Autologe mesenchymale Stammzellen des alveolären Knochenmarks zur Rekonstruktion von infraossären parodontalen Defekten (PerioRegen)

Die vorliegende Studie beschreibt eine neuartige Methode zur Regeneration parodontaler Gewebe in parodontalen infraossären Defekten unter Verwendung von autologen BM-MSCs, die frei von tierischen Reagenzien sind, in Reinraumanlagen hergestellt, mit autologem Fibrinkleber angereichert und in kommerziell erhältliche Kollagengerüste (Kollagenvlies) eingesät werden ).

Primäres Ziel Diese Studie zielt darauf ab, die Wirksamkeit einer neuartigen regenerativen Behandlung parodontaler infraossärer Defekte unter Verwendung eines Biokomplexes aus BM-MSCs/Fibrinkleber/Kollagenvlies im Vergleich zu einem zellfreien Transplantatersatz aus Fibrinkleber/Kollagenvlies und zu a Kontrollbehandlungsansatz des offenen Lappen-Debridements ohne zusätzliche Verwendung von Transplantatmaterialien.

Sekundäre Ziele

• Dokumentation der Stabilität des verbesserten Behandlungsergebnisses und weitere Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit der BM-MSCs-Transplantation im Vergleich zur Kontrollbehandlung des offenen Lappen-Debridements während des Studienzeitraums.
• Bestimmen Sie die immunologischen und mikrobiologischen Profile der Teilnehmer während des gesamten Studienzeitraums, um die lokalen und systemischen Auswirkungen der Transplantation von BM-MSCs an chronisch erkrankten Stellen wie dem infraossären Parodontaldefekt zu verstehen. Darüber hinaus wird die Heilungsreaktion auf die Behandlung während des gesamten Beobachtungszeitraums (Ausgangswert bis 12 Monate) bestimmt.

Studiendesign

Prüfprodukte aBM-MSCs-Kulturen werden aus Knochenbiopsien angelegt, die aus dem Knochenmark des Alveolarknochens bei jedem Patienten der Gruppe A stammen. Kurz gesagt, nach einer gründlichen oralen Spülung mit 0,12 % Chlorhexidin für 1 Minute wird eine Osteotomie mit einem Trepanbohrer durchgeführt im Alveolarknochen durchgeführt und ein 2 x 8 mm großer Knochenkern entnommen. Der Bereich wird mit Kochsalzlösung gespült und dann werden Lappen genäht, um einen primären Verschluss an der Entnahmestelle zu erreichen. Die Knochenprobe wird dann sofort in sterile Röhrchen gefüllt, die HBSS und Antibiotika/Antimykotika enthalten, und wird zu einer autorisierten Einrichtung transportiert, die der Guten Laborpraxis (GLP) entspricht und die Qualitätsrichtlinien der Europäischen Union für die Vorbereitung von Stammzellen in klinischer Qualität erfüllt Zellkulturen zur Abgabe an den Patienten. Die aBM-MSC-Isolierung wird unter Verwendung der enzymatischen Dissoziationsmethode durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Bakopoulou 2013). Für die Kulturexpansion wird autologes Serum, das aus 60 ml venösem Blut gewonnen wird, das jedem Probanden entnommen wurde, verwendet, um ein MEM-Zellkulturmedium zu ergänzen, um die Verwendung von Reagenzien tierischen Ursprungs, wie z. B. Rinderserum, zu vermeiden. Die Knochenbiopsie wird sofort verarbeitet, um eine hohe Lebensfähigkeit der etablierten Kulturen sicherzustellen. Nach der Expansion für zwei Passagen (ungefährer Zeitbedarf 16-24 Tage je nach Zellspender) werden die Zellen für die Abgabe an den Patienten geerntet. Für die Zelldissoziation und -passage werden hochgereinigte, GMP-kompatible rekombinante Enzyme (Tryple, Thermo Fisher Scientific) verwendet, um die Verwendung von Schweine-Trypsin zu vermeiden. In diesem Stadium wird eine Probe von 20 ml venösem Blut für die Herstellung des autologen Fibrinklebers in Gruppe B benötigt, da in Gruppe A der anfängliche Aderlass (60 ml) den Bedarf der Zellkulturen und der Fibrinkleberherstellung deckt. Anschließend wird direkt vor der klinischen Anwendung Fibrinkleber mit (Gruppe A) oder ohne (Gruppe B) Stammzellen in ein handelsübliches Kollagenvlies-Scaffold geladen.

Qualitätskontrolle der etablierten BM-MSC-Kulturen vor der klinischen Anwendung

Vor der Abgabe an den Patienten werden alle BM-MSCs-Kulturen auf Folgendes untersucht:

• Lebensfähigkeit unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses
• Sterilität: Kulturen werden auf mögliche Kontamination durch Bakterien, Mykoplasmen und Endotoxine getestet (LAL-Test)
• „Stemness“-Eigenschaften basierend auf den Mindestkriterien, die von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) in Bezug auf MSCs festgelegt wurden (Dominici et al. 2006).

Hinweis: Die Methodik zu Stammzellcharakterisierungsmethoden ist in früheren Veröffentlichungen unserer Forschungsgruppe (Bakopoulou et al. 2013) analytisch beschrieben.

Nach dem Auftragen der BM-MSCs/Fibrinkleber/CaCl2-Mischung in die Kollagengerüste wird eine kleine Probe des Biokomplexes von zufällig ausgewählten Fällen mit einer chirurgischen Schere abgetrennt und zur weiteren (parallel zur klinischen Anwendung) ins Labor überführt ) Ex-vivo-Charakterisierung des Verhaltens von Stammzellen in einer biomimetischen Mikroumgebung. Dies ermöglicht eine Korrelation zwischen dem Verhalten der Stammzellen und dem klinischen Ergebnis, da die Gewinnung und Analyse der regenerierten Gewebe direkt vom Wirt aus ethischen Gründen nicht durchführbar ist.

Herstellung von autologem Fibrinkleber Zwanzig ml venöses Blut werden aus der Antekubitalgrube der Patienten der Gruppen A und B entnommen und die Blutproben werden sofort in ein Falcon-Röhrchen überführt, das ein Antikoagulans enthält. Nach Bestimmung der Thrombozytenzahl wird die Blutprobe zentrifugiert (2000rpm, 10min) und das Plasma abgetrennt und in einem anderen Falken gelagert. Anschließend werden die Thrombozytenzahlen bestimmt und die Probe erneut zentrifugiert. PRP (blutplättchenreiches Plasma mit 1.000.000 plt/ul) wird dann vom Überstand PPP (blutplättchenarmes Plasma) getrennt und beide Präparationen werden nach einem Standardprotokoll für die Fibrinkleberherstellung (Biohellenika, Thessaloniki, Griechenland) weiterverarbeitet.

Design des klinischen Arms der Studie

Vorauswahl der Probanden Die Rekrutierung der Probanden erfolgt durch Neuzuweisungen an der Abteilung für Präventivzahnheilkunde, Parodontologie und Implantatbiologie; Es wird keine externe Werbung oder Rekrutierung durchgeführt. Die Probanden werden sich in einem guten allgemeinen Gesundheitszustand befinden.

Aufnahme in die Studie Vor der Aufnahme in die Studie wird jeder Proband vom Hauptforscher über Art und Risiken der Studie sowohl mündlich als auch schriftlich (Subject Information Form) informiert und es wird eine schriftliche Einverständniserklärung (Subject Informed Consent Signature Form) abgegeben erhalten. Jeder Proband erhält eine Kopie seiner ordnungsgemäß unterzeichneten Einverständniserklärung, die er für seine eigenen Unterlagen aufbewahren kann. Die persönlichen demografischen Daten und die Krankengeschichte der Probanden sowie die Studieneignung gemäß den im Protokoll festgelegten Ein- und Ausschlusskriterien werden aufgezeichnet. Die Probanden können alle Medikamente einnehmen, die nicht in den Ausschlusskriterien enthalten sind; Diese Medikamente sollten jedoch zusammen mit allen gleichzeitigen Erkrankungen, die nicht im Voraus ausgeschlossen wurden, dokumentiert werden.

Verfahren zum Rücktritt oder Abbruch des Studienteilnehmers Jeder Studienteilnehmer, der aus persönlichen oder anderen Gründen von der Studie zurücktreten möchte, ist dazu berechtigt. Der Grund für den Rückzug eines Probanden aus der Studie sowie die Frage, ob der Grund mit dem Testprodukt zusammenhängt, werden jedoch vom Hauptprüfarzt aufgezeichnet. Jeder Teilnehmer, der mehr als zweimal nicht an der Studie teilnimmt, wird aus der Studie ausgeschlossen. Probanden, bei denen ein unerwünschtes Ereignis auftritt, werden von der weiteren Teilnahme an der Studie ausgeschlossen.

Wenn ein Proband von der Studie zurücktreten möchte, werden alle Anstrengungen unternommen, um die Beobachtungen bis zum Datum des Rückzugs so vollständig wie möglich zu vervollständigen und zu melden. Die Probanden werden gebeten, weitere Informationen zu den Gründen für den Widerruf in Erwägung zu ziehen. Alle gemeldeten Informationen werden aufgezeichnet.

Erwartete Dauer der Teilnahme jedes Probanden Es wird erwartet, dass jeder Proband über einen Zeitraum von 12 Monaten insgesamt an neun Besuchen teilnimmt; ein Untersuchungsbesuch, ein Behandlungsbesuch zur chirurgischen Behandlung des bezeichneten Bereichs, vier Nachuntersuchungen und drei zusätzliche Besuche zur klinischen und röntgenologischen Neubeurteilung und Probenentnahme (Vollspeichel, Gingiva-Crevicular-Flüssigkeit (GCF), subgingivale Plaque).

Kalibrierung und Randomisierung der Prüfärzte Die Patienten werden von einem Prüfer auf ihre Eignung geprüft und nach Erhalt einer Codenummer fortlaufend fortlaufend aufgenommen. Ein nicht an der Datenerhebung beteiligter Studienmitarbeiter führt die Randomisierung durch und gibt dem Therapeuten die Behandlungsmodalität telefonisch bekannt. Klinische Bewertungen werden von einem einzigen Untersucher durchgeführt, der keinen Zugang zu früheren Aufzeichnungen hat und nicht anderweitig an anderen klinischen Verfahren beteiligt ist. Es wird eine Prüferkalibrierungsübung durchgeführt, um eine akzeptable Reproduzierbarkeit innerhalb des Untersuchers für PPD, CAL und die Bewertung der Defektanatomie zu erhalten. Die prüferinterne Reproduzierbarkeit wird anhand des Intraklassen-Korrelationskoeffizienten (ICC) und der Bland-Altman-Übereinstimmungsgrenze von 95 % (Bland und Altman, 1999) bewertet.

Statistische Analyse experimenteller Daten Die Analyse wird unter Verwendung der Software IBM Statistics SPSS 20.0 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte +/- Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Ungleichgewichte zwischen den Test- und Kontrollgruppen, die durch die Randomisierungsverfahren erzeugt werden, werden unter Verwendung des t-Tests unabhängiger Stichproben für kontinuierliche Variablen und des exakten Fisher-Tests oder des Chi-Quadrat-Tests für kategoriale Variablen bewertet. Die Signifikanz der Behandlungseffekte auf die abhängigen Variablen CAL-Änderungen, PPD-Änderungen und radiologische Änderungen wird durch die Konstruktion linearer gemischter Modelle unter Verwendung des SPSS MIXED-Verfahrens geschätzt. Für alle Analysen wird die statistische Signifikanz auf p < 0,05 gesetzt.

Ethische Erwägungen / Genehmigungen für Stammzellkulturen Biohellenika, Thessaloniki, Griechenland, bietet hochmoderne Einrichtungen und Labore, die unter den strengsten Vorschriften für die Verarbeitung und Lagerung von Stammzellen betrieben werden. Die Labors sind gemäß der Regierungsverordnung 26/24-3-2008 (Verordnung des griechischen Rechts gemäß dem europäischen Gesetz 2004/23/K vom und Rat 31-3-2004 für die Errichtung von Prototypen von Qualität und Sicherheit für die Spende, die lizenziert Einkauf, die Qualitätskontrollen für die Kryokonservierung, Lagerung und den Vertrieb von menschlichen Geweben und Zellen (EEL 102/7-4-2004) und die dazugehörigen Richtlinien 2006/17 EK (EEL 38.9.2006) und 2006/86EK (EEL 294 /25.10.2006). Die Lizenz F 6172/17514/1269 ist im Regierungspapier 2589 vom 31.12.2009 veröffentlicht.

Seit November 2014 arbeitet Biohellenika nach dem neuen Gesetz 3984, veröffentlicht im Gov-Papier Nr. 150, 2011 nach einer positiven Empfehlung des Nationalen Transplantationsausschusses an das Gesundheitsministerium, und im Moment steht die neue Lizenz kurz vor der Veröffentlichung im Gov-Papier.

Die Labore und Verfahren sind von der American Association of Blood Banks (AABB), letzte Inspektion am 30. September 2014, und vom National System of Accreditation nach ISO 15189:2007 akkreditiert. Außerdem sind die Labore nach ISO 9001:2008 für die Verarbeitung, Qualitätskontrolle und Kryokonservierung autologer Zelllinien und ISO 13485:2003 für das Kryokonservierungssystem zertifiziert, das ebenfalls ein internationales Patent von Biohellenika ist.

Reinräume arbeiten nach den Richtlinien des BSR Ingenieur-Büros mit ISO 14644-5. Die Sicherheitsstufen erfüllen alle Standards ISO 27001 und das Unternehmen ist von der Datenschutzbehörde lizenziert und reguliert.

Die Labors werden rund um die Uhr auf Luftqualität überwacht und sind mit einem Cryo-View-Datenbanksystem, einem ISBT 128-Barcodesystem, einem Temperatur-Flüssig-N2-Pegel, Sicherheitsalarmen und zwei Stromgeneratoren ausgestattet.

Studienplan Klinisches Design und Interventionen für die autologe Transplantation von BM-MSCs Probanden mit schwerer chronischer Parodontitis werden für eine nicht-chirurgische Parodontalbehandlung unter örtlicher Betäubung mit hand- und kraftbetriebenen Instrumenten geplant, zusätzlich zur Motivation in der Parodontalpflege und gründlichen Anweisungen zur Mundhygiene . Die Probanden werden sechs Wochen nach Abschluss der nicht-chirurgischen Behandlung erneut klinisch untersucht, und die Probanden mit verbleibenden parodontalen Taschen (PPD & CAL ≥ 6 mm; infraossäre Komponente ≥ 3 mm) und ohne offensichtliche Anzeichen einer Zahnfleischentzündung werden auf ihre Eignung zur Teilnahme am untersucht aktuelle Studie. Der Screening-Besuch umfasst eine anfängliche parodontale Vollmunduntersuchung, eine intraorale Röntgenuntersuchung und die Erfüllung der Einschluss-/Ausschlusskriterien. Bei Eignung wird allen Probanden die Art der Studie ausführlich erläutert und eine von der Ethikkommission der Dental School, AUTh. genehmigte unterschriebene Einverständniserklärung vorgelegt. erhalten Sie von jedem Teilnehmer. Dann werden die Patienten nach dem Zufallsprinzip einer der drei Behandlungsgruppen (-A, -B und -C) zugeteilt. Bei jedem Patienten wird ein einzelner Defekt behandelt.

Anschließend werden den Teilnehmern der Gruppe A unter streng sterilen Bedingungen eine Knochenbiopsie und Blutproben entnommen. Jede Probe wird dann sofort in sterile Röhrchen gefüllt und nach Biohellenika, Thessaloniki, Griechenland (http://www.biohellenika.gr) zur Isolierung und Expansion von Stammzellen gemäß einem strengen Protokoll transportiert (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou et al. in Vorbereitung). Da MSCs in Reinräumen der GLP-Klasse, die den Qualitätsrichtlinien der Europäischen Union entsprechen, in vitro isoliert und expandiert werden und während der Experimente zur autologen Transplantation keine Reagenzien tierischen Ursprungs verwendet werden, gelten die Zellen als sicher für Anwendungen in der klinischen Zelltherapie beim Menschen . In den Biohellenika-Einrichtungen werden jedem Probanden in Gruppe A kurz nach der Biopsieentnahme 60 ml venöses Blut entnommen, so dass autologes Serum für die Isolierung und Kulturexpansion der autologen Stammzellen verwendet wird. Zusätzlich wird autologer Fibrinkleber verwendet, um die BM-MSCs auf das Kollagenvlies zu laden. Darüber hinaus wird den Probanden in Gruppe B eine Blutprobe von 20 ml entnommen, um Fibrinkleber bereitzustellen, der das Kollagenvlies vor der chirurgischen Platzierung im Knochendefekt anreichert. Schließlich werden Probanden in Gruppe C nicht zum Aderlass gerufen, da die infraossären Defekte bei diesen Personen chirurgisch durch Debridement mit offener Klappe ohne zusätzliche Verwendung von Transplantatmaterialien behandelt werden.

Im Rahmen der GLP-Qualitätskontrolle werden die MSCs auf Sterilität und Endotoxine sowie auf mögliche Kontamination durch Bakterien (BD BACTEC™), Mykoplasmen und Endotoxine (LAL-Test) untersucht.

Lokalanästhesie (1,8 ml 2%iges Lidocain mit 1:80.000 Epinephrin; Lignospan Spezial, Septodont) wird in die bukkalen und lingualen Seiten der betroffenen Zähne infiltriert, wobei die Papillen vermieden werden. Dann werden streng intrasulkuläre Schnitte durchgeführt, um das Zahnfleischgewebe und insbesondere die Interdentalpapille, die mit dem Knochenzahndefekt verbunden ist, zu erhalten (Cortellini, 2012; Cortellini und Tonetti 2007). Mit dem kombinierten Einsatz von Gracey-Küretten und motorbetriebenen Instrumenten (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Schweiz) wird der Defekt debridiert und die Wurzel sorgfältig planiert. Es wird darauf geachtet, die Weichgewebewand der Defekte zu erhalten, und der Knochendefekt wird mit Kochsalzlösung gespült, um die Blutung zu kontrollieren.

In Gruppe A wird das Transplantatmaterial (BM-MSCs angereichert mit Fibrinkleber) in zwei Insulinspritzen mit je 5x10E6 Zellen/100μl Fibrin geliefert und schonend auf das Kollagenvlies geladen und unter Zugabe von CaCl2 polymerisiert. Anschließend wird der Biokomplex vorsichtig bis zur vollständigen Füllung in den Defekt gepackt. Die Handhabung des Gerüsts erfolgt mit Sorgfalt, um eine Zerstörung lebensfähiger Zellen zu vermeiden.

In Gruppe B füllt das mit Fibrinkleber angereicherte Kollagenvlies ohne lebensfähige Zellen den vertikalen Knochendefekt vorsichtig aus. In den Gruppen -A und -B ist die Abgabe von Fibrinkleber mit/ohne lebensfähigen Zellen identisch, so dass der Therapeut gegenüber den Verfahren blind ist.

Gruppe C, Patienten erhalten ein Debridement mit offenem Lappen und eine Wurzelglättung der Wurzeloberfläche auf ähnliche Weise wie die Probanden in den Gruppen -A und -B, aber es wird keine zusätzliche Verwendung von Transplantatmaterialien geben.

Der Operateur ist gegenüber der Behandlungsmodalität blind (Gruppen -A und -B), während in Gruppe C, da keine Transplantationsmaterialien verwendet werden, die Behandlungsmodalität für den Operateur offensichtlich wird, dies jedoch gegen Ende der Operation erfolgt , nach der Erhebung klinischer Daten. Techniken zur Papillenerhaltung und minimal-invasive Operationstechniken werden in allen Gruppen gesucht, wobei eine Verletzung des Periosts vermieden wird. Die Lappen werden neu positioniert und unter Verwendung einer einzigen modifizierten inneren Matratzennaht (5-0 Monosyn, Braun) im defektassoziierten interdentalen Bereich vernäht, und ähnliche Nähte werden verwendet, um die Lappen in allen anderen interdentalen Bereichen zu schließen. Zwei Wochen nach der Operation wird eine klinische Beobachtung auf komplikationslose Heilung oder das Vorhandensein unerwünschter Gewebereaktionen durchgeführt, gefolgt von der Nahtentfernung.

Fallserie für Gewebezüchtung In einer Reihe von Fällen (fünf) mit ähnlichen Einschlusskriterien/Kriterien wie oben, aber ohne Randomisierung, wird Gewebezüchtung nach der gleichen Methodik wie in Gruppe A angewendet. In diesen Fällen ist das Gewebezüchtungskonstrukt (Biokomplex). zur Behandlung isolierter interdentaler parodontaler Defekte mit einer neu konzipierten Operationstechnik, der sogenannten "geschlossenen Operationstechnik", angewendet. Kurz gesagt beinhaltet diese Technik das Zurückziehen von Zahnfleischlappen in geschlossener Weise, ohne das Weichgewebe oder die interdentale Papille zu präparieren. Diese Technik minimiert Gewebetrauma, postoperative Beschwerden und verbessert die Ästhetik des Weichgewebes.

Postoperative Versorgung Postoperative Schmerzen werden mit Ibuprofen (600 mg) am Ende des chirurgischen Eingriffs und 12 Stunden später bei Schmerzen kontrolliert. Amoxicillin (500 mg / 8 Stunden für fünf Tage) wird allen Teilnehmern verschrieben. Alle Patienten werden angewiesen, zweimal täglich 0,12 % Chlorhexidin zu verwenden und vier Wochen lang auf Bürsten, Zahnseide und hartes Kauen im behandelten Bereich zu verzichten. Während dieses 4-wöchigen Zeitraums wird in zweiwöchentlichen Abständen ein strenges postoperatives Unterstützungsprogramm eingeleitet, und danach werden die Patienten das Spülen mit Chlorhexidinlösung einstellen und die Mundhygiene wieder aufnehmen. Die Reinigung der Zahnzwischenräume beginnt für alle Gruppen sechs Wochen nach der Operation. Danach werden die Probanden nach drei, sechs und 12 Monaten zur parodontalen unterstützenden Behandlung gesehen.

Klinische Aufzeichnungen Vollständige und ortsspezifische parodontale Aufzeichnungen einschließlich BOP; Plaque-Index (Vorhandensein/Fehlen von Plaque); PPD und CAL werden unter Verwendung einer manuellen Parodontalsonde (Hu-Friedy XP-23/QW) millimetergenau an sechs Stellen pro Zahn und parallel zur Längsachse zu vier Zeitpunkten bestimmt; Baseline, 6-, 9-, 12-Monate. Klinische Messungen an den vorgesehenen Stellen (infraossäre Defekte) werden vor der Operation und vor der Anästhesie (Baseline) bestimmt. Einmal während der Operation werden intraoperative Untersuchungen durchgeführt.

Intraoperative klinische Beurteilungen Die Defektmorphologie (ein-, zwei-, dreiwandig oder eine Kombination) wird intraoperativ durch die Anzahl der mit der Läsion verbundenen Knochenwände bestimmt; Der Abstand zwischen der Schmelz-Zement-Grenze und dem Defektgrund (CEJ-BD) wird in mm bestimmt; Der Abstand vom CEJ zum koronalsten interproximalen Niveau des Knochenkamms (CEJ-BC) wird in mm bestimmt; Die Gesamtdefekttiefe: Der Abstand zwischen dem Knochenkamm und dem Grund des Defekts (BC-BD) wird in mm bestimmt; Die Breite der Defektbreite (horizontaler Abstand zwischen Knochenkamm und Wurzeloberfläche) wird in mm bestimmt.

Wenn die CEJ aufgrund einer zervikalen Restauration nicht nachweisbar ist, dient der Restaurationsrand (RM) als Referenzpunkt für klinische und röntgenologische Messungen.

Röntgenuntersuchung Die intraorale digitale Radiographie wird verwendet, um die Knochenregeneration der infraossären Defekte zu sechs Zeitpunkten zu bestimmen; Baseline, 6 Wochen, 3, 6, 9, 12 Monate. Standardisierte periapikale digitale Röntgenaufnahmen (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paris, Frankreich) werden unter Verwendung der Langkegel-Paralleltechnik erhalten. Um die Aufnahmegeometrie zu standardisieren, wird ein individueller Aufbiss aus einem elastischen Abformmaterial auf dem Sensorhalter angepasst, in verschlossenen Kunststoffbehältern bei Raumtemperatur gelagert und bei jedem Röntgenkontrolltermin wiederverwendet.

Ähnlich wie bei der intraoperativen Beurteilung werden die folgenden anatomischen Orientierungspunkte auf den Röntgenbildern definiert: die Schmelz-Zement-Grenze (CEJ), die koronalste Ebene des Alveolarknochens (BC) und das apikale Ausmaß des Knochenverlusts ( BD). Genauer gesagt wird der Standort des CEJ identifiziert; Der koronalste Bereich, in dem das Parodontalband eine gleichmäßige Breite behält, wird auf dem Röntgenbild identifiziert, um die apikalste Ausdehnung des Knochenverlusts anzuzeigen. Der infraossäre Defekt wird berechnet, indem die Breite des Defekts an der koronalsten Seite und an der Basis gemessen wird; die Entfernung zwischen CEJ-BD und BC-BD; die Entfernung zwischen CEJ-BC; der Winkel zwischen der vertikalen Wurzelachse und der interdentalen Knochenwand (Tonetti et al. 1993). Die radiologische Bewertung der Knochenregeneration wird auf einem hochauflösenden Monitor von demselben kalibrierten Untersucher definiert, der für die Behandlungsmodalität verblindet ist und keinen Zugriff auf frühere Aufzeichnungen hat. Die Bewertungen werden mit dem Messwerkzeug für numerische Messungen (VixWin™ Platinum|Gendex-Software) unter Bezugnahme auf einen Metallstab mit Standardlänge (5 mm) durchgeführt, der am Sensor befestigt wird.

Sammlung von Proben Proben werden in der folgenden Reihenfolge zu sechs Zeitpunkten gesammelt; Baseline, 6 Wochen, 3, 6, 9, 12 Monate.

(i) Speichel Speichel wird vor klinischen Parodontalmessungen oder einem parodontalen Eingriff gesammelt und im Allgemeinen am Morgen nach einer nächtlichen Fastenzeit, während der die Probanden aufgefordert werden, nicht zu trinken (außer Wasser) oder Kaugummi zu kauen. Vollständige Speichelproben werden durch 5-minütiges Aushusten in 30-ml-Polypropylenröhrchen gewonnen.

(ii) GCF Gingiva-Crevicular-Flüssigkeitsproben werden von den bukkalen interdentalen Aspekten der Defekte entnommen. Vor der GCF-Sammlung werden die Oberflächen vorsichtig luftgetrocknet und durch Auflegen von Watterollen und Verwendung eines Speichelziehers vom Speichel isoliert. Dann wird die supragingivale Plaque vorsichtig mit sterilen Küretten entfernt und Papierstreifen (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) werden in die parodontale Tasche gelegt, bis für 30 Sekunden ein leichter Widerstand zu spüren ist. Beim Anbringen der Streifen wird darauf geachtet, mechanische Verletzungen zu vermeiden, und mit Blut kontaminierte Streifen werden entsorgt. Jeder Streifen pro Patient wird in einem separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahrt und bei -70 °C gelagert. Vor der Verwendung werden die Proteine ​​auf den Streifen in 500 &mgr;l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit BSA (1 % v/v), eluiert.

(iii) Plaque Nach der GCF-Entnahme wird subgingivale Plaque an der dafür vorgesehenen Stelle entnommen. Der Probenbereich wird vom Speichel isoliert, vorsichtig mit Luft getrocknet und nachdem sichergestellt wurde, dass keine supragingivalen Plaqueablagerungen vorhanden sind, werden zwei Papierspitzen für 30 Sekunden in die Parodontaltasche gelegt und eine gepoolte Probe entnommen. Alle Proben werden vor der Verarbeitung in Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei -80 °C gelagert. Papierspitzen werden zum Sammeln von mikrobieller Plaque verwendet, um eine mechanische Störung des parodontalen Gewebes zu vermeiden.

Datenmanagement Die Untersucher müssen sicherstellen, dass die Anonymität des Probanden gewahrt bleibt. Auf allen studienbezogenen Unterlagen sollten die Probanden nur anhand ihrer Initialen, ihres Geschlechts und/oder ihrer Probandennummer identifizierbar sein. Personenbezogene Daten (d.h. Gesundheitskarten) werden an einem separaten, sicheren Ort aufbewahrt, getrennt von anderen studienspezifischen Daten mit eingeschränktem Zugang nur für den Hauptforscher.

Prozess der informierten Zustimmung Es liegt in der Verantwortung des Hauptforschers, eine schriftliche Zustimmung des Probanden einzuholen. Das Einwilligungsformular besteht aus zwei separaten Dokumenten; ein Patienteninformationsformular und ein Unterzeichnungsformular für die informierte Zustimmung des Patienten; Beide Dokumente werden vor der Studie von der Ethikkommission der Dental School, AUTh, genehmigt. Das Informationsformular zum Studienteilnehmer enthält eine angemessene Erläuterung der Ziele, Ziele, Methoden, des erwarteten Nutzens und der potenziellen Gefahren der Studie in einer für den Studienteilnehmer verständlichen muttersprachlichen, nicht-technischen Sprache. Der Hauptprüfer muss dem Probanden dann ausreichend Zeit geben, die Einwilligungserklärung zu lesen und zu verstehen und die Teilnahme an der klinischen Prüfung in Betracht zu ziehen. Der Hauptprüfer und der Proband müssen das Formular unterschreiben und datieren, bevor der Proband an der klinischen Prüfung teilnehmen kann. Jeder Proband erhält dann eine Kopie seiner ordnungsgemäß unterzeichneten und datierten Einverständniserklärung und aller anderen schriftlichen Informationen.