Enfoques basados ​​en células para modelar y tratar la ataxia-telangiectasia

La ataxia-telangiectasia (A-T) es un síndrome genético devastador de neurodegeneración, inmunodeficiencia y predisposición al cáncer causado por mutaciones en el locus que codifica ATM (ataxia-telangiectasia mutada). El estándar actual de atención para A-T consiste en medidas de apoyo agresivas, y el pronóstico sigue siendo malo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevos enfoques experimentales y tratamientos para esta enfermedad. En esta aplicación, proponemos abordar esta necesidad mediante el desarrollo por primera vez de tecnologías basadas en células madre humanas para: 1) generar nuevos modelos experimentales para A-T que recapitulen fielmente las características de la enfermedad en todo su complejo espectro de manifestaciones clínicas (Objetivo 1 ); y 2) comenzar a probar la viabilidad de terapias regenerativas para A-T, a través de la generación de células madre autólogas que han quedado libres de enfermedad mediante la corrección de la mutación (Objetivo 2). Las mutaciones que causan A-T son privadas, lo que da como resultado una reducción variable de la actividad de ATM y, en consecuencia, un amplio espectro de manifestaciones clínicas. Aunque la forma más grave de la enfermedad (AT "clásica", sin ATM detectable) se ha modelado en el ratón ("knock out" de ATM), este enfoque no logra recapitular los síntomas neurológicos de la enfermedad y su espectro tumoral característico. Además, actualmente carecemos de modelos experimentales para aquellos pacientes cuyas mutaciones dan como resultado una reducción de la actividad de ATM ("variante" A-T). Para abordar estos problemas, los experimentos del Objetivo 1 probarán la hipótesis de que la correlación genotipo-fenotipo en A-T se mantiene en células madre pluripotentes inducidas derivadas de pacientes (iPSC). Para probar esta hipótesis, reprogramaremos fibroblastos de pacientes A-T con una reducción variable de los niveles de ATM y determinaremos si: 1) la expresión y la actividad de ATM en las iPSC se correlacionan directamente con las observadas en los fibroblastos del paciente de los que se derivan; 2) las iPSC recapitulan los fenotipos observados en los fibroblastos, incluida la activación alterada del punto de control del ciclo celular, la reparación defectuosa de la rotura de doble cadena (DSB) del ADN, la radiosensibilidad y la inestabilidad genómica; y 3) estos fenotipos en las iPSC se correlacionan directamente con su nivel de expresión/actividad de ATM. Si encontramos que la correlación genotipo-fenotipo se mantiene en las iPSC A-T, este trabajo validaría un uso más general de iPSC autólogas para estudios preclínicos de A-T, incluida la evaluación de biomarcadores de enfermedades, pruebas de drogas o detección genética. Las manifestaciones clínicas de la A-T resultan de la pérdida celular progresiva y la degeneración de los tejidos, lo que convierte a la A-T en una enfermedad candidata para las terapias regenerativas. Los experimentos en el Objetivo 2 probarán la hipótesis de que la corrección de la mutación ATM en las células somáticas A-T rescatará su grave defecto de reprogramación y permitirá la generación de iPSC libres de enfermedad. Para probar esta hipótesis, proponemos una serie de experimentos de prueba de principio utilizando una línea celular de fibroblastos A-T heterocigotos compuestos bien caracterizados. Primero, "repararemos" una o las dos mutaciones de ATM en esta línea mediante la recombinación con un plásmido donante exógeno que lleve la secuencia intacta, para generar "portadores" (un alelo normal y un alelo mutado) o células "intactas" ( dos alelos normales). Para aumentar la eficiencia de la recombinación, introduciremos un DSB muy cerca de la mutación utilizando nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALENS) que se unen específicamente a la región mutada. En los experimentos preliminares, descubrimos que podemos inducir con éxito los DSB y la recombinación específica del sitio en un locus de "puerto seguro" humano, así como en el propio locus ATM. Después de verificar que la recombinación restaura la expresión y función de ATM, reprogramaremos las células corregidas en iPSC y caracterizaremos su nivel de expresión, actividad y función de ATM con paso. Debido a que las líneas "nula", "portadora" e "intacta" son isogénicas, el efecto de la dosis del gen ATM en la reprogramación y la función iPSC se puede evaluar en estos experimentos. En este sentido, aproximadamente el 1 % de la población general de EE. UU. es un "portador" de A-T, lo que amplía la importancia de este trabajo mucho más allá de los pacientes con A-T. En general, la finalización de este Proyecto Exploratorio proporcionará la justificación, la experiencia y los reactivos para estudios a más largo plazo destinados a modelar y tratar A-T con iPSC autólogas y/o sus productos derivados y optimizar el uso de terapias regenerativas para la población general.