自体牙槽骨骨髓间充质干细胞修复骨下牙周缺损 (PerioRegen)

目的与目标本研究描述了一种使用自体 BM-MSCs 在牙周骨缺损中再生牙周组织的新方法，不含动物源性试剂，在洁净室设施中生产，富含自体纤维蛋白胶，并接种到市售胶原蛋白支架（胶原羊毛）中).

主要目标 本研究旨在评估使用 BM-MSCs/纤维蛋白胶/胶原蛋白羊毛的生物复合物对牙周骨下缺损进行新型再生治疗的疗效，与无细胞移植替代品纤维蛋白胶/胶原蛋白羊毛相比，以及不辅助使用移植材料的开放皮瓣清创的控制治疗方法。

次要目标

• 记录增强治疗结果的稳定性，并继续评估 BM-MSCs 移植与研究期间开放皮瓣清创术对照治疗相比的安全性和有效性。
• 确定参与者在整个研究期间的免疫学和微生物学概况，以试图了解 BM-MSCs 移植在慢性疾病部位（如牙周缺损）中的局部和全身影响。 此外，将在整个观察期间（基线至 12 个月）确定对治疗的愈合反应。

学习规划

研究产品 aBM-MSCs 培养物将从属于 A 组的每位患者的牙槽骨骨髓的骨活组织检查中建立。简而言之，在用 0.12% 洗必泰彻底漱口 1 分钟后，将使用环钻进行截骨术在牙槽骨中进行，将收获 2x8 毫米的骨核。 该区域将用生理盐水冲洗，然后缝合皮瓣以在供体部位实现一期闭合。 然后将骨样本立即放入含有 HBSS 和抗生素/抗真菌剂的无菌试管中，并运送到符合良好实验室规范 (GLP) 的授权设施，这些设施符合欧盟为制备临床级骨干制定的质量指南用于交付给患者的细胞培养物。 如前所述 (Bakopoulou 2013)，将使用酶解法进行 aBM-MSC 分离。 对于培养扩增，将从每个受试者收集的 60ml 静脉血中获得的自体血清用于补充 aMEM 细胞培养基，以避免使用任何动物来源的试剂，例如牛血清。 将立即处理骨活组织检查，以确保已建立的培养物具有高活力。 扩增两代后（大约需要 16-24 天的时间，具体取决于细胞供体），将收获细胞以输送给患者。 对于细胞解离和传代，将使用高度纯化、GMP 兼容的重组酶（Tryple，Thermo Fisher Scientific）以避免使用猪胰蛋白酶。 在此阶段，B 组需要 20 毫升静脉血样本来制备自体纤维蛋白胶，因为 A 组初始放血（60 毫升）将满足细胞培养和纤维蛋白胶制备的需要。 随后，在临床应用之前，将纤维蛋白胶与（A 组）或不与（B 组）干细胞一起装载到市售的胶原羊毛支架中。

临床应用前已建立的 BM-MSC 培养物的质量控制

在交付给患者之前，将对所有 BM-MSC 培养物进行以下评估：

• 使用台盼蓝排除的可行性
• 无菌性：将对培养物进行细菌、支原体和内毒素的潜在污染测试（LAL 测试）
• “干性”特性基于国际细胞治疗学会 (ISCT) 制定的关于 MSC 的最低标准（Dominici 等人 2006）。

注意：我们的研究小组（Bakopoulou 等人，2013 年）在之前的出版物中分析描述了干细胞表征方法的方法论。

将 BM-MSCs/纤维蛋白胶/CaCl2 混合物应用到胶原支架后，将使用手术剪分离随机选择的病例的一小部分生物复合物样本，并将转移到实验室进一步（与临床应用平行） ) 仿生微环境中干细胞行为的体外表征。 这将允许干细胞行为与临床结果之间的相关性，因为出于伦理原因直接从宿主检索和分析再生组织是不可行的。

自体纤维蛋白胶的制备 从A组和B组患者的肘前窝采集20ml静脉血，立即将血样转移至含有抗凝剂的falcon管中。 确定血小板计数后，血液样本将被离心（2000rpm，10 分钟），血浆将被分离并储存在另一只猎鹰中。 然后确定血小板计数，并再次离心样本。 然后将 PRP（含 1,000,000 plts/ul 的富血小板血浆）与上清液 PPP（贫血小板血浆）分离，两种制剂将按照纤维蛋白胶制备标准方案（Biohellenika，塞萨洛尼基，希腊）进一步处理。

临床研究的设计

受试者预选 受试者将从预防牙科、牙周病学和种植生物学系的新推荐人中招募；不会进行外部广告或招聘。 受试者的总体健康状况良好。

进入研究 在进入研究之前，主要研究者将以口头和书面形式（受试者信息表）和书面知情同意书（受试者知情同意书签名表）告知每个受试者该研究的性质和风险。获得。 每个受试者都会得到一份他们正式签署的同意书的副本，以供他们自己记录。 根据方案中设定的纳入和排除标准，将记录受试者的个人人口统计学和病史以及研究适合性。 受试者可以继续使用排除标准中未包括的任何药物；但是，这些药物应与未预先排除的任何并发医疗状况一起记录在案。

受试者退出或中止的程序任何受试者，如果出于个人或任何其他原因希望退出研究，都有权这样做。 然而，任何受试者退出研究的原因以及该原因是否与测试产品有关都将由主要研究者记录。 任何未能参加两次以上的参与者都将被从研究中移除。 经历不良事件的受试者将被排除在进一步参与研究之外。

如果受试者希望退出研究，将尽一切努力尽可能完整地完成和报告观察结果，直至退出之日。 将要求受试者考虑提供有关退出原因的进一步信息。 报告的任何信息都将被记录下来。

每个受试者参与的预期持续时间 每个受试者预计在 12 个月内总共参加 9 次访问；一次筛查访视、一次接受指定区域手术治疗的治疗访视、四次随访审查和三次临床和影像学重新评估和样本采集（全唾液、龈沟液 (GCF)、龈下菌斑）的额外就诊。

调查员的校准和随机化 患者将由一名检查员筛选是否符合条件，并在获得代码后连续不断地一次登记一名患者。 不参与数据收集的试验贡献者将执行随机化并通过电话通信向治疗师宣布治疗方式。 临床评估将由一名检查员执行，该检查员无法访问以前的记录，也不会以其他方式参与其他临床程序。 将进行研究者校准练习，以获得可接受的检查员内部 PPD、CAL 和缺陷解剖评估的再现性。 检查员内部的再现性将通过组内相关系数 (ICC) 和 Bland-Altman 95% 一致限度进行评估（Bland 和 Altman，1999）。

实验数据的统计分析将使用IBM Statistics SPSS 20.0软件进行分析。 数据将表示为平均值 +/- 标准偏差 (SD)。 随机化程序产生的测试组和对照组之间的不平衡将使用连续变量的独立样本 t 检验和分类变量的 Fisher 精确检验或卡方检验进行评估。 治疗效果对因变量 CAL 变化、PPD 变化和射线照相变化的显着性将通过使用 SPSS MIXED 程序构建线性混合模型来估计。 对于所有分析，统计显着性将设置为 p<0.05。

干细胞培养的伦理考虑/授权 希腊塞萨洛尼基的 Biohellenika 提供最先进的设施和实验室，这些设施和实验室在干细胞处理和储存的最严格规定下运作。 这些实验室根据政府命令 26/24-3-2008（希腊法律根据欧洲法律 2004/23/K 和理事会 31-3-2004 建立捐赠质量和安全原型的规定）获得许可，采购、质量控制人体组织和细胞的冷冻保存、储存和分配（EEL 102/7-4-2004）及相关指南2006/17 EK（EEL 38/9/2006）和2006/86EK（EEL 294 /25-10-2006）。 许可证 F 6172/17514/1269 发布在政府文件 2589 31/12/2009 中。

自 2014 年 11 月以来，Biohellenika 根据新法律 3984 运营，该法律在国家移植委员会向卫生部积极推荐后发表在 2011 年第 150 号政府文件中，目前新许可证即将在政府文件中公布。

实验室和程序已获得美国血库协会 (AABB) 的认可，上次检查时间为 2014 年 9 月 30 日，并根据 ISO 15189:2007 获得了国家认可体系的认可。 此外，实验室还通过了 ISO 9001:2008 认证，用于自体细胞谱系的加工、质量控制和冷冻保存，以及冷冻保存系统的 ISO 13485:2003，这也是 Biohellenika 的国际专利。

无尘室根据 BSR Ingenieur-Buro 与 ISO 14644-5 的指南运行。 安全级别符合 ISO 27001 的所有标准，公司获得数据保护局的许可和监管。

实验室 24 小时接受空气质量调查，并配备 Cryo-View 数据库系统、ISBT 128 条形码系统、温度-液氮水平、安全警报和两台发电机。

研究时间表 BM-MSCs 自体移植的临床设计和干预 患有严重慢性牙周炎的受试者将被安排在局部麻醉下使用手动和电动仪器接受非手术牙周治疗，此外还有牙周护理的动机和彻底的口腔卫生指导. 受试者将在非手术治疗完成六周后接受临床重新评估，那些剩余牙周袋（PPD 和 CAL ≥ 6 毫米；骨下成分 ≥ 3 毫米）且没有明显牙龈炎症迹象的受试者将被筛选是否适合参加目前的研究。 筛查访视将包括初始全口牙周检查、口腔内 X 线检查和满足纳入/排除标准。 如果合适，将向所有受试者详细解释研究的性质，并签署经牙科学院伦理委员会批准的同意书。 将从每个参与者那里获得。 然后，患者将被随机分配到三个治疗组（-A、-B 和-C）之一。 每个患者都会治疗一个缺陷。

随后，将在严格无菌条件下从 A 组参与者中采集骨活检和血液样本。 然后将每个样本立即放入无菌试管中，并根据严格的规程（Bakopoulou 等人，2013 年，Bakopoulou等人在准备中）。 由于 MSC 将在符合欧盟制定的质量指南的 GLP 级洁净室中进行体外分离和扩增，并且在整个自体移植实验过程中不使用任何动物来源的试剂，因此这些细胞被认为可安全用于人类临床细胞治疗应用. 在 Biohellenika 设施中，A 组的每个受试者在活检收获后不久将采集 60 毫升静脉血，以便自体血清用于自体干细胞的分离和培养扩增。 此外，自体纤维蛋白胶将用于将 BM-MSCs 加载到胶原羊毛上。 此外，将从 B 组受试者中采集 20ml 的血样，以提供纤维蛋白胶，在手术植入骨缺损处之前丰富胶原蛋白绒。 最后，C 组的受试者将不会被要求放血，因为这些个体的骨下缺损将通过开放皮瓣清创术进行外科手术处理，而无需辅助使用移植材料。

作为 GLP 质量控制的一部分，将对 MSC 进行无菌和内毒素分析，还将测试细菌 (BD BACTEC™)、支原体和内毒素（LAL 测试）的潜在污染。

局部麻醉（1.8 毫升 2% 利多卡因与 1:80,000 肾上腺素；Lignospan special，Septodont）将浸润在受累牙齿的颊舌侧，避开乳头。 然后，将进行严格的沟内切口以保护牙龈组织，特别是与骨牙缺损相关的牙间乳头 (Cortellini, 2012; Cortellini and Tonetti 2007)。 结合使用 Gracey 刮匙和电动器械（EMS Piezon®, EMS, Nyon, Switzerland），将清创缺损并仔细刨根。 小心保留缺损的软组织壁，用生理盐水冲洗骨缺损以控制出血。

在 A 组中，移植材料（富含纤维蛋白胶的 BM-MSC）将被输送到两个胰岛素注射器中，每个注射器含有 5x10E6 个细胞/100μl 纤维蛋白，然后将被轻轻地加载到胶原蛋白绒上，并通过添加 CaCl2 进行聚合。 随后，生物复合物将被轻轻地填充到缺陷中，直到完全填充。 小心处理支架以避免对活细胞的任何破坏。

在 B 组中，富含不含活细胞的纤维蛋白胶的胶原蛋白绒将谨慎地填充垂直骨缺损。 在 A 组和 B 组中，含有/不含活细胞的纤维蛋白胶的输送将是相同的，因此治疗师对程序不知情。

C 组，患者将以与 A 组和 B 组受试者类似的方式接受开放式皮瓣清创术和根面根面平整术，但不会辅助使用移植材料。

操作者将不知道治疗方式（A 组和 B 组），而在 C 组中，由于不使用移植材料，治疗方式对操作者来说将变得显而易见，但这将在手术结束时进行, 在收集临床数据后。 将在所有组中寻求乳头保留技术和微创手术技术，避免划伤骨膜。 皮瓣将在与缺损相关的牙间区域使用单一改良的内部床垫缝合线（5-0 Monosyn，Braun）重新定位和缝合，并且将使用类似的缝合线来闭合任何其他牙间区域的皮瓣。 手术后将进行两周的临床观察，观察愈合是否顺利或是否存在不良组织反应，然后拆线。

组织工程案例系列 在具有与上述相似的纳入/标准但未经过随机化的一系列案例（五个）中，按照与 A 组相同的方法应用组织工程。在这些案例中，组织工程构建体（生物复合物）是使用新设计的手术技术，即所谓的“闭合手术技术”，应用于治疗孤立的牙间牙周缺损。 简而言之，该技术需要以闭合方式牵开牙龈瓣，而不会切开软组织或牙间乳头。 这种技术最大限度地减少了组织创伤、术后不适并增强了软组织的美感。

术后护理 术后疼痛将在手术结束时用布洛芬 (600mg) 控制，如果疼痛则在 12 小时后使用。 所有参与者都将服用阿莫西林（500 毫克/8 小时，持续 5 天）。 将指导所有患者每天两次使用 0.12% 洗必泰，并避免在治疗区域刷牙、使用牙线和用力咀嚼四个星期。 在这 4 周期间，将每两周实施一次严格的术后支持性计划护理，之后患者将停止使用洗必泰溶液冲洗并恢复口腔卫生。 所有组的牙缝清洁将在手术后六周开始。 此后，受试者将在 3、6 和 12 个月时接受牙周支持治疗。

临床记录 全口和特定部位的牙周记录，包括 BOP；斑块指数（存在/不存在斑块）； PPD 和 CAL 将使用手动牙周探针 (Hu-Friedy XP-23/QW) 在每颗牙齿的六个位置并在四个时间点平行于长轴来确定，精确到毫米；基线、6、9、12 个月。 指定部位的临床测量（骨下缺损）将在手术前和麻醉前（基线）确定。 术中评估将在手术过程中进行一次。

术中临床评估缺损形态（一、二、三壁或组合）将在手术中根据与病变相关的骨壁数量确定；牙骨质-牙釉质交界处与缺损底部 (CEJ-BD) 之间的距离将以毫米为单位确定；从 CEJ 到骨嵴最冠状邻间水平的距离 (CEJ-BC) 将以毫米为单位确定；总缺损深度：骨嵴与缺损底部的距离（BC-BD），单位为mm；缺陷宽度的宽度（骨嵴和牙根表面之间的水平距离）将以毫米为单位确定。

如果由于颈椎修复而无法检测到 CEJ，则修复边缘 (RM) 将作为临床和影像学测量的参考点。

射线照相评估口内数字射线照相将用于确定六个时间点骨下缺损的骨再生；基线、6 周、3、6、9、12 个月。 将使用长锥平行技术获得标准化根尖周数字射线照片（RadioVisioGraphy；Trophy Radiology S.A.，巴黎，法国）。 为了标准化曝光几何形状，将在传感器支架上调整弹性印模材料的定制咬合块，在室温下储存在密封塑料容器中，并将在每次召回射线照相预约期间重复使用。

以与手术内评估类似的方式，将在 X 射线上定义以下解剖学标志：牙骨质牙釉质交界处 (CEJ)、牙槽骨 (BC) 的最冠状水平和骨质流失的根尖范围 (屋宇署）。 更详细地说，将确定 CEJ 的位置；牙周韧带保持均匀宽度的最冠状区域将在射线照片上被识别，以指示骨质流失的最顶端延伸。 骨下缺损将通过测量最冠状面和底部的缺损宽度来计算； CEJ-BD和BC-BD之间的距离； CEJ-BC之间的距离；牙根垂直轴与牙间骨壁之间的角度 (Tonetti et al. 1993)。 骨再生的射线照相评估将由同一位经过校准的检查员在高清监视器上进行定义，该检查员对治疗方式不知情并且无法访问以前的记录。 将使用用于数值测量的测量工具（VixWin™ Platinum|Gendex 软件）参考将连接到传感器上的标准长度 (5mm) 的金属棒进行评估。

标本采集 样品将在六个时间点按以下顺序采集；基线、6 周、3、6、9、12 个月。

(i) 唾液 将在临床牙周测量或任何牙周干预之前收集唾液，并且通常在禁食过夜后的早晨收集唾液，在此期间要求受试者不要喝水（水除外）或嚼口香糖。 整个唾液样品将通过吐入 30ml 聚丙烯管中 5 分钟来获得。

(ii) GCF 牙龈沟液样品将从缺损的颊侧牙缝方面获得。 在收集 GCF 之前，通过放置棉卷和使用唾液喷射器将表面轻轻风干并与唾液隔离。 然后，用无菌刮匙小心去除龈上菌斑，并将纸条（Periopaper，OraFlow Inc.，Smithtown，NY，USA）放入牙周袋中，直到感觉到轻度阻力 30 秒。 放置条带时要小心避免机械损伤，那些被血液污染的条带将被丢弃。 每位患者的每条条带将储存在单独的 1.5ml 微量离心管中，并储存在 -70°C 下。 使用前，试纸条上的蛋白质将被洗脱到 500 微升添加有 BSA（1% v/v）的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。

(iii) 牙菌斑 GCF 收集后，将从指定位置收集龈下牙菌斑。 取样区域将与唾液隔离，轻轻风干，确保不存在龈上菌斑沉积物后，将两个纸点放入牙周袋中 30 秒，收集合并的样本。 在处理之前，所有样品将在 -80°C 下储存在 Eppendorf 管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中。 纸点将用于收集微生物菌斑，以避免牙周组织的机械干扰。

数据管理 调查人员必须确保受试者的匿名性得到维护。 在任何与研究相关的文件中，受试者只能通过姓名首字母、性别和/或受试者编号来识别。 个人信息（即 医疗卡）将保存在一个单独的、安全的位置，远离其他研究特定数据，只有主要研究者才能访问。

知情同意程序 主要研究者有责任获得受试者的书面同意。 知情同意书将由两份单独的文件组成；受试者信息表和受试者知情同意书签名表；这两份文件都将在研究之前得到牙科学院伦理委员会 AUTh 的批准。 受试者信息表将使用受试者可以理解的母语非技术语言，对研究的目的、目标、方法、预期益处和潜在危害提供充分的解释。 然后，主要研究者必须为受试者提供充足的时间来阅读和理解知情同意书并考虑参与临床研究。 在受试者参与临床研究之前，主要研究者和受试者必须在表格上签名并注明日期。 然后将向每个受试者发放一份他们正式签署并注明日期的知情同意书副本和任何其他书面信息。