骨下歯周欠損症の再建のための自家肺胞骨髄間葉系幹細胞 (PerioRegen)

目的と目的 本研究では、動物由来の試薬を含まない自家 BM-MSC を使用して、歯周骨下欠損症の歯周組織を再生するための新しい方法について説明します。 ）。

主な目的 この研究の目的は、BM-MSC/フィブリン接着剤/コラーゲン フリースのバイオ複合体を使用した歯周骨下欠損の新規再生治療の有効性を、フィブリン接着剤/コラーゲン フリースの無細胞移植代替物と比較して評価することです。移植材料を補助的に使用しないオープンフラップデブリドマンの治療アプローチを制御します。

副次的な目的

• 強化された治療結果の安定性を文書化し、研究期間中のオープンフラップデブリドマンの対照治療と比較して、BM-MSC移植の安全性と有効性を評価し続けること。
• 骨下歯周欠損症などの慢性疾患部位におけるBM-MSCの移植の局所的および全身的影響を理解するために、研究期間を通じて参加者の免疫学的および微生物学的プロファイルを決定します。 さらに、治療に対する治癒反応は、観察期間全体で決定されます（ベースラインから12か月）。

研究デザイン

治験薬 aBM-MSC 培養は、グループ A に属する各患者の歯槽骨の骨髄に由来する骨生検から確立されます。手短に言えば、クロルヘキシジン 0.12% で 1 分間十分に口腔洗浄した後、トレフィン ドリルを使用した骨切り術が行われます。歯槽骨で実行され、2x8 mm の骨コアが採取されます。 その領域を生理食塩水で洗浄し、次にフラップを縫合してドナー部位で一次閉鎖を達成します。 その後、骨サンプルはすぐに HBSS と抗生物質/抗真菌薬を含む滅菌チューブに入れられ、欧州連合が臨床グレードのステムの調製のために設定した品質ガイドラインを満たす GLP (Good Laboratory Practice) 準拠の認定施設に運ばれます。患者に届けるための細胞培養。 aBM-MSC の分離は、以前に説明されているように (Bakopolou 2013)、酵素的解離法を使用して実行されます。 培養拡大のために、ウシ血清などの動物由来試薬の使用を避けるために、各被験者から採取した静脈血60mlから得た自己血清を使用してMEM細胞培養培地を補充する。 骨生検は、確立された文化の高い生存率を確保するためにすぐに処理されます。 2 継代の増殖後 (細胞ドナーに応じて約 16 ～ 24 日かかります)、患者への送達のために細胞を採取します。 細胞の解離と継代には、ブタトリプシンの使用を避けるために、高度に精製された GMP 適合組換え酵素 (Tryple、Thermo Fisher Scientific) が使用されます。 この段階で、グループ B の自家フィブリン接着剤の調製には 20ml の静脈血のサンプルが必要になります。グループ A の最初の瀉血 (60ml) は、細胞培養とフィブリン接着剤の準備の必要性をカバーします。 続いて、フィブリン接着剤は、臨床応用の直前に、幹細胞を含む（グループA）または含まない（グループB）市販のコラーゲンフリース足場にロードされます。

臨床応用前の確立された BM-MSC 培養の品質管理

患者への配送前に、すべての BM-MSC 培養物が以下について評価されます。

• トリパンブルー排除を使用した生存率
• 無菌性：培養物は、細菌、マイコプラズマ、およびエンドトキシンによる潜在的な汚染についてテストされます（LALテスト）
• MSC に関して国際細胞療法学会 (ISCT) によって確立された最小限の基準に基づく「幹性」特性 (Dominici et al 2006)。

注: 幹細胞の特徴付け方法に関する方法論は、私たちの研究グループ (Bakopoulou et al. 2013) による以前の出版物で分析的に説明されています。

BM-MSC/フィブリン接着剤/CaCl2混合物をコラーゲン足場に適用した後、無作為に選択された症例のバイオコンプレックスの少量のサンプルを外科用ハサミを使用して分離し、さらに実験室に移します(臨床応用と並行して)。 )生体模倣微小環境における幹細胞挙動のex vivo特性評価。 これにより、幹細胞の挙動と臨床転帰との間の相関関係が可能になります。これは、再生組織を宿主から直接取得して分析することは倫理的な理由から実行できないためです。

自己フィブリン接着剤の調製 静脈血 20 ml をグループ A および B の患者の前肘窩から採取し、血液サンプルを直ちに抗凝固剤を含むファルコン チューブに移します。 血小板数を測定した後、血液サンプルを遠心分離 (2000rpm、10 分) し、血漿を分離して別のファルコンに保存します。 次に血小板数を測定し、サンプルを再度遠心分離します。 次いで、ＰＲＰ（１，０００，０００ｐｌｔｓ／μｌを含有する多血小板血漿）を上清ＰＰＰ（乏血小板血漿）から分離し、両方の調製物をフィブリン接着剤調製のための標準プロトコールに従ってさらに処理する（Ｂｉｏｈｅｌｌｅｎｉｋａ、テッサロニキ、ギリシャ）。

研究の臨床部門のデザイン

被験者の事前選択 被験者は、予防歯科、歯周病学およびインプラント生物学科の新しい紹介者から募集されます。外部への広告や募集は行われません。 被験者は一般的な健康状態にある。

研究への参加 研究への参加前に、各被験者は研究責任者から研究の性質とリスクについて口頭および書面で通知され（被験者情報フォーム）、書面によるインフォームド コンセント（被験者のインフォームド コンセント署名フォーム）が提供されます。得られた。 各被験者には、正式に署名された同意書のコピーが渡され、自分の記録のために保持されます。 プロトコルで設定された包含基準と除外基準に従って、被験者の個人的な人口統計と病歴、および研究の適合性が記録されます。 被験者は、除外基準に含まれていない薬を継続することができます。ただし、これらの薬は、事前に除外されていない併発する病状とともに文書化する必要があります。

被験者の中止または中止の手順 個人的またはその他の理由で研究からの離脱を希望する被験者は、そうする権利があります。 ただし、理由が試験製品に関連しているかどうかに加えて、被験者が研究から除外された理由は、主任研究者によって記録されます。 2回以上出席しなかった参加者は、研究から除外されます。 有害事象を経験した被験者は、研究へのさらなる参加から除外されます。

被験者が研究からの離脱を希望する場合、離脱日までに可能な限り徹底的に観察を完了し、報告するためにあらゆる努力が払われます。 被験者は、中止の理由についてさらに情報を提供することを検討するよう求められます。 報告された情報はすべて記録されます。

各被験者参加の予想期間 各被験者は、12 か月間で合計 9 回の訪問に参加することが期待されます。 1回のスクリーニング訪問、指定された領域の外科的治療を受けるための1回の治療訪問、4回のフォローアップレビュー、および臨床的および放射線学的再評価およびサンプル収集（全唾液、歯肉溝液（GCF）、歯肉縁下プラーク）のための3回の追加訪問。

治験責任医師の較正および無作為化 患者は、1 人の試験官によって適格性についてスクリーニングされ、コード番号を取得した後、継続的に一度に 1 人登録されます。 データ収集に関与していない試験の寄稿者が無作為化を行い、電話通信を使用して治療法をセラピストに発表します。 臨床評価は、以前の記録にアクセスできず、他の臨床手順に関与していない単一の検査官によって実行されます。 PPD、CAL、および欠陥の解剖学的構造の評価について、許容可能な検査者内再現性を得るために、調査者のキャリブレーション演習が実行されます。 検査者内の再現性は、クラス内相関係数 (ICC) および Bland-Altman の 95% 一致限界 (Bland and Altman, 1999) によって評価されます。

実験データの統計分析 分析は、IBM Statistics SPSS 20.0 ソフトウェアを使用して実行されます。 データは平均 +/- 標準偏差 (SD) として表されます。 無作為化手順によって生成されるテスト グループとコントロール グループ間の不均衡は、連続変数の独立サンプル t 検定と、カテゴリ変数のフィッシャーの正確確率検定またはカイ 2 乗検定を使用して評価されます。 従属変数である CAL の変化、PPD の変化、および X 線写真の変化に対する治療効果の有意性は、SPSS MIXED 手順を使用して線形混合モデルを構築することによって推定されます。 すべての分析について、統計的有意性は p<0.05 に設定されます。

倫理的考慮事項 / 幹細胞培養の認可 ギリシャ、テッサロニキのバイオヘレニカは、幹細胞の処理と保管に関する最も厳しい規制の下で運営されている最先端の施設とラボを提供しています。 研究所は、政府の命令 26/24-3-2008 (欧州法 2004/23/K および理事会 31-3-2004 による寄付の品質と安全性の確立のためのギリシャ法の規制、ヒト組織および細胞の購入、品質管理、凍結保存、保管、および配布 (EEL 102/7-4-2004) および関連するガイドライン 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) および 2006/86EK (EEL 294) /25-10-2006)。 ライセンス F 6172/17514/1269 は、Gov. paper 2589 31/12/2009 で公開されています。

2014 年 11 月以来、Biohellenika は新しい法律 3984 の下で運営されています。この法律は、国家移植委員会が保健省に積極的に勧告した後、2011 年に政府文書 No 150 で公開されており、現在、新しいライセンスが政府文書で公開されようとしています。

ラボと手順は、2014 年 9 月 30 日の最終検査である米国血液銀行協会 (AABB) と、ISO 15189:2007 に基づく全米認定システムによって認定されています。 また、ラボは、自家細胞系統の処理、品質管理、凍結保存については ISO 9001:2008 に従って認定されており、Biohellenika の国際特許でもある凍結保存システムについては ISO 13485:2003 に従って認定されています。

クリーンルームは、ISO 14644-5 を使用した BSR Ingenieur-Buro のガイドラインに従って運営されています。 セキュリティ レベルはすべての標準 ISO 27001 を満たし、会社はデータ保護機関によって認可および規制されています。

ラボは空気の質について 24 時間調査され、Cryo-View データベース システム、ISBT 128 バーコード システム、温度 - 液体 N2 レベル、セキュリティ アラーム、および 2 つの発電機が装備されています。

研究スケジュール BM-MSCの自家移植のための臨床設計と介入 重度の慢性歯周炎の被験者は、歯周ケアの動機付けと徹底的な口腔衛生指導に加えて、手動および動力駆動の器具を使用して局所麻酔下で非外科的歯周治療を受ける予定です。 . 被験者は、非外科的治療の完了から6週間後に臨床的に再評価され、歯周ポケットが残っている被験者（PPDおよびCAL≧6mm;骨下コンポーネント≧3mm）および歯肉炎症の明白な徴候がない被験者は、参加への適合性についてスクリーニングされます現在の研究。 スクリーニング訪問には、最初の全口歯周検査、口腔内レントゲン検査、および包含/除外基準の達成が含まれます。 適切な場合、研究の性質はすべての被験者に詳細に説明され、AUThの歯科学校の倫理委員会によって承認された署名入りの同意書があります。 参加者それぞれからいただきます。 次に、患者は 3 つの治療グループ (-A、-B、および -C) のいずれかにランダムに割り当てられます。 各患者の単一の欠陥が治療されます。

その後、骨生検と血液サンプルは、厳格な無菌条件下でグループ A の参加者から収集されます。 その後、各サンプルはすぐに滅菌チューブに入れられ、厳密なプロトコルに従って幹細胞の分離と拡大のためにギリシャのテッサロニキにあるバイオヘレニカ (http://www.biohellenika.gr) に輸送されます (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulouら準備中）。 MSC は、欧州連合によって設定された品質ガイドラインを満たす GLP クラスのクリーン ルームで in vitro で分離および増殖され、自家移植の実験全体で動物由来の試薬は使用されないため、細胞はヒトの臨床細胞療法アプリケーションに対して安全であると見なされます。 . Biohellenika 施設では、生検採取直後に A グループの各被験者から 60ml の静脈血が採取されるため、自己幹細胞の分離と培養拡大に自己血清が使用されます。 さらに、自家フィブリン接着剤を使用して、BM-MSC をコラーゲン フリースにロードします。 さらに、20ml の血液サンプルをグループ B の被験者から採取します。これは、骨欠損への外科的配置の前にコラーゲン フリースを強化するフィブリン接着剤を提供するためです。 最後に、グループ C の被験者は、これらの個人の骨下欠損は、移植材料の補助的な使用を伴わないオープン フラップ デブリドマンによって外科的に管理されるため、瀉血の対象にはなりません。

GLP 品質管理の一環として、MSC は無菌性とエンドトキシンについて分析され、バクテリア (BD BACTEC™)、マイコプラズマ、およびエンドトキシンによる潜在的な汚染についてもテストされます (LAL テスト)。

局所麻酔 (1:80,000 エピネフリンを含む 2% リドカイン 1.8ml; リグノスパン スペシャル、セプトドント) を、関与する歯の頬側および舌側に浸透させ、乳頭を避けます。 次に、歯肉組織、特に骨歯欠損に関連する歯間乳頭を保存するために、厳密に溝内切開が行われます (Cortellini, 2012; Cortellini and Tonetti 2007)。 グレイシーキュレットと電動器具（EMS Piezon®、EMS、Nyon、スイス）を組み合わせて使用​​して、欠陥を創面切除し、根を慎重にプレーニングします。 欠損の軟組織壁を保持するように注意し、出血を制御するために骨欠損を生理食塩水で洗浄する。

グループ A では、移植材料 (フィブリン接着剤で強化された BM-MSC) は、それぞれ 5x10E6 細胞/フィブリン 100 μl を含む 2 つのインスリン注射器で送達され、コラーゲン フリースに穏やかにロードされ、CaCl2 を添加して重合されます。 その後、バイオコンプレックスは、完全に満たされるまで、欠陥に穏やかに詰め込まれます。 足場の取り扱いは、生細胞の破壊を避けるために注意して行われます。

グループ B では、生細胞を含まないフィブリン接着剤で強化されたコラーゲン フリースが、垂直方向の骨欠損を慎重に埋めます。 グループ-Aおよび-Bでは、生細胞を含む/含まないフィブリン接着剤の送達は同じであるため、セラピストは手順を知らされません。

グループCでは、患者はグループ-Aおよび-Bの被験者と同様の方法で根面のオープンフラップデブリドマンおよびルートプレーニングを受けますが、移植材料の補助的な使用はありません。

手術者は治療法を知らされませんが (グループ -A および -B)、グループ C では移植材料が使用されないため、治療法は手術者に明らかになりますが、これは手術の終結に向かって行われます。 、臨床データの収集後。 乳頭保存技術と低侵襲手術技術がすべてのグループで求められ、骨膜の損傷を回避します。 フラップは、欠陥に関連する歯間領域で単一の修正された内部マットレス縫合糸 (5-0 Monosyn、ブラウン) を使用して再配置および縫合され、同様の縫合糸を使用して他の歯間領域のフラップを閉じます。 手術後 2 週間の臨床観察で、問題なく治癒するか、または有害な組織反応が見られるかを観察し、続いて縫合糸を除去します。

組織工学のケースシリーズ 上記と同様の包含/基準を持つがランダム化を経ない一連のケース (5) では、グループ A と同じ方法論に従って組織工学が適用されます。新たに開発された手術手技、いわゆる「閉鎖手術手技」を使用して、孤立した歯周欠損症を治療するために適用されます。 簡単に言えば、この技術は、軟部組織または歯間乳頭を切開することなく、閉じた方法で歯肉フラップの後退を伴います。 この技術は、組織の外傷、術後の不快感を最小限に抑え、軟部組織の美学を向上させます。

術後ケア 術後の痛みは、手術終了時と 12 時間後にイブプロフェン (600mg) でコントロールされます。 アモキシシリン (500mg / 8 時間、5 日間) がすべての参加者に処方されます。 すべての患者は、0.12% クロルヘキシジンを 1 日 2 回使用するように指示され、4 週間は治療部位でのブラッシング、フロス、強く噛むことを避けます。 この4週間の期間中、厳格な術後支援プログラムケアが隔週で開始され、その後、患者はクロルヘキシジン溶液によるすすぎを中止し、口腔衛生を再開します. 歯間清掃は、すべてのグループで手術後 6 週間で開始されます。 その後、被験者は歯周支持療法のために3、6、および12ヶ月で見られます。

臨床記録 BOP を含む、口全体および部位固有の歯周記録。プラーク インデックス (プラークの有無); PPD と CAL は、手動の歯周プローブ (Hu-Friedy XP-23/QW) を使用して、歯あたり 6 つの部位で最も近いミリメートルまで、4 つの時点で長軸に平行に決定されます。ベースライン、6、9、12 か月。 指定された部位（骨下欠陥）での臨床測定値は、手術前および麻酔前（ベースライン）に決定されます。 術中評価は、手術中に 1 回行われます。

手術中の臨床評価 欠陥の形態 (1、2、3 壁または組み合わせ) は、病変に関連する骨壁の数によって手術中に決定されます。セメントエナメル接合部と欠陥 (CEJ-BD) の底との間の距離は、mm で決定されます。 CEJ から骨稜の最も冠状の近位間レベル (CEJ-BC) までの距離は mm で決定されます。総欠損深さ: 骨の頂点と欠損の底部 (BC-BD) の間の距離は mm で決定されます。欠損幅（骨稜と歯根表面との間の水平距離）の幅は、mm で決定されます。

子宮頸部修復のために CEJ が検出できない場合、修復マージン (RM) は、臨床および X 線撮影測定の基準点として機能します。

X線評価 口腔内デジタルX線撮影を利用して、6つの時点で骨下欠損の骨再生を決定します。ベースライン、6 週間、3、6、9、12 か月。 標準化された根尖周囲デジタル X 線写真 (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A.、パリ、フランス) は、ロングコーン平行法を使用して取得されます。 露出ジオメトリを標準化するために、弾性印象材のカスタマイズされたバイト ブロックがセンサー ホルダー上で調整され、密閉されたプラスチック容器に室温で保管され、リコールの X 線検査の予約時に再利用されます。

手術中の評価と同様の方法で、次の解剖学的ランドマークが X 線で定義されます: セメントエナメル接合部 (CEJ)、歯槽骨の最も冠状のレベル (BC)、および骨損失の先端範囲 ( BD）。 詳細については、CEJ の場所が特定されます。歯周靭帯が均一な幅を保持している最も歯冠側の領域が X 線写真上で特定され、骨損失の最も根尖の延長が示されます。 骨下欠損は、最も冠状面と基部で欠損の幅を測定することによって計算されます。 CEJ-BD と BC-BD の間の距離。 CEJ-BC間の距離;歯根の垂直軸と歯間骨壁の間の角度 (Tonetti et al. 1993)。 骨再生の放射線評価は、治療法を知らず、以前の記録にアクセスできない同じ校正済みの検査者によって、高解像度モニターで定義されます。 評価は、数値測定用の測定ツール (VixWin™ Platinum|Gendex ソフトウェア) を使用して、センサーに取り付けられる標準的な長さ (5 mm) の金属棒を参照して実行されます。

検体の採取 以下の順番で 6 時点の検体を採取する。ベースライン、6 週間、3、6、9、12 か月。

(i) 唾液 唾液は、臨床的な歯周測定または歯周治療の前に採取されます。一般的には、一晩絶食した後の朝に採取されます。 全唾液サンプルは、30mlのポリプロピレンチューブに5分間吐き出すことによって得られます。

(ii) GCF 歯肉溝液サンプルは、欠損の頬側歯間側面から得られます。 GCF コレクションの前に、綿ロールを配置し、唾液エジェクターを使用して、表面を穏やかに風乾し、唾液から分離します。 次に、歯肉縁上のプラークを滅菌キュレットで慎重に取り除き、紙片（Periopaper、OraFlow Inc.、ニューヨーク州スミスタウン、米国）を歯周ポケットに入れ、30 秒間軽度の抵抗が感じられるまで置きます。 ストリップを配置する際に機械的外傷を避けるように注意し、血液で汚染されたストリップは廃棄します。 患者ごとの各ストリップは、別の 1.5 ml マイクロ遠心チューブに保存され、-70°C で保存されます。 使用前に、ストリップ上のタンパク質は、BSA (1% v/v) を添加したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 500 μl に溶出されます。

(iii) プラーク GCF コレクションに続いて、歯肉縁下のプラークが指定された部位から収集されます。 サンプリング領域は唾液から分離され、空気で穏やかに乾燥され、歯肉縁上プラークの堆積物が存在しないことを確認した後、2 つの紙のポイントが歯周ポケットに 30 秒間配置され、プールされたサンプルが収集されます。 すべてのサンプルは、処理前に-80°Cでエッペンドルフチューブ(エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ)に保存されます。 歯周組織の機械的障害を避けるために、ペーパーポイントを使用して微生物プラークを収集します。

データ管理 捜査官は、被験者の匿名性が維持されることを保証しなければなりません。 研究関連の文書では、被験者はイニシャル、性別、および/または被験者番号によってのみ識別可能であるべきです. 個人情報（例： 医療カード) は、他の研究固有のデータから離れた別の安全な場所に保管され、主治医のみがアクセスできるように制限されています。

インフォームド コンセントのプロセス 被験者から書面による同意を得るのは、研究責任者の責任です。 インフォームド コンセント フォームは、2 つの別個の文書で構成されます。被験者情報フォームおよび被験者インフォームドコンセント署名フォーム;両方の文書は、研究の前にAUTh歯科学校の倫理委員会によって承認されます。 被験者情報フォームは、被験者が理解できるネイティブの非専門用語で、研究の目的、目的、方法、予想される利点、および潜在的な危険性について適切な説明を提供します。 次に、治験責任医師は、被験者がインフォームド コンセント フォームを読んで理解し、臨床調査への参加を検討するための十分な時間を提供する必要があります。 被験者が臨床試験に参加する前に、治験責任医師と被験者の両方がフォームに署名し、日付を記入する必要があります。 その後、各被験者には、正式に署名され、日付が記入されたインフォームド コンセント フォームのコピーおよびその他の書面による情報が発行されます。