Células-tronco mesenquimais alveolares autólogas da medula óssea para a reconstrução de defeitos periodontais infraósseos (PerioRegen)

Metas e Objetivos O presente estudo descreve um novo método para regenerar tecidos periodontais em defeitos infraósseos periodontais usando BM-MSCs autólogos, livres de reagentes derivados de animais, produzidos em instalações de sala limpa enriquecidos com cola de fibrina autóloga e semeados em andaimes de colágeno comercialmente disponíveis (velo de colágeno ).

Objetivo primário Este estudo visa avaliar a eficácia de um novo tratamento regenerativo de defeitos periodontais infraósseos usando um biocomplexo de BM-MSCs/cola de fibrina/velo de colágeno, em comparação com um substituto de enxerto livre de células de cola de fibrina/velo de colágeno e a um abordagem de tratamento de controle de desbridamento de retalho aberto sem uso adjuvante de materiais de enxerto.

Objetivos Secundários

• Documentar a estabilidade do resultado do tratamento aprimorado e continuar a avaliar a segurança e eficácia do transplante de BM-MSCs em comparação com o tratamento de controle de desbridamento de retalho aberto durante o período do estudo.
• Determinar os perfis imunológicos e microbiológicos dos participantes ao longo do período do estudo, na tentativa de entender os efeitos locais e sistêmicos do transplante de BM-MSCs em locais com doenças crônicas, como o defeito periodontal infraósseo. Além disso, a resposta de cura ao tratamento será determinada ao longo do período de observação (linha de base até 12 meses).

Design de estudo

Produtos da investigação As culturas de aBM-MSCs serão estabelecidas a partir de biópsias ósseas derivadas da medula óssea do osso alveolar em cada paciente pertencente ao Grupo A. Resumidamente, após uma lavagem oral completa com clorexidina 0,12% por 1min, uma osteotomia usando uma broca trefina será realizada no osso alveolar e um núcleo ósseo de 2x8 mm será colhido. A área será irrigada com solução salina e, em seguida, os retalhos serão suturados para obter o fechamento primário na área doadora. A amostra de osso será imediatamente colocada em tubos estéreis contendo HBSS e antibióticos/antimicóticos e será transportada para uma instalação autorizada em conformidade com as Boas Práticas de Laboratório (GLP) que atenda às diretrizes de qualidade definidas pela União Europeia para a preparação de hastes de grau clínico culturas de células para entrega ao paciente. O isolamento de aBM-MSC será realizado pelo método de dissociação enzimática, conforme descrito anteriormente (Bakopoulou 2013). Para a expansão da cultura, soro autólogo obtido de 60ml de sangue venoso coletado de cada indivíduo será utilizado para complementar o meio de cultura de células MEM, a fim de evitar o uso de quaisquer reagentes de origem animal, como soro bovino. A biópsia óssea será imediatamente processada para garantir alta viabilidade das culturas estabelecidas. Após a expansão para duas passagens (tempo aproximado necessário de 16 a 24 dias, dependendo do doador de células), as células serão colhidas para entrega ao paciente. Para dissociação celular e passagem, enzimas recombinantes altamente purificadas e compatíveis com GMP (Tryple, Thermo Fisher Scientific) serão usadas para evitar o uso de tripsina suína. Nesta fase, será necessária uma amostra de 20ml de sangue venoso para o preparo da cola de fibrina autóloga no Grupo B, já no Grupo A a sangria inicial (60ml) cobrirá as necessidades das culturas celulares e preparo da cola de fibrina. Posteriormente, a cola de fibrina será carregada com (Grupo A) ou sem (Grupo B) células-tronco em um andaime de lã de colágeno disponível comercialmente diretamente antes da aplicação clínica.

Controle de qualidade das culturas BM-MSC estabelecidas antes da aplicação clínica

Antes da entrega ao paciente, todas as culturas de BM-MSCs serão avaliadas quanto a:

• Viabilidade usando exclusão Trypan Blue
• Esterilidade: as culturas serão testadas quanto à potencial contaminação por bactérias, micoplasma e endotoxinas (teste LAL)
• Propriedades de "tronco" com base nos critérios mínimos estabelecidos pela Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) em relação às MSCs (Dominici et al 2006).

Nota: A metodologia dos métodos de caracterização de células-tronco é descrita analiticamente em publicações anteriores de nosso grupo de pesquisa (Bakopoulou et al. 2013).

Após a aplicação da mistura de BM-MSCs/cola de fibrina/CaCl2 nos scaffolds de colágeno, uma pequena amostra do biocomplexo de casos selecionados aleatoriamente será separada usando uma tesoura cirúrgica e será transferida para o laboratório para posterior (paralelamente à aplicação clínica ) caracterização ex vivo do comportamento de células-tronco em um microambiente biomimético. Isso permitirá a correlação entre o comportamento das células-tronco e o resultado clínico, uma vez que a recuperação e análise dos tecidos regenerados diretamente do hospedeiro não é viável por razões éticas.

Preparo da cola de fibrina autóloga Serão coletados 20 ml de sangue venoso da fossa antecubital dos pacientes dos Grupos A e B e as amostras de sangue serão imediatamente transferidas para um tubo falcon, que contém anticoagulante. Após a determinação da contagem de plaquetas a amostra de sangue será centrifugada (2000rpm, 10min) e o plasma será separado e armazenado em outro falcon. A contagem de plaquetas será então determinada e a amostra será novamente centrifugada. O PRP (plasma rico em plaquetas contendo 1.000.000 plts/ul) será então separado do sobrenadante PPP (plasma pobre em plaquetas) e ambas as preparações serão processadas seguindo um protocolo padrão para preparação de cola de fibrina (Biohellenika, Thessaloniki, Grécia).

Desenho do braço clínico do estudo

Pré-seleção dos Sujeitos Os Sujeitos serão recrutados a partir de novas referências no Departamento de Odontologia Preventiva, Periodontologia e Biologia de Implantes; nenhuma publicidade externa ou recrutamento será realizado. Os indivíduos estarão em boa saúde geral.

Admissão no estudo Antes da admissão no estudo, cada sujeito será informado pelo investigador principal sobre a natureza e os riscos do estudo, tanto oralmente quanto por escrito (Formulário de informações do sujeito) e consentimento informado por escrito (Formulário de assinatura do consentimento informado do sujeito) será obtido. Cada sujeito receberá uma cópia de seu formulário de consentimento devidamente assinado para manter em seus próprios registros. Os dados demográficos pessoais e histórico médico e adequação do estudo de acordo com os critérios de inclusão e exclusão definidos no protocolo serão registrados. Os indivíduos podem continuar com qualquer medicação não incluída nos critérios de exclusão; no entanto, esses medicamentos devem ser documentados juntamente com qualquer condição médica concomitante não pré-excluída.

Procedimentos para retirada ou descontinuação do participante Qualquer participante que desejar se retirar do estudo por motivos pessoais ou por qualquer outro motivo, tem o direito de fazê-lo. No entanto, o motivo da retirada de qualquer sujeito do estudo, além de saber se o motivo está relacionado ao produto de teste, será registrado pelo investigador principal. Qualquer participante que não comparecer mais de duas vezes é removido do estudo. Os indivíduos que experimentarem um evento adverso serão excluídos da participação no estudo.

Se um sujeito desejar se retirar do estudo, todos os esforços serão feitos para completar e relatar as observações da forma mais completa possível até a data da retirada. Será solicitado aos participantes que considerem fornecer mais informações sobre o(s) motivo(s) da retirada. Qualquer informação relatada será registrada.

Duração prevista da participação de cada sujeito Espera-se que cada sujeito compareça a nove visitas no total durante um período de 12 meses; uma visita de triagem, uma visita de tratamento para receber tratamento cirúrgico da área designada, quatro revisões de acompanhamento e três visitas adicionais para reavaliação clínica e radiográfica e coleta de amostras (saliva total, fluido crevicular gengival (GCF), placa subgengival).

Calibração e randomização dos investigadores Os pacientes serão selecionados para elegibilidade por um examinador e serão inscritos um de cada vez de forma contínua após a obtenção de um número de código. Um colaborador do estudo não envolvido na coleta de dados realizará a randomização e anunciará a modalidade de tratamento ao terapeuta por meio de comunicação telefônica. As avaliações clínicas serão realizadas por um único examinador que não terá acesso a gravações anteriores e não está envolvido em outros procedimentos clínicos. Um exercício de calibração do investigador será realizado para obter reprodutibilidade intra-examinador aceitável para PPD, CAL e avaliação da anatomia do defeito. A reprodutibilidade intra-examinador será avaliada pelo Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC) e pelos limites de concordância de 95% de Bland-Altman (Bland e Altman, 1999).

Análise estatística dos dados experimentais A análise será realizada no software IBM Statistics SPSS 20.0. Os dados serão expressos como média +/- desvio padrão (DP). Desequilíbrios entre os grupos teste e controle gerados pelos procedimentos de randomização serão avaliados por meio do teste t de amostras independentes para variáveis ​​contínuas e do teste Exato de Fisher ou do Qui-quadrado para variáveis ​​categóricas. A significância dos efeitos do tratamento sobre as variáveis ​​dependentes alterações de CAL, alterações de PPD e alterações radiográficas será estimada pela construção de modelos lineares mistos usando o procedimento SPSS MIXED. Para todas as análises a significância estatística será fixada em p<0,05.

Considerações éticas / Autorizações para culturas de células-tronco Biohellenika, Thessaloniki, Grécia oferece instalações e laboratórios de última geração que operam sob os regulamentos mais rígidos para processamento e armazenamento de células-tronco. Os laboratórios são licenciados de acordo com a ordem do governo 26/24-3-2008 (regulamento da lei grega de acordo com a lei europeia 2004/23/K de e Conselho 31-3-2004 para o estabelecimento de protótipos de qualidade e segurança para a doação, o compra, os controles de qualidade da criopreservação, armazenamento e distribuição de tecidos e células humanas (EEL 102/7-4-2004) e as diretrizes relacionadas 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) e 2006/86EK (EEL 294 /25-10-2006). A licença F 6172/17514/1269 está publicada no Gov. paper 2589 31/12/2009.

Desde novembro de 2014, a Biohellenika opera sob a nova lei 3984, publicada no documento Gov nº 150 de 2011, após recomendação positiva do Comitê Nacional de Transplantes ao Departamento de Saúde e no momento em que a nova licença está prestes a ser publicada no documento Gov.

Os laboratórios e os procedimentos são acreditados pela Associação Americana de Bancos de Sangue (AABB), última inspeção em 30 de setembro de 2014 e pelo Sistema Nacional de Acreditação de acordo com a norma ISO 15189:2007. Também os laboratórios são certificados segundo a ISO 9001:2008, para processamento, controle de qualidade e criopreservação de linhagens celulares autólogas e ISO 13485:2003 para o sistema de criopreservação que também é uma patente internacional da Biohellenika.

As salas limpas operam de acordo com as diretrizes do BSR Ingenieur-Buro com ISO 14644-5. Os níveis de segurança cumprem todas as normas ISO 27001 e a empresa está licenciada e regulamentada pela Autoridade de Proteção de Dados.

Os laboratórios são monitorados 24 horas para a qualidade do ar e equipados com sistema de banco de dados Cryo-View, sistema de código de barras ISBT 128, temperatura - nível de líquido N2, alarmes de segurança e dois geradores de energia.

Cronograma do estudo Desenho clínico e intervenções para transplante autólogo de BM-MSCs Indivíduos com periodontite crônica grave serão agendados para receber tratamento periodontal não cirúrgico sob anestesia local usando instrumentos manuais e elétricos, além de motivação no cuidado periodontal e instruções completas de higiene oral . Os indivíduos serão reavaliados clinicamente seis semanas após a conclusão do tratamento não cirúrgico e aqueles indivíduos com bolsas periodontais remanescentes (PPD & CAL ≥ 6mm; componente infraósseo ≥ 3mm) e sem sinais evidentes de inflamação gengival serão avaliados quanto à adequação para participar do estudo atual. A visita de triagem incluirá um exame periodontal inicial de toda a boca, exame radiográfico intra-oral e cumprimento dos critérios de inclusão/exclusão. Em caso de adequação, a natureza do estudo será explicada detalhadamente a todos os sujeitos e um termo de consentimento assinado e aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia, AUTh. será obtido de cada participante. Em seguida, os pacientes serão alocados aleatoriamente em um dos três grupos de tratamento (-A, -B e -C). Um único defeito será tratado em cada paciente.

Posteriormente, uma biópsia óssea e amostras de sangue serão coletadas dos participantes do Grupo A em condições rigorosas de esterilidade. Cada amostra será imediatamente colocada em tubos estéreis e transportada para Biohellenika, Thessaloniki, Grécia (http://www.biohellenika.gr) para isolamento e expansão de células-tronco de acordo com um protocolo estrito (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou et al. em preparação). Como as MSCs serão isoladas e expandidas in vitro em salas limpas de classe GLP, atendendo às diretrizes de qualidade definidas pela União Européia e nenhum reagente derivado de animal será usado ao longo dos experimentos para transplante autólogo, as células são consideradas seguras para aplicações de terapia celular clínica humana . Nas instalações da Biohellenika, 60ml de sangue venoso serão coletados de cada indivíduo do Grupo A logo após a coleta da biópsia, para que o soro autólogo seja usado para o isolamento e expansão da cultura das células-tronco autólogas. Além disso, cola de fibrina autóloga será usada para carregar os BM-MSCs no velo de colágeno. Além disso, uma amostra de sangue de 20ml será coletada dos indivíduos do Grupo B, a fim de fornecer cola de fibrina que enriquecerá o velo de colágeno antes da colocação cirúrgica no defeito ósseo. Finalmente, os indivíduos do Grupo C não serão chamados para sangria, pois os defeitos infraósseos nesses indivíduos serão tratados cirurgicamente por meio de desbridamento de retalho aberto sem o uso adjuvante de materiais de enxerto.

Como parte do controle de qualidade GLP, as MSCs serão analisadas quanto à esterilidade e endotoxinas e também serão testadas quanto à potencial contaminação por bactérias (BD BACTEC™), micoplasma e endotoxinas (teste LAL).

Anestesia local (1,8ml de lidocaína a 2% com epinefrina 1:80.000; Lignospan especial, Septodont) será infiltrada nas faces vestibular e lingual dos dentes envolvidos evitando as papilas. Em seguida, serão realizadas incisões estritamente intra-sulculares para preservar os tecidos gengivais e, em particular, a papila interdentária associada ao defeito ósseo-dentário (Cortellini, 2012; Cortellini e Tonetti 2007). O defeito será desbridado e a raiz será cuidadosamente aplainada com o uso combinado de curetas Gracey e instrumentos elétricos (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Suíça). Cuidados serão tomados para reter a parede de tecido mole dos defeitos e o defeito ósseo será irrigado com solução salina para controlar o sangramento.

No Grupo A, o material de enxerto (BM-MSCs enriquecidos com cola de fibrina) será entregue em duas seringas de insulina cada uma contendo 5x10E6 células/100μl de fibrina e será suavemente carregada no velo de colágeno e polimerizada com a adição de CaCl2. Posteriormente, o biocomplexo será cuidadosamente acondicionado no defeito até o preenchimento completo. O manuseio do andaime é feito com cuidado para evitar qualquer destruição de células viáveis.

No Grupo B, a lã de colágeno enriquecida com cola de fibrina desprovida de células viáveis ​​preencherá o defeito ósseo vertical com cautela. Nos Grupos -A e -B a entrega da cola de fibrina com/sem células viáveis ​​será idêntica, de forma que o terapeuta não saiba os procedimentos.

Grupo C, os pacientes receberão desbridamento de retalho aberto e alisamento radicular da superfície radicular de maneira semelhante aos indivíduos dos Grupos -A e -B, mas não haverá uso adjuvante de materiais de enxertia.

O operador ficará cego para a modalidade de tratamento (Grupos -A e -B), enquanto no Grupo C, como não serão usados ​​materiais de enxerto, a modalidade de tratamento ficará óbvia para o operador, mas isso ocorrerá no final da cirurgia , após a coleta de dados clínicos. Técnicas de preservação de papila e técnicas cirúrgicas minimamente invasivas serão buscadas em todos os grupos, evitando marcar o periósteo. Os retalhos serão reposicionados e suturados usando uma única sutura de colchão interna modificada (5-0 Monosyn, Braun) na área interdental associada ao defeito e suturas semelhantes serão empregadas para fechar os retalhos em quaisquer outras áreas interdentais. Duas semanas após a cirurgia, a observação clínica para cicatrização sem intercorrências ou presença de reação tecidual adversa será realizada, seguida da remoção da sutura.

Série de casos para engenharia de tecidos Em uma série de casos (cinco) com inclusão/critérios semelhantes aos anteriores, mas sem passar pela randomização, a engenharia de tecidos é aplicada seguindo a mesma metodologia do Grupo A. Nesses casos, a construção de engenharia de tecidos (biocomplexo) é aplicado para tratar defeitos periodontais interdentais isolados usando uma técnica cirúrgica recém-projetada, a chamada "técnica cirúrgica fechada". Em resumo, esta técnica envolve a retração de retalhos gengivais de forma fechada sem dissecar os tecidos moles ou a papila interdental. Essa técnica minimiza o trauma tecidual, o desconforto pós-operatório e melhora a estética dos tecidos moles.

Cuidados pós-operatórios A dor pós-operatória será controlada com Ibuprofeno (600mg) ao final do procedimento cirúrgico e 12h depois se houver dor. Amoxicilina (500mg / 8 horas por cinco dias) será prescrita a todos os participantes. Todos os pacientes serão instruídos a usar clorexidina 0,12% duas vezes ao dia e evitar escovar os dentes, usar fio dental e mastigar com força na área tratada por quatro semanas. Durante esse período de 4 semanas, um rigoroso programa de suporte pós-operatório será instituído em intervalos quinzenais e, depois disso, os pacientes interromperão o enxágue com solução de clorexidina e retomarão a higiene oral. A limpeza interdental começará seis semanas após a cirurgia para todos os grupos. A partir daí, os indivíduos serão vistos aos três, seis e 12 meses para cuidados periodontais de suporte.

Registros clínicos Registros periodontais de toda a boca e locais específicos, incluindo BOP; Índice de Placa (presença/ausência de placa); PPD e CAL serão determinados usando uma sonda periodontal manual (Hu-Friedy XP-23/QW) para o milímetro mais próximo em seis locais por dente e paralelo ao longo eixo em quatro pontos de tempo; linha de base, 6-, 9-, 12 meses. Medições clínicas nos locais designados (defeitos infraósseos) serão determinadas antes da cirurgia e antes da anestesia (linha de base). As avaliações intra-cirúrgicas serão realizadas uma vez durante a cirurgia.

Avaliações clínicas intra-cirúrgicas A morfologia do defeito (uma, duas, três paredes ou combinação) será determinada intra-cirurgicamente pelo número de paredes ósseas associadas à lesão; A distância entre a junção amelocementária e o fundo do defeito (CEJ-BD) será determinada em mm; A distância da JCE ao nível interproximal mais coronal da crista óssea (JCE-BC) será determinada em mm; A profundidade total do defeito: a distância entre a crista óssea e o fundo do defeito (BC-BD) será determinada em mm; A largura da largura do defeito (distância horizontal entre a crista óssea e a superfície da raiz) será determinada em mm.

Se a JAC não for detectável devido a uma restauração cervical, a margem da restauração (RM) servirá como ponto de referência para medições clínicas e radiográficas.

Avaliação radiográfica A radiografia digital intraoral será utilizada para determinar a regeneração óssea dos defeitos infraósseos em seis momentos; linha de base, 6 semanas, 3, 6, 9, 12 meses. Radiografias digitais periapicais padronizadas (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, França) serão obtidas usando a técnica de paralelismo de cone longo. Para padronizar a geometria de exposição, um bloco de mordida personalizado de um material de impressão elástico será ajustado no suporte do sensor, armazenado em recipientes plásticos selados à temperatura ambiente e será reutilizado durante cada consulta radiográfica de retorno.

De forma semelhante à avaliação intra-cirúrgica, os seguintes marcos anatômicos serão definidos nas radiografias: a junção amelocementária (CEJ), o nível mais coronal do osso alveolar (BC) e a extensão apical da perda óssea ( BD). Mais detalhadamente, será identificada a localização do CEJ; a área mais coronal onde o ligamento periodontal retém uma largura uniforme será identificada na radiografia para indicar a extensão mais apical da perda óssea. O defeito infraósseo será calculado medindo-se a largura do defeito no aspecto mais coronal e na base; a distância entre CEJ-BD e BC-BD; a distância entre CEJ-BC; o ângulo entre o eixo vertical da raiz e a parede óssea interdentária (Tonetti et al. 1993). A avaliação radiográfica da regeneração óssea será definida em um monitor de alta definição pelo mesmo examinador calibrado que não conhece a modalidade de tratamento e não tem acesso às gravações anteriores. As avaliações serão realizadas utilizando a ferramenta de medição para medições numéricas (software VixWin™ Platinum|Gendex) tendo como referência uma barra de metal de comprimento padrão (5mm) que será fixada no sensor.

Coleta de amostras As amostras serão coletadas na seguinte ordem em seis pontos no tempo; linha de base, 6 semanas, 3, 6, 9, 12 meses.

(i) Saliva A saliva será coletada antes das medições periodontais clínicas ou qualquer intervenção periodontal e geralmente na manhã seguinte a um jejum noturno durante o qual os indivíduos são solicitados a não beber (exceto água) ou mascar chiclete. Amostras de saliva total serão obtidas por expectoração em tubos de polipropileno de 30ml por 5 minutos.

(ii) GCF Amostras de fluido crevicular gengival serão obtidas das faces interdentais vestibulares dos defeitos. Antes da coleta do GCF, as superfícies serão suavemente secas ao ar e isoladas da saliva, colocando rolos de algodão e usando um ejetor de saliva. Em seguida, a placa supragengival será cuidadosamente removida com curetas estéreis e tiras de papel (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, EUA) serão colocadas na bolsa periodontal até sentir resistência leve por 30s. Cuidados serão tomados para evitar traumas mecânicos ao colocar as tiras e as tiras contaminadas com sangue serão descartadas. Cada tira por paciente será armazenada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado e armazenada a -70°C. Antes do uso, as proteínas nas tiras serão eluídas em 500µl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com BSA (1% v/v).

(iii) Placa Após a coleta do GCF, a placa subgengival será coletada do local designado. A área de amostragem será isolada da saliva, suavemente seca com ar e, após garantir que não haja depósitos de placa supragengival, dois pontos de papel serão colocados por 30 segundos na bolsa periodontal e uma amostra agrupada será coletada. Todas as amostras serão armazenadas em tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a -80°C antes do processamento. Pontas de papel serão utilizadas para coleta de placa microbiana a fim de evitar perturbações mecânicas dos tecidos periodontais.

Gerenciamento de dados Os investigadores devem garantir que o anonimato do sujeito seja mantido. Em qualquer documentação relacionada ao estudo, os indivíduos devem ser identificados apenas por suas iniciais, sexo e/ou número do indivíduo. Informações pessoais (ou seja, cartões médicos) serão mantidos em um local seguro e separado, longe de outros dados específicos do estudo, com acesso restrito apenas ao investigador principal.

Processo de consentimento informado É responsabilidade do investigador principal obter o consentimento por escrito do sujeito. O formulário de consentimento informado consistirá em dois documentos separados; um Formulário de Informações do Indivíduo e um Formulário de Assinatura de Consentimento Informado do Indivíduo; ambos os documentos serão aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia, AUTh antes do estudo. O formulário de informações do sujeito fornecerá uma explicação adequada, em linguagem não técnica nativa que seja compreensível para o sujeito, das metas, objetivos, métodos, benefícios antecipados e riscos potenciais do estudo. O investigador principal deve então fornecer tempo suficiente para que o sujeito leia e entenda o formulário de consentimento informado e considere a participação na investigação clínica. O investigador principal e o sujeito devem assinar e datar o formulário antes que o sujeito possa participar da investigação clínica. Cada indivíduo receberá uma cópia de seu formulário de consentimento informado devidamente assinado e datado e qualquer outra informação por escrito.