Abordagens baseadas em células para modelagem e tratamento de ataxia-telangiectasia

A Ataxia-Telangiectasia (A-T) é uma síndrome genética devastadora de neurodegeneração, imunodeficiência e predisposição ao câncer causada por mutações no locus que codifica ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). O padrão atual de tratamento para A-T consiste em medidas de suporte agressivas, e o prognóstico permanece ruim. Existe, portanto, uma necessidade premente de desenvolver novas abordagens experimentais e tratamentos para esta doença. Nesta aplicação, propomos atender a essa necessidade desenvolvendo pela primeira vez tecnologias baseadas em células-tronco humanas para: 1) gerar novos modelos experimentais para A-T que recapitulem fielmente as características da doença em seu complexo espectro de manifestações clínicas (objetivo 1 ); e 2) começar a testar a viabilidade de terapias regenerativas para A-T, por meio da geração de células-tronco autólogas que se tornaram livres de doença pela correção da mutação (objetivo 2). As mutações que causam A-T são privadas, resultando em redução variável na atividade da ATM e, correspondentemente, em um amplo espectro de manifestações clínicas. Embora a forma mais grave da doença (A-T clássica, sem ATM detectável) tenha sido modelada no camundongo (ATM "knock out"), esta abordagem falha em recapitular os sintomas neurológicos da doença e seu espectro tumoral característico. Além disso, atualmente faltam modelos experimentais para aqueles pacientes cujas mutações resultam em redução da atividade da ATM ("variante" A-T). Para abordar essas questões, os experimentos no Objetivo 1 testarão a hipótese de que a correlação genótipo-fenótipo em A-T é mantida em células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de pacientes (iPSCs). Para testar essa hipótese, reprogramaremos fibroblastos de pacientes com A-T com redução variável dos níveis de ATM e determinaremos se: 1) a expressão e atividade de ATM nas iPSCs se correlacionam diretamente com aquelas observadas nos fibroblastos de pacientes dos quais são derivadas; 2) as iPSCs recapitulam os fenótipos observados nos fibroblastos, incluindo ativação prejudicada do ponto de checagem do ciclo celular, reparo defeituoso da quebra de fita dupla (DSB) do DNA, radiossensibilidade e instabilidade genômica; e 3) esses fenótipos nas iPSCs se correlacionam diretamente com seu nível de expressão/atividade ATM. Se descobrirmos que a correlação genótipo-fenótipo é mantida em A-T iPSCs, este trabalho validaria um uso mais geral de iPSCs autólogos para estudos pré-clínicos de A-T, incluindo a avaliação de biomarcadores de doenças, testes de drogas ou triagem genética. As manifestações clínicas da A-T resultam da perda progressiva de células e da degeneração tecidual, tornando a A-T uma doença candidata a terapias regenerativas. Os experimentos no Objetivo 2 testarão a hipótese de que a correção da mutação ATM em células somáticas A-T resgatará seu grave defeito de reprogramação e permitirá a geração de iPSCs livres de doenças. Para testar esta hipótese, propomos uma série de experimentos de prova de princípio usando uma linhagem celular de fibroblastos A-T heterozigotos compostos bem caracterizados. Primeiro, "repararemos" uma ou duas mutações ATM nesta linha por recombinação com um plasmídeo doador exógeno carregando a sequência intacta, para gerar células "portadoras" (um alelo normal e um alelo mutado) ou células "intactas" ( dois alelos normais). Para aumentar a eficiência da recombinação, introduziremos um DSB próximo à mutação usando transcrição ativador-Like Effector Nucleases (TALENS) que se ligam especificamente à região mutante. Em experimentos preliminares, descobrimos que podemos induzir com sucesso DSBs e recombinação específica do local em um locus de "porto seguro" humano, bem como no próprio locus ATM. Depois de verificar que a recombinação restaura a expressão e a função da ATM, reprogramaremos as células corrigidas em iPSCs e caracterizaremos seu nível de expressão, atividade e função da ATM com passagem. Como as linhas "nula", "transportadora" e "intacta" são isogênicas, o efeito da dose do gene ATM na reprogramação e na função iPSC pode ser avaliado nesses experimentos. A esse respeito, aproximadamente 1% da população geral dos EUA é um "portador" de A-T, estendendo a importância deste trabalho muito além dos pacientes com A-T. No geral, a conclusão deste Projeto Exploratório fornecerá a justificativa, conhecimento e reagentes para estudos de longo prazo destinados a modelar e tratar A-T com iPSCs autólogos e/ou seus produtos derivados e otimizar o uso de terapias regenerativas para a população em geral.