывающие АТМ, являются частными, что приводит к вариабельному снижению активности АТМ и, соответственно, к широкому спектру клинических проявлений. Хотя наиболее тяжелая форма заболевания («классическая» АТМ без определяемого АТМ) была смоделирована у мышей («нокаут АТМ»), этот подход не позволяет резюмировать неврологические симптомы заболевания и его характерный опухолевый спектр. Более того, в настоящее время у нас отсутствуют экспериментальные модели для тех пациентов, у которых мутации приводят к снижению активности АТМ («вариант» А-Т). Чтобы решить эти проблемы, эксперименты в рамках Цели 1 проверят гипотезу о том, что корреляция генотип-фенотип в АТ сохраняется в индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК). Чтобы проверить эту гипотезу, мы перепрограммируем фибробласты пациентов с АТ с различным снижением уровней АТМ и определим: 1) экспрессия и активность АТМ в иПСК напрямую коррелируют с наблюдаемыми в фибробластах пациентов, из которых они получены; 2) иПСК повторяют фенотипы, наблюдаемые в фибробластах, включая нарушение активации контрольных точек клеточного цикла, репарацию дефектных двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), радиочувствительность и нестабильность генома; и 3) эти фенотипы в iPSCs прямо коррелируют с их уровнем экспрессии/активности ATM. Если мы обнаружим, что корреляция генотип-фенотип сохраняется в АТ иПСК, эта работа подтвердит более широкое использование аутологичных иПСК для доклинических исследований АТ, включая оценку биомаркеров заболевания, тестирование лекарств или генетический скрининг. Клинические проявления А-Т являются результатом прогрессирующей потери клеток и дегенерации тканей, что делает А-Т заболеванием-кандидатом для регенеративной терапии. Эксперименты в рамках цели 2 проверят гипотезу о том, что коррекция мутации ATM в соматических клетках AT устранит их серьезный дефект перепрограммирования и позволит генерировать безболезненные иПСК. Чтобы проверить эту гипотезу, мы предлагаем серию экспериментальных экспериментов с использованием хорошо охарактеризованной линии сложных гетерозиготных АТ-фибробластов. Во-первых, мы будем «исправлять» одну или две мутации ATM в этой линии путем рекомбинации с экзогенной донорной плазмидой, несущей интактную последовательность, для получения либо «носителей» (один нормальный аллель и один мутантный аллель), либо «интактных» клеток ( два нормальных аллеля). Чтобы повысить эффективность рекомбинации, мы будем вводить DSB в непосредственной близости от мутации с использованием эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALENS), которые специфически связываются с мутировавшей областью. В предварительных экспериментах мы обнаружили, что можем успешно индуцировать DSB и сайт-специфическую рекомбинацию в локусе «безопасной гавани» человека, а также в самом локусе ATM. Убедившись, что рекомбинация восстанавливает экспрессию и функцию АТМ, мы перепрограммируем скорректированные клетки в иПСК и охарактеризуем их уровень экспрессии, активности и функции АТМ при пассаже. Поскольку «нулевые», «носители» и «интактные» линии являются изогенными, в этих экспериментах можно оценить влияние дозы гена ATM на перепрограммирование и функцию iPSC. В связи с этим примерно 1% населения США в целом является «носителем» AT, что расширяет значение этой работы далеко за пределы пациентов с AT. В целом, завершение этого исследовательского проекта предоставит обоснование, опыт и реагенты для долгосрочных исследований, направленных на моделирование и лечение А-Т аутологичными иПСК и/или их производными продуктами и оптимизацию использования регенеративной терапии для населения в целом.