Cellebaserte tilnærminger for modellering og behandling av ataksi-telangiektasi

Ataxia-Telangiectasia (A-T) er et ødeleggende genetisk syndrom av nevrodegenerasjon, immunsvikt og kreftpredisposisjon forårsaket av mutasjoner i locus-kodende ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Dagens standard for omsorg for A-T består av aggressive støttetiltak, og prognosen er fortsatt dårlig. Det er derfor et presserende behov for å utvikle nye eksperimentelle tilnærminger og behandlinger for denne sykdommen. I denne søknaden foreslår vi å møte dette behovet ved å utvikle for første gang menneskelige stamcellebaserte teknologier for å: 1) generere nye eksperimentelle modeller for A-T som trofast rekapitulerer sykdommens trekk på tvers av dets komplekse spekter av kliniske manifestasjoner (Mål 1 ); og 2) begynne å teste gjennomførbarheten av regenerative terapier for A-T, via generering av autologe stamceller som har blitt gjort sykdomsfrie ved korreksjon av mutasjonen (Mål 2). Mutasjoner som forårsaker A-T er private, noe som resulterer i variabel reduksjon i ATM-aktivitet og tilsvarende et bredt spekter av kliniske manifestasjoner. Selv om den mest alvorlige formen av sykdommen ("klassisk" A-T, uten detekterbar ATM) har blitt modellert i mus (ATM "knock out"), klarer ikke denne tilnærmingen å rekapitulere de nevrologiske symptomene på sykdommen og dens karakteristiske tumorspekter. Dessuten mangler vi for tiden eksperimentelle modeller for de pasientene hvis mutasjoner resulterer i redusert ATM-aktivitet ("variant" A-T). For å løse disse problemene vil eksperimenter i Mål 1 teste hypotesen om at genotype-fenotype-korrelasjonen i A-T opprettholdes i pasient-avledede induserte pluripotente stamceller (iPSCs). For å teste denne hypotesen vil vi omprogrammere fibroblaster fra A-T-pasienter med variabel reduksjon av ATM-nivåer og bestemme om: 1) ATM-ekspresjon og aktivitet i iPSC-ene korrelerer direkte med de som er observert i pasientfibroblastene de er avledet fra; 2) iPSC-ene rekapitulerer fenotypene observert i fibroblastene, inkludert svekket cellesykluskontrollpunktaktivering, reparasjon av defekt DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB), radiosensitivitet og genomisk ustabilitet; og 3) disse fenotypene i iPSC-ene korrelerer direkte med nivået av ATM-uttrykk/aktivitet. Hvis vi finner at genotype-fenotype-korrelasjonen opprettholdes i A-T iPSCs, vil dette arbeidet validere en mer generell bruk av autologe iPSCs for prekliniske studier av A-T, inkludert evaluering av sykdomsbiomarkører, medikamenttesting eller genetisk screening. De kliniske manifestasjonene av A-T er et resultat av progressivt celletap og vevsdegenerasjon, noe som gjør A-T til en kandidatsykdom for regenerative terapier. Eksperimenter i mål 2 vil teste hypotesen om at korreksjon av ATM-mutasjonen i A-T somatiske celler vil redde deres alvorlige omprogrammeringsdefekt og tillate generering av sykdomsfrie iPSC-er. For å teste denne hypotesen foreslår vi en serie bevis-av-prinsipp-eksperimenter ved bruk av en godt karakterisert sammensatt heterozygot A-T fibroblastcellelinje. Først vil vi "reparere" enten en eller de to ATM-mutasjonene i denne linjen ved rekombinasjon med et eksogent donorplasmid som bærer den intakte sekvensen, for å generere enten "bærere" (en normal allel og en mutert allel) eller "intakte" celler ( to normale alleler). For å øke effektiviteten av rekombinasjon vil vi introdusere en DSB i umiddelbar nærhet til mutasjonen ved å bruke Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENS) som binder spesifikt til den muterte regionen. I foreløpige eksperimenter finner vi at vi med hell kan indusere DSB-er og stedsspesifikk rekombinasjon ved et menneskelig "trygg havn"-lokus så vel som ved selve ATM-lokuset. Etter å ha verifisert at rekombinasjon gjenoppretter ATM-uttrykk og funksjon, vil vi omprogrammere de korrigerte cellene til iPSC-er og karakterisere nivået av ATM-uttrykk, aktivitet og funksjon med passasje. Fordi "null", "bærer" og "intakt" linjer er isogene, kan effekten av ATM-gendose på omprogrammering og iPSC-funksjon evalueres i disse eksperimentene. I denne forbindelse er omtrent 1 % av den generelle befolkningen i USA en A-T-"bærer", noe som utvider betydningen av dette arbeidet langt utover A-T-pasienter. Samlet sett vil fullføringen av dette utforskende prosjektet gi begrunnelsen, ekspertisen og reagensene for langsiktige studier rettet mot modellering og behandling av A-T med autologe iPSCs og/eller deres avledede produkter og optimalisering av bruken av regenerative terapier for den generelle befolkningen.