Cellbaserade metoder för modellering och behandling av ataxi-telangiektasi

Ataxi-Telangiectasia (A-T) är ett förödande genetiskt syndrom av neurodegeneration, immunbrist och cancerpredisposition orsakad av mutationer i den locus som kodar ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Den nuvarande standarden för vård för A-T består av aggressiva stödjande åtgärder, och prognosen är fortfarande dålig. Det finns därför ett trängande behov av att utveckla nya experimentella metoder och behandlingar för denna sjukdom. I denna ansökan föreslår vi att tillgodose detta behov genom att för första gången utveckla mänskliga stamcellsbaserade teknologier för att: 1) generera nya experimentella modeller för A-T som troget rekapitulerar sjukdomens egenskaper över dess komplexa spektrum av kliniska manifestationer (Syfte 1) ); och 2) börja testa genomförbarheten av regenerativa terapier för A-T, via generering av autologa stamceller som har gjorts sjukdomsfria genom korrigering av mutationen (Mål 2). Mutationer som orsakar A-T är privata, vilket resulterar i varierande minskning av ATM-aktivitet och, på motsvarande sätt, ett brett spektrum av kliniska manifestationer. Även om den allvarligaste formen av sjukdomen ("klassisk" A-T, utan detekterbar ATM) har modellerats i musen (ATM "knock out"), misslyckas detta tillvägagångssätt med att rekapitulera de neurologiska symptomen på sjukdomen och dess karakteristiska tumörspektrum. Dessutom saknar vi för närvarande experimentella modeller för de patienter vars mutationer resulterar i minskad ATM-aktivitet ("variant" A-T). För att ta itu med dessa problem kommer experiment i mål 1 att testa hypotesen att genotyp-fenotyp-korrelationen i A-T upprätthålls i patient-härledda inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För att testa denna hypotes kommer vi att omprogrammera fibroblaster från A-T-patienter med variabel minskning av ATM-nivåer och avgöra om: 1) ATM-uttryck och aktivitet i iPSC:erna korrelerar direkt med de som observeras i patientfibroblasterna de härrör från; 2) iPSC:erna rekapitulerar fenotyperna som observerats i fibroblasterna, inklusive försämrad cellcykelkontrollpunktsaktivering, defekt DNA dubbelsträngsbrott (DSB) reparation, radiokänslighet och genomisk instabilitet; och 3) dessa fenotyper i iPSCs korrelerar direkt med deras nivå av ATM-uttryck/aktivitet. Om vi ​​finner att genotyp-fenotyp-korrelationen bibehålls i A-T iPSCs, skulle detta arbete validera en mer allmän användning av autologa iPSCs för prekliniska studier av A-T, inklusive utvärdering av sjukdomsbiomarkörer, drogtester eller genetisk screening. De kliniska manifestationerna av A-T är ett resultat av progressiv cellförlust och vävnadsdegeneration, vilket gör A-T till en kandidatsjukdom för regenerativa terapier. Experiment i mål 2 kommer att testa hypotesen att korrigering av ATM-mutationen i A-T somatiska celler kommer att rädda deras allvarliga omprogrammeringsdefekt och möjliggöra generering av sjukdomsfria iPSCs. För att testa denna hypotes föreslår vi en serie proof-of-princip-experiment med användning av en välkarakteriserad sammansatt heterozygot A-T-fibroblastcellinje. Först kommer vi att "reparera" antingen en eller de två ATM-mutationerna i denna linje genom rekombination med en exogen donatorplasmid som bär den intakta sekvensen, för att generera antingen "bärare" (en normal allel och en muterad allel) eller "intakta" celler ( två normala alleler). För att öka effektiviteten av rekombination kommer vi att introducera en DSB i nära anslutning till mutationen med hjälp av Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS) som binder specifikt till den muterade regionen. I preliminära experiment finner vi att vi framgångsrikt kan inducera DSB:er och platsspecifik rekombination vid en mänsklig "säker hamn"-lokus såväl som vid själva ATM-lokuset. Efter att ha verifierat att rekombination återställer ATM-uttryck och funktion, kommer vi att programmera om de korrigerade cellerna till iPSCs och karakterisera deras nivå av ATM-uttryck, aktivitet och funktion med passage. Eftersom "noll", "bärare" och "intakta" linjerna är isogena, kan effekten av ATM-gendos på omprogrammering och iPSC-funktion utvärderas i dessa experiment. I detta avseende är ungefär 1 % av USA:s allmänna befolkning en A-T-"bärare", vilket utvidgar betydelsen av detta arbete långt bortom A-T-patienter. Sammantaget kommer slutförandet av detta Exploratory Project att tillhandahålla logiken, expertis och reagenser för långsiktiga studier som syftar till att modellera och behandla A-T med autologa iPSCs och/eller deras härledda produkter och optimera användningen av regenerativa terapier för den allmänna befolkningen.