Autologe alveolaire beenmerg mesenchymale stamcellen voor de reconstructie van infrabony parodontale defecten (PerioRegen)

Doelen en doelstellingen De huidige studie beschrijft een nieuwe methode voor het regenereren van parodontale weefsels in parodontale infraboniedefecten met behulp van autologe BM-MSC's, vrij van van dieren afgeleide reagentia, geproduceerd in cleanroomfaciliteiten verrijkt met autologe fibrinelijm en gezaaid in in de handel verkrijgbare collageensteigers (collageenvlies ).

Primaire doelstelling Deze studie heeft tot doel de werkzaamheid te beoordelen van een nieuwe regeneratieve behandeling van parodontale botdefecten met behulp van een biocomplex van BM-MSC's/fibrinelijm/collageenvlies, in vergelijking met een celvrij transplantaatsubstituut van fibrinelijm/collageenvlies en een controlebehandelingsbenadering van debridement met open flap zonder aanvullend gebruik van transplantatiematerialen.

Secundaire doelstellingen

• Om de stabiliteit van het verbeterde behandelingsresultaat te documenteren en om de veiligheid en effectiviteit van BM-MSC-transplantatie te blijven beoordelen in vergelijking met de controlebehandeling van debridement met open flap gedurende de onderzoeksperiode.
• Bepaal de immunologische en microbiologische profielen van de deelnemers gedurende de onderzoeksperiode in een poging om de lokale en systemische effecten van de transplantatie van BM-MSC's op chronisch zieke plaatsen, zoals het infrabony parodontaal defect, te begrijpen. Bovendien zal de genezingsreactie op de behandeling worden bepaald gedurende de hele observatieperiode (baseline tot 12 maanden).

Ontwerp ontwerpen

Onderzoeksproducten aBM-MSCs-culturen zullen worden vastgesteld uit botbiopten afkomstig van beenmerg van het alveolaire bot bij elke patiënt die tot groep A behoort. In het kort, na een grondige orale spoeling met chloorhexidine 0,12% gedurende 1 minuut, zal een osteotomie met behulp van een trephineboor worden uitgevoerd. uitgevoerd in het alveolaire bot en een botkern van 2x8 mm zal worden geoogst. Het gebied wordt geïrrigeerd met een zoutoplossing en vervolgens worden flappen gehecht om primaire sluiting op de donorplaats te bereiken. Het botmonster wordt dan onmiddellijk in steriele buisjes met HBSS en antibiotica/antimycotica geplaatst en wordt vervoerd naar een erkende faciliteit die voldoet aan Good Laboratory Practice (GLP) en voldoet aan de kwaliteitsrichtlijnen die zijn opgesteld door de Europese Unie voor de bereiding van stamcellen van klinische kwaliteit. celculturen voor levering aan de patiënt. aBM-MSC-isolatie zal worden uitgevoerd met behulp van de enzymatische dissociatiemethode, zoals eerder beschreven (Bakopoulou 2013). Voor kweekexpansie zal autoloog serum verkregen uit 60 ml veneus bloed dat van elke proefpersoon is verzameld, worden gebruikt als aanvulling op een MEM-celkweekmedium, om het gebruik van van dieren afkomstige reagentia, zoals runderserum, te vermijden. De botbiopsie zal onmiddellijk worden verwerkt om een ​​hoge levensvatbaarheid van de gevestigde culturen te garanderen. Na expansie gedurende twee passages (ongeveer 16-24 dagen nodig, afhankelijk van de celdonor) zullen de cellen worden geoogst voor levering aan de patiënt. Voor celdissociatie en -passage zullen sterk gezuiverde, GMP-compatibele recombinante enzymen (Tryple, Thermo Fisher Scientific) worden gebruikt om het gebruik van varkenstrypsine te vermijden. In dit stadium is een monster van 20 ml veneus bloed nodig voor de bereiding van de autologe fibrinelijm in groep B, aangezien in groep A de eerste aderlating (60 ml) de behoeften van de celculturen en de bereiding van fibrinelijm zal dekken. Vervolgens wordt fibrinelijm met (groep A) of zonder (groep B) stamcellen geladen in een in de handel verkrijgbare collageenvliessteiger direct voor klinische toepassing.

Kwaliteitscontrole van de gevestigde BM-MSC-culturen vóór klinische toepassing

Vóór levering aan de patiënt worden alle BM-MSC-culturen beoordeeld op:

• Levensvatbaarheid met behulp van Trypan Blue-uitsluiting
• Steriliteit: culturen worden getest op mogelijke besmetting met bacteriën, mycoplasma en endotoxinen (LAL-test)
• "Stemness"-eigenschappen gebaseerd op de minimale criteria opgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) met betrekking tot MSC's (Dominici et al 2006).

Opmerking: Methodologie voor karakteriseringsmethoden voor stamcellen is analytisch beschreven in eerdere publicaties door onze onderzoeksgroep (Bakopoulou et al. 2013).

Na het aanbrengen van het mengsel van BM-MSC's/fibrinelijm/CaCl2 in de collageensteigers, zal een klein monster van het biocomplex van willekeurig geselecteerde gevallen worden gescheiden met behulp van een chirurgische schaar en naar het laboratorium worden overgebracht voor verdere (parallel aan de klinische toepassing). ) ex vivo karakterisering van stamcelgedrag in een biomimetische micro-omgeving. Dit maakt een correlatie mogelijk tussen het gedrag van stamcellen en de klinische uitkomst, aangezien het ophalen en analyseren van de geregenereerde weefsels rechtstreeks van de gastheer om ethische redenen niet haalbaar is.

Bereiding van autologe fibrinelijm Twintig ml veneus bloed zal worden verzameld uit de ante-cubitale fossa van patiënten in groep A en B en bloedmonsters zullen onmiddellijk worden overgebracht naar een falcon-buis, die anticoagulans bevat. Na bepaling van het aantal bloedplaatjes wordt het bloedmonster gecentrifugeerd (2000 rpm, 10 min) en plasma wordt afgescheiden en opgeslagen in een andere valk. Vervolgens wordt het aantal bloedplaatjes bepaald en wordt het monster opnieuw gecentrifugeerd. PRP (bloedplaatjesrijk plasma met 1.000.000 plts/ul) zal vervolgens worden gescheiden van het supernatant PPP (bloedplaatjesarm plasma) en beide preparaten zullen verder worden verwerkt volgens een standaardprotocol voor fibrinelijmbereiding (Biohellenika, Thessaloniki, Griekenland).

Ontwerp van de klinische tak van de studie

Proefpersonenvoorselectie Proefpersonen worden geworven uit nieuwe verwijzingen op de afdeling Preventieve Tandheelkunde, Parodontologie en Implantaatbiologie; er zal geen externe reclame of werving plaatsvinden. Onderwerpen zullen in goede algemene gezondheid verkeren.

Toelating tot het onderzoek Vóór toelating tot het onderzoek wordt elke proefpersoon door de hoofdonderzoeker geïnformeerd over de aard en de risico's van het onderzoek, zowel mondeling als schriftelijk (informatieformulier voor proefpersonen) en wordt schriftelijke geïnformeerde toestemming (ondertekeningsformulier voor geïnformeerde toestemming) gegeven. verkregen. Elke proefpersoon krijgt een kopie van het naar behoren ondertekende toestemmingsformulier om te bewaren voor hun eigen administratie. De persoonlijke demografische gegevens en medische geschiedenis van de proefpersonen en de studiegeschiktheid in overeenstemming met de in- en uitsluitingscriteria die in het protocol zijn vastgelegd, worden geregistreerd. Proefpersonen mogen alle medicijnen voortzetten die niet in de uitsluitingscriteria zijn opgenomen; deze medicijnen moeten echter worden gedocumenteerd samen met eventuele gelijktijdige medische aandoeningen die niet vooraf zijn uitgesloten.

Procedures voor terugtrekking of stopzetting van proefpersonen Elke proefpersoon die zich om persoonlijke of andere redenen uit het onderzoek wil terugtrekken, heeft het recht om dit te doen. De reden voor het terugtrekken van een proefpersoon uit het onderzoek, naast de vraag of de reden verband houdt met het testproduct, wordt echter door de hoofdonderzoeker vastgelegd. Elke deelnemer die meer dan twee keer niet aanwezig is, wordt uit het onderzoek verwijderd. Proefpersonen die een bijwerking ervaren, worden uitgesloten van verdere deelname aan het onderzoek.

Als een proefpersoon zich uit het onderzoek wil terugtrekken, zal alles in het werk worden gesteld om de waarnemingen zo volledig mogelijk te voltooien en te rapporteren tot aan de datum van terugtrekking. Proefpersonen zullen worden gevraagd om te overwegen om meer informatie te geven over de reden(en) voor de intrekking. Alle gerapporteerde informatie wordt geregistreerd.

Verwachte duur van de deelname van elke proefpersoon Van elke proefpersoon wordt verwacht dat hij in totaal negen bezoeken bijwoont gedurende een periode van 12 maanden; één screeningsbezoek, één behandelingsbezoek voor chirurgische behandeling van het aangewezen gebied, vier follow-upbeoordelingen en drie extra bezoeken voor klinische en radiografische herbeoordeling en monsterafname (volledig speeksel, gingivale creviculaire vloeistof (GCF), subgingivale plaque).

Kalibratie en randomisatie door onderzoekers Patiënten worden gescreend op geschiktheid door één examinator en worden één voor één op doorlopende basis ingeschreven na het verkrijgen van een codenummer. Een proefmedewerker die niet betrokken is bij het verzamelen van gegevens, voert de randomisatie uit en maakt de behandelingsmodaliteit telefonisch bekend aan de therapeut. Klinische beoordelingen worden uitgevoerd door één onderzoeker die geen toegang heeft tot eerdere opnames en niet anderszins betrokken is bij andere klinische procedures. Er zal een kalibratieoefening voor de onderzoeker worden uitgevoerd om aanvaardbare intra-onderzoekersreproduceerbaarheid te verkrijgen voor PPD, CAL en evaluatie van defecte anatomie. De reproduceerbaarheid binnen de onderzoeker zal worden beoordeeld aan de hand van de Intraclass Correlation Coefficient (ICC) en Bland-Altman 95%-limieten van overeenstemming (Bland en Altman, 1999).

Statistische analyse van experimentele gegevens De analyse wordt uitgevoerd met behulp van de IBM Statistics SPSS 20.0-software. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden +/- standaarddeviatie (SD). Onevenwichtigheden tussen de test- en controlegroepen die worden gegenereerd door de randomisatieprocedures zullen worden beoordeeld met behulp van de t-toets voor onafhankelijke steekproeven voor continue variabelen en de Fisher's Exact-toets of de Chi-Square-toets voor categorische variabelen. De significantie van de behandelingseffecten op de afhankelijke variabelen CAL-veranderingen, PPD-veranderingen en radiografische veranderingen zal worden geschat door lineaire gemengde modellen te construeren met behulp van de SPSS MIXED-procedure. Voor alle analyses wordt de statistische significantie gesteld op p<0,05.

Ethische overwegingen / Autorisaties voor stamcelculturen Biohellenika, Thessaloniki, Griekenland biedt ultramoderne faciliteiten en laboratoria die werken onder de strengste regelgeving voor de verwerking en opslag van stamcellen. De laboratoria hebben een vergunning volgens het besluit van de regering van 26/24-3-2008 (verordening van de Griekse wet volgens de Europese wet 2004/23/K van en de Raad van 31-3-2004 voor het opzetten van prototypen van kwaliteit en veiligheid voor de donatie, de aankoop controleert de kwaliteit de cryopreservatie, opslag en distributie van menselijke weefsels en cellen (EEL 102/7-4-2004) en de gerelateerde richtlijnen 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) en 2006/86EK (EEL 294 /25-10-2006). De vergunning F 6172/17514/1269 is gepubliceerd in Staatspapier 2589 31/12/2009.

Sinds november 2014 opereert Biohellenika onder de nieuwe wet 3984, gepubliceerd in regeringsdocument nr. 150, 2011 na een positieve aanbeveling van het nationale transplantatiecomité aan het ministerie van Volksgezondheid en op het moment dat de nieuwe licentie op het punt staat te worden gepubliceerd in het regeringsdocument.

De laboratoria en de procedures zijn geaccrediteerd door de American Association of Blood Banks (AABB), laatste inspectie 30 september 2014 en door het National System of Accreditation volgens ISO 15189:2007. Ook zijn de laboratoria gecertificeerd volgens ISO 9001:2008, voor verwerking, kwaliteitscontrole en cryopreservatie van autologe cellijnen en ISO 13485:2003 voor het cryopreservatiesysteem dat ook een internationaal patent is van Biohellenika.

Cleanrooms werken volgens de richtlijnen van BSR Ingenieur-Buro met ISO 14644-5. De beveiligingsniveaus voldoen aan alle normen ISO 27001 en het bedrijf heeft een vergunning en wordt gereguleerd door de Gegevensbeschermingsautoriteit.

De laboratoria worden 24 uur per dag gecontroleerd op luchtkwaliteit en zijn uitgerust met een Cryo-View-databasesysteem, een ISBT 128-barcoderingssysteem, temperatuur-vloeistofniveau N2, beveiligingsalarmen en twee stroomgeneratoren.

Studieschema Klinische opzet en interventies voor autologe transplantatie van BM-MSC's Proefpersonen met ernstige chronische parodontitis zullen worden ingepland voor niet-chirurgische parodontale behandeling onder plaatselijke verdoving met behulp van hand- en elektrisch aangedreven instrumenten, naast motivatie in parodontale zorg en grondige instructies voor mondhygiëne . Proefpersonen zullen zes weken na voltooiing van de niet-chirurgische behandeling opnieuw klinisch worden beoordeeld en proefpersonen met resterende parodontale pockets (PPD & CAL ≥ 6 mm; infrabony component ≥ 3 mm) en geen duidelijke tekenen van tandvleesontsteking zullen worden gescreend op geschiktheid om deel te nemen aan de huidige studie. Het screeningsbezoek omvat een eerste parodontaal onderzoek van de volledige mond, intra-oraal radiografisch onderzoek en het voldoen aan de inclusie-/exclusiecriteria. In geval van geschiktheid zal de aard van het onderzoek in detail worden uitgelegd aan alle proefpersonen en zal een ondertekend toestemmingsformulier worden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Tandheelkundige School, AUTh. krijgt u van elke deelnemer. Vervolgens worden patiënten willekeurig toegewezen aan een van de drie behandelingsgroepen (-A, -B en -C). Bij elke patiënt wordt één enkel defect behandeld.

Vervolgens wordt onder strikte steriele omstandigheden een botbiopsie en bloedmonsters afgenomen bij de deelnemers van groep A. Elk monster wordt vervolgens onmiddellijk in steriele buisjes geplaatst en getransporteerd naar Biohellenika, Thessaloniki, Griekenland (http://www.biohellenika.gr) voor stamcelisolatie en expansie volgens een strikt protocol (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou et al. in voorbereiding). Aangezien MSC's in vitro zullen worden geïsoleerd en uitgebreid in cleanrooms van GLP-klasse die voldoen aan de kwaliteitsrichtlijnen van de Europese Unie en er geen van dieren afgeleide reagentia zullen worden gebruikt tijdens de experimenten voor autologe transplantatie, worden de cellen als veilig beschouwd voor klinische celtherapietoepassingen bij mensen. . In Biohellenika-faciliteiten zal kort na de biopsieoogst 60 ml veneus bloed worden afgenomen van elke proefpersoon in groep A, zodat autoloog serum wordt gebruikt voor de isolatie en kweekexpansie van de autologe stamcellen. Bovendien zal autologe fibrinelijm worden gebruikt om de BM-MSC's op het collageenvlies te laden. Bovendien zal er een bloedmonster van 20 ml worden afgenomen bij proefpersonen in groep B, om fibrinelijm te leveren die het collageenvlies zal verrijken vóór chirurgische plaatsing in het botdefect. Ten slotte zullen proefpersonen in groep C niet worden opgeroepen voor aderlating, aangezien de botdefecten bij deze personen chirurgisch zullen worden behandeld door debridement met open flap zonder aanvullend gebruik van transplantatiemateriaal.

Als onderdeel van de GLP-kwaliteitscontrole worden de MSC's geanalyseerd op steriliteit en endotoxinen en worden ze ook getest op mogelijke besmetting door bacteriën (BD BACTEC™), mycoplasma en endotoxinen (LAL-test).

Lokale anesthesie (1,8 ml van 2% lidocaïne met 1:80.000 epinefrine; Lignospan speciaal, Septodont) zal worden geïnfiltreerd in de buccale en linguale aspecten van de betrokken tanden waarbij de papillen worden vermeden. Daarna zullen strikt intrasulculaire incisies worden uitgevoerd om de tandvleesweefsels te behouden en in het bijzonder de interdentale papil die verband houdt met het bot-tanddefect (Cortellini, 2012; Cortellini en Tonetti 2007). Het defect wordt gedebrideerd en de wortel wordt zorgvuldig geschaafd met het gecombineerde gebruik van Gracey-curettes en door een motor aangedreven instrumenten (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Zwitserland). Er zal voor worden gezorgd dat de wand van het zachte weefsel van de defecten behouden blijft en het botdefect wordt geïrrigeerd met zoutoplossing om het bloeden onder controle te houden.

In groep A wordt het transplantaatmateriaal (BM-MSC's verrijkt met fibrinelijm) geleverd in twee insulinespuiten die elk 5x10E6-cellen/100μl fibrine bevatten en voorzichtig op het collageenvlies worden geladen en gepolymeriseerd met toevoeging van CaCl2. Vervolgens wordt het biocomplex voorzichtig in het defect gepakt totdat het volledig gevuld is. Het hanteren van de steiger gebeurt met zorg om vernietiging van levensvatbare cellen te voorkomen.

In groep B zal het collageenvlies verrijkt met fibrinelijm zonder levensvatbare cellen het verticale botdefect voorzichtig opvullen. In groep -A en -B zal de afgifte van fibrinelijm met/zonder levensvatbare cellen identiek zijn, zodat de therapeut blind is voor de procedures.

Patiënten in groep C krijgen debridement met open flap en wortelschaafing van het worteloppervlak op dezelfde manier als proefpersonen in groep -A en -B, maar er zal geen aanvullend gebruik van transplantatiematerialen zijn.

De operator zal blind zijn voor de behandelingsmodaliteit (groep -A en -B), terwijl in groep C, aangezien er geen transplantatiemateriaal zal worden gebruikt, de behandelingsmodaliteit duidelijk zal worden voor de operator, maar dit zal plaatsvinden tegen het einde van de operatie , na het verzamelen van klinische gegevens. Papilla-conserveringstechnieken en minimaal invasieve chirurgische technieken zullen in alle groepen worden nagestreefd, waarbij inkerving van het periosteum wordt vermeden. De flappen worden herpositioneerd en gehecht met behulp van een enkele gemodificeerde interne matrashechting (5-0 Monosyn, Braun) in het interdentale gebied dat verband houdt met het defect en soortgelijke hechtingen zullen worden gebruikt om de flappen in andere interdentale gebieden te sluiten. Twee weken na de operatie zal klinische observatie worden uitgevoerd voor een rustige genezing of de aanwezigheid van een ongunstige weefselreactie, gevolgd door verwijdering van de hechting.

Casussenreeks voor weefselmanipulatie In een reeks gevallen (vijf) met vergelijkbare opname/criteria als hierboven, maar zonder randomisatie, wordt weefselmanipulatie toegepast volgens dezelfde methodologie als in groep A. In deze gevallen wordt het weefselmanipulatieconstruct (biocomplex) gebruikt. toegepast om geïsoleerde interdentale parodontale defecten te behandelen met behulp van een nieuw ontworpen chirurgische techniek, de zogenaamde "gesloten chirurgische techniek". Kort gezegd houdt deze techniek in dat de tandvleesflappen op een gesloten manier worden teruggetrokken zonder de zachte weefsels of de interdentale papil te ontleden. Deze techniek minimaliseert weefseltrauma, postoperatief ongemak en verbetert de esthetiek van zacht weefsel.

Postoperatieve zorg Postoperatieve pijn wordt bestreden met ibuprofen (600 mg) aan het einde van de chirurgische ingreep en 12 uur later als er pijn is. Amoxicilline (500 mg / 8 uur gedurende vijf dagen) wordt aan alle deelnemers voorgeschreven. Alle patiënten zullen worden geïnstrueerd om tweemaal daags 0,12% chloorhexidine te gebruiken en gedurende vier weken poetsen, flossen en hard kauwen in het behandelde gebied te vermijden. Gedurende deze periode van 4 weken zal een strikt postoperatief ondersteunend programma worden ingesteld met tussenpozen van twee weken, en daarna zullen de patiënten stoppen met spoelen met chloorhexidine-oplossing en de mondhygiëne hervatten. Interdentale reiniging begint zes weken na de operatie voor alle groepen. Daarna zullen proefpersonen na drie, zes en twaalf maanden worden gezien voor parodontale ondersteunende zorg.

Klinische opnames Full-mouth en plaatsspecifieke parodontale opnames inclusief BOP; Plaque Index (aanwezigheid/afwezigheid van plaque); PPD en CAL worden bepaald met behulp van een handmatige parodontale sonde (Hu-Friedy XP-23/QW) tot op de millimeter nauwkeurig op zes plaatsen per tand en parallel aan de lengteas op vier tijdstippen; basislijn, 6-, 9-, 12 maanden. Klinische metingen op de aangewezen plaatsen (infrabonydefecten) zullen voorafgaand aan de operatie en vóór anesthesie (baseline) worden bepaald. Intra-chirurgische beoordelingen zullen één keer tijdens de operatie worden uitgevoerd.

Intrachirurgische klinische beoordelingen De morfologie van het defect (één-, twee-, driewandig of combinatie) zal intrachirurgisch worden bepaald door het aantal botwanden geassocieerd met de laesie; De afstand tussen de cemento-emailverbinding en de onderkant van het defect (CEJ-BD) wordt bepaald in mm; De afstand van de CEJ tot het meest coronale interproximale niveau van de botkam (CEJ-BC) wordt bepaald in mm; De totale defectdiepte: de afstand tussen de botkam en de onderkant van het defect (BC-BD) wordt bepaald in mm; De breedte van de defectbreedte (horizontale afstand tussen de botkam en het worteloppervlak) wordt bepaald in mm.

Als de CEJ niet detecteerbaar is vanwege een cervicale restauratie, zal de restauratiemarge (RM) dienen als referentiepunt voor klinische en radiografische metingen.

Radiografische evaluatie Intraorale digitale radiografie zal worden gebruikt om de botregeneratie van de botdefecten op zes tijdstippen te bepalen; basislijn, 6 weken, 3-, 6-, 9-, 12-maanden. Gestandaardiseerde periapicale digitale röntgenfoto's (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Parijs, Frankrijk) zullen worden verkregen met behulp van de long-cone parallelling-techniek. Om de belichtingsgeometrie te standaardiseren, wordt een op maat gemaakt bijtstuk van elastisch afdrukmateriaal op de sensorhouder geplaatst, in verzegelde plastic containers bij kamertemperatuur bewaard en hergebruikt tijdens elke radiografische terugroepafspraak.

Op dezelfde manier als bij de intrachirurgische beoordeling, zullen de volgende anatomische oriëntatiepunten op de röntgenfoto's worden gedefinieerd: de cementoenamel junction (CEJ), het meest coronale niveau van het alveolaire bot (BC) en de apicale omvang van botverlies ( BD). Meer in detail zal de locatie van het CEJ worden geïdentificeerd; het meest coronale gebied waar het parodontale ligament een gelijkmatige breedte behoudt, zal op de röntgenfoto worden geïdentificeerd om de meest apicale extensie van botverlies aan te geven. Het infrabony defect wordt berekend door de breedte van het defect te meten aan de meest coronale zijde en aan de basis; de afstand tussen CEJ-BD en BC-BD; de afstand tussen CEJ-BC; de hoek tussen de verticale as van de wortel en de interdentale botwand (Tonetti et al. 1993). Radiografische evaluatie van botregeneratie zal worden gedefinieerd op een high-definition monitor door dezelfde gekalibreerde onderzoeker die blind is voor de behandelingsmodaliteit en geen toegang heeft tot eerdere opnames. Beoordelingen worden uitgevoerd met behulp van het meetinstrument voor numerieke metingen (VixWin™ Platinum|Gendex-software) met verwijzing naar een metalen staaf van standaardlengte (5 mm) die op de sensor wordt bevestigd.

Afname van monsters Monsters worden in de volgende volgorde verzameld op zes tijdstippen; basislijn, 6 weken, 3-, 6-, 9-, 12-maanden.

(i) Speeksel Speeksel zal worden verzameld voorafgaand aan klinische parodontale metingen of enige parodontale interventie en in het algemeen in de ochtend na een nacht vasten waarin proefpersonen wordt verzocht niet te drinken (behalve water) of kauwgom te kauwen. Hele speekselmonsters worden verkregen door gedurende 5 minuten in polypropyleen buisjes van 30 ml te spuwen.

(ii) GCF Gingivale creviculaire vloeistofmonsters zullen worden verkregen uit de buccale interdentale aspecten van de defecten. Voorafgaand aan de GCF-collectie worden de oppervlakken voorzichtig aan de lucht gedroogd en geïsoleerd van speeksel door wattenrollen te plaatsen en een speekselzuiger te gebruiken. Vervolgens wordt supragingivale plaque voorzichtig verwijderd met steriele curettes en papierstrips (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, VS) worden in de parodontale pocket geplaatst totdat gedurende 30 seconden lichte weerstand wordt gevoeld. Er zal voor worden gezorgd dat mechanische trauma's worden voorkomen bij het plaatsen van de strips en de met bloed verontreinigde strips worden weggegooid. Elke strip per patiënt wordt bewaard in een apart microcentrifugebuisje van 1,5 ml en bewaard bij -70°C. Voorafgaand aan gebruik worden de eiwitten op de strips geëlueerd in 500 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met BSA (1% v/v).

(iii) Plaque Na GCF-verzameling zal subgingivale plaque worden verzameld op de aangewezen plaats. Het bemonsteringsgebied wordt geïsoleerd van speeksel, voorzichtig gedroogd met lucht, en nadat er zeker van is dat er geen supragingivale plaque-afzettingen aanwezig zijn, worden er gedurende 30 seconden twee papierpunten in de parodontale pocket geplaatst en wordt een samengevoegd monster verzameld. Alle monsters worden vóór verwerking opgeslagen in Eppendorf-buisjes (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) bij -80°C. Papierpunten zullen worden gebruikt voor het verzamelen van microbiële tandplak om mechanische verstoring van de parodontale weefsels te voorkomen.

Gegevensbeheer De onderzoekers dragen er zorg voor dat de anonimiteit van de proefpersoon gewaarborgd blijft. Op alle studiegerelateerde documentatie mogen proefpersonen alleen identificeerbaar zijn aan de hand van hun initialen, geslacht en/of proefpersoonnummer. Persoonlijke informatie (d.w.z. medische kaarten) worden op een aparte, veilige locatie bewaard, uit de buurt van andere onderzoeksspecifieke gegevens met beperkte toegang tot alleen de hoofdonderzoeker.

Geïnformeerde toestemmingsprocedure Het is de verantwoordelijkheid van de hoofdonderzoeker om schriftelijke toestemming van de proefpersoon te verkrijgen. Het toestemmingsformulier bestaat uit twee afzonderlijke documenten; een informatieformulier voor proefpersonen en een formulier voor ondertekening van geïnformeerde toestemming voor proefpersonen; beide documenten zullen voorafgaand aan het onderzoek worden goedgekeurd door de ethische commissie van de tandheelkundige school, AUTh. Het proefpersooninformatieformulier zal een adequate uitleg geven, in niet-technische taal die de proefpersoon begrijpt, van de doelen, doelstellingen, methoden, verwachte voordelen en potentiële gevaren van het onderzoek. De hoofdonderzoeker moet de proefpersoon vervolgens voldoende tijd geven om het formulier voor geïnformeerde toestemming te lezen en te begrijpen en deelname aan het klinische onderzoek te overwegen. De hoofdonderzoeker en de proefpersoon moeten het formulier zowel ondertekenen als dateren voordat de proefpersoon kan deelnemen aan het klinisch onderzoek. Elke proefpersoon krijgt dan een kopie van zijn naar behoren ondertekende en gedateerde geïnformeerde toestemmingsformulier en alle andere schriftelijke informatie.