Solupohjaiset lähestymistavat ataksia-telangiektasiaan mallintamiseen ja hoitoon

Ataksia-telangiektasia (A-T) on tuhoisa geneettinen hermoston rappeutumisen, immuunipuutoksen ja syöpäalttiuden oireyhtymä, jonka aiheuttavat mutaatiot ATM:ää koodaavassa lokuksessa (Ataxia-Telangiectasia Mutated). Nykyinen A-T:n hoidon taso koostuu aggressiivisista tukitoimenpiteistä, ja ennuste on edelleen huono. Siksi on kipeä tarve kehittää uusia kokeellisia lähestymistapoja ja hoitoja tälle taudille. Tässä hakemuksessa ehdotamme, että vastataan tähän tarpeeseen kehittämällä ensimmäistä kertaa ihmisen kantasoluihin perustuvia teknologioita, joilla: 1) luodaan uusia kokeellisia malleja A-T:lle, jotka toistavat uskollisesti taudin piirteet sen monimutkaisen kliinisen ilmenemismuodon yli (tavoite 1). ); ja 2) alkaa testata A-T:n regeneratiivisten hoitojen toteutettavuutta generoimalla autologisia kantasoluja, jotka on tehty taudista vapaiksi mutaatiota korjaamalla (tavoite 2). A-T:tä aiheuttavat mutaatiot ovat yksityisiä, mikä johtaa vaihtelevaan ATM-aktiivisuuden vähenemiseen ja vastaavasti laajaan kliinisten ilmenemismuotojen kirjoon. Vaikka taudin vakavin muoto ("klassinen" A-T, jossa ei ole havaittavissa olevaa ATM:ää) on mallinnettu hiirellä (ATM "knock out"), tällä lähestymistavalla ei pystytä kuvaamaan uudelleen taudin neurologisia oireita ja sille ominaista kasvainspektriä. Lisäksi meiltä puuttuu tällä hetkellä kokeellisia malleja niille potilaille, joiden mutaatiot johtavat alentuneeseen ATM-aktiivisuuteen ("variantti" A-T). Näiden ongelmien ratkaisemiseksi tavoitteen 1 kokeilla testataan hypoteesia, jonka mukaan genotyyppi-fenotyyppi-korrelaatio A-T:ssä säilyy potilaasta peräisin olevissa indusoiduissa pluripotenteissa kantasoluissa (iPSC). Tämän hypoteesin testaamiseksi ohjelmoimme uudelleen A-T-potilaiden fibroblastit, joilla on vaihteleva ATM-tasojen aleneminen, ja määritämme, korreloivatko: 1) ATM:n ilmentyminen ja aktiivisuus iPSC:issä suoraan niiden potilaiden fibroblasteissa, joista ne ovat peräisin; 2) iPSC:t tiivistävät fibroblasteissa havaitut fenotyypit, mukaan lukien heikentynyt solusyklin tarkistuspisteen aktivaatio, viallisen DNA:n kaksoisjuostekatkon (DSB) korjaus, radioherkkyys ja genominen epävakaus; ja 3) nämä iPSC:n fenotyypit korreloivat suoraan niiden ATM-ilmentymisen/aktiivisuuden tason kanssa. Jos havaitsemme, että genotyyppi-fenotyyppikorrelaatio säilyy A-T iPSC:issä, tämä työ validoisi autologisten iPSC:iden yleisemmän käytön A-T:n prekliinisissä tutkimuksissa, mukaan lukien sairauden biomarkkerien arviointi, lääketestaus tai geneettinen seulonta. A-T:n kliiniset ilmenemismuodot johtuvat progressiivisesta solukadosta ja kudosten rappeutumisesta, mikä tekee A-T:stä ehdokassairauden regeneratiivisille hoidoille. Tavoitteen 2 kokeet testaavat hypoteesia, että ATM-mutaation korjaaminen A-T-somaattisissa soluissa pelastaa niiden vakavan uudelleenohjelmointivirheen ja mahdollistaa taudista vapaita iPSC:itä. Tämän hypoteesin testaamiseksi ehdotamme sarjaa periaatetodistekokeita käyttämällä hyvin karakterisoitua yhdistettä, heterotsygoottista A-T fibroblastisolulinjaa. Ensin "korjaamme" joko yhden tai kaksi ATM-mutaatiota tässä linjassa rekombinaatiolla eksogeenisen luovuttajaplasmidin kanssa, joka kantaa ehjän sekvenssin, luodaksemme joko "kantajat" (yksi normaali alleeli ja yksi mutatoitunut alleeli) tai "enttejä" soluja ( kaksi normaalia alleelia). Rekombinaation tehokkuuden lisäämiseksi otamme käyttöön DSB:n mutaation välittömään läheisyyteen käyttämällä transkriptioaktivaattorin kaltaisia ​​efektorinukleaaseja (TALENS), jotka sitoutuvat spesifisesti mutatoituun alueeseen. Alustavissa kokeissa havaitsemme, että voimme onnistuneesti indusoida DSB:t ja paikkaspesifisen rekombinaation ihmisen "safe harbor" -lokuksessa sekä itse ATM-lokuksessa. Kun olemme varmistaneet, että rekombinaatio palauttaa ATM:n ilmentymisen ja toiminnan, ohjelmoimme korjatut solut uudelleen iPSC:iksi ja karakterisoimme niiden ATM-ilmentymisen, aktiivisuuden ja toiminnan siirrolla. Koska "nolla-", "kantaja-" ja "eettiset" linjat ovat isogeenisiä, ATM-geeniannoksen vaikutusta uudelleenohjelmointiin ja iPSC:n toimintaan voidaan arvioida näissä kokeissa. Tässä suhteessa noin 1 % Yhdysvaltain väestöstä on A-T:n "kantajia", mikä laajentaa tämän työn merkityksen paljon A-T-potilaiden ulkopuolelle. Kaiken kaikkiaan tämän tutkivan hankkeen loppuun saattaminen tarjoaa perusteet, asiantuntemuksen ja reagenssit pitkän aikavälin tutkimuksille, joiden tarkoituksena on mallintaa ja hoitaa A-T autologisilla iPSC:illä ja/tai niistä johdetuilla tuotteilla ja optimoida regeneratiivisten hoitojen käyttö väestölle.