Аутологичные мезенхимальные стволовые клетки альвеолярного костного мозга для реконструкции внутрикостных пародонтальных дефектов (PerioRegen)

Цели и задачи Настоящее исследование описывает новый метод регенерации тканей пародонта при внутрикостных дефектах пародонта с использованием аутологичных МСК БМ, не содержащих реагентов животного происхождения, произведенных в чистых помещениях, обогащенных аутологичным фибриновым клеем и засеянных в коммерчески доступные коллагеновые каркасы (коллагеновый флис). ).

Основная цель Это исследование направлено на оценку эффективности нового регенеративного лечения внутрикостных дефектов периодонта с использованием биокомплекса BM-MSC/фибринового клея/коллагенового флиса по сравнению с бесклеточным заменителем фибринового клея/коллагенового флиса и контрольный подход к лечению: открытая санация лоскута без дополнительного использования трансплантационных материалов.

Второстепенные цели

• Задокументировать стабильность улучшенного результата лечения и продолжить оценку безопасности и эффективности трансплантации BM-MSC по сравнению с контрольным лечением открытой хирургической обработки лоскута в течение периода исследования.
• Определите иммунологические и микробиологические профили участников на протяжении всего периода исследования, чтобы попытаться понять местные и системные эффекты трансплантации BM-MSC в хронически больных участках, таких как внутрикостной пародонтальный дефект. Кроме того, ответ на лечение будет определяться на протяжении всего периода наблюдения (от исходного уровня до 12 месяцев).

Дизайн исследования

Продукты исследования Культуры аВМ-МСК будут получены из костных биоптатов, полученных из костного мозга альвеолярной кости, у каждого пациента, принадлежащего к группе А. Вкратце, после тщательного полоскания рта 0,12% хлоргексидином в течение 1 мин будет выполнена остеотомия с использованием трепана. выполняется в альвеолярной кости, и будет взят костный стержень размером 2x8 мм. Область будет орошаться физиологическим раствором, а затем лоскуты будут сшиты для достижения первичного закрытия на донорском участке. Затем образец кости будет немедленно помещен в стерильные пробирки, содержащие HBSS и антибиотики/противомикробные препараты, и будет доставлен в уполномоченное учреждение, соответствующее требованиям надлежащей лабораторной практики (GLP), отвечающее рекомендациям по качеству, установленным Европейским союзом для подготовки стебля клинического качества. клеточные культуры для доставки пациенту. Выделение aBM-MSC будет осуществляться с использованием метода ферментативной диссоциации, как описано ранее (Bakopoulou 2013). Для расширения культуры аутологичная сыворотка, полученная из 60 мл венозной крови, собранной у каждого субъекта, будет использоваться в качестве дополнения к среде для культивирования клеток aMEM, чтобы избежать использования каких-либо реагентов животного происхождения, таких как бычья сыворотка. Костная биопсия будет немедленно обработана, чтобы обеспечить высокую жизнеспособность установленных культур. После размножения в течение двух пассажей (приблизительное время, необходимое для 16-24 дней в зависимости от донора клеток) клетки будут собраны для доставки пациенту. Для диссоциации и пассирования клеток будут использоваться рекомбинантные ферменты высокой степени очистки, совместимые с GMP (Tryple, Thermo Fisher Scientific), чтобы избежать использования свиного трипсина. На этом этапе для приготовления аутологичного фибринового клея в группе B потребуется образец венозной крови объемом 20 мл, так как в группе A первоначальное кровопускание (60 мл) покроет потребности клеточных культур и приготовления фибринового клея. Затем фибриновый клей загружают со стволовыми клетками (группа А) или без стволовых клеток (группа В) в имеющийся в продаже каркас из коллагенового флиса непосредственно перед клиническим применением.

Контроль качества полученных культур КМ-МСК перед клиническим применением

Перед доставкой пациенту все культуры КМ-МСК будут оцениваться на предмет:

• Жизнеспособность с использованием исключения трипанового синего
• Стерильность: культуры будут проверены на потенциальное заражение бактериями, микоплазмой и эндотоксинами (LAL-тест).
• Свойства стволовости основаны на минимальных критериях, установленных Международным обществом клеточной терапии (ISCT) в отношении МСК (Dominici et al 2006).

Примечание. Методология методов характеристики стволовых клеток аналитически описана в предыдущих публикациях нашей исследовательской группы (Bakopoulou et al. 2013).

После нанесения смеси КМ-МСК/фибриновый клей/CaCl2 на коллагеновые каркасы небольшой образец биокомплекса случайно выбранных случаев будет выделен с помощью хирургических ножниц и передан в лабораторию для дальнейшего (параллельно с клиническим применением) ) ex vivo характеристика поведения стволовых клеток в биомиметическом микроокружении. Это позволит установить корреляцию между поведением стволовых клеток и клиническим исходом, поскольку извлечение и анализ регенерированных тканей непосредственно у хозяина невозможно по этическим причинам.

Приготовление аутологичного фибринового клея Двадцать мл венозной крови берут из переднелоктевой ямки у пациентов в группах А и В, и образцы крови немедленно переносят в пробирку Falcon, содержащую антикоагулянт. После определения числа тромбоцитов образец крови будет центрифугирован (2000 об/мин, 10 минут), а плазма будет отделена и сохранена в другом сосуде. Затем будет определено количество тромбоцитов, и образец будет снова центрифугирован. Затем PRP (богатая тромбоцитами плазма, содержащая 1 000 000 пл/мкл) будет отделена от супернатанта PPP (бедная тромбоцитами плазма), и оба препарата будут дополнительно обработаны в соответствии со стандартным протоколом приготовления фибринового клея (Biohellenik, Салоники, Греция).

Дизайн клинической части исследования

Предварительный отбор субъектов. Субъекты будут набраны из числа новых направлений на кафедре профилактической стоматологии, пародонтологии и биологии имплантатов; никакой внешней рекламы или найма не будет. Субъекты будут в хорошем общем состоянии здоровья.

Допуск к участию в исследовании Перед включением в исследование каждый субъект будет проинформирован главным исследователем о характере и рисках исследования как в устной, так и в письменной форме (Форма информации об субъекте), и письменное информированное согласие (Форма подписи информированного согласия субъекта) будет полученный. Каждому субъекту будет предоставлена ​​​​копия должным образом подписанной формы согласия, которую он будет хранить в своих собственных записях. Будут зарегистрированы личные демографические данные субъектов и история болезни, а также пригодность для исследования в соответствии с критериями включения и исключения, установленными в протоколе. Субъекты могут продолжать принимать любые лекарства, не включенные в критерии исключения; тем не менее, эти лекарства должны быть задокументированы вместе с любым сопутствующим заболеванием, не исключенным заранее.

Процедуры выхода или прекращения участия субъекта Любой субъект, желающий выйти из исследования по личным или любым другим причинам, имеет право сделать это. Однако причина исключения любого субъекта из исследования, а также то, связана ли эта причина с тестируемым продуктом, будет зарегистрирована главным исследователем. Любой участник, не явившийся более двух раз, исключается из исследования. Субъекты, у которых возникло нежелательное явление, будут исключены из дальнейшего участия в исследовании.

Если субъект желает выйти из исследования, будут предприняты все усилия, чтобы как можно полнее завершить и сообщить о наблюдениях до даты выхода. Субъектам будет предложено рассмотреть вопрос о предоставлении дополнительной информации о причине (причинах) отказа. Любая сообщаемая информация будет записана.

Ожидаемая продолжительность участия каждого субъекта Ожидается, что каждый субъект посетит в общей сложности девять посещений в течение 12 месяцев; один скрининговый визит, один лечебный визит для проведения хирургического лечения в обозначенной области, четыре контрольных осмотра и три дополнительных визита для повторной клинической и рентгенологической оценки и сбора образцов (цельная слюна, жидкость десневой борозды (GCF), поддесневой зубной налет).

Калибровка исследователей и рандомизация. Пациенты будут проверяться на соответствие требованиям одним экзаменатором и будут включаться по одному на постоянной основе после получения кодового номера. Участник исследования, не участвующий в сборе данных, проведет рандомизацию и объявит метод лечения терапевту по телефону. Клинические оценки будут проводиться одним экспертом, который не будет иметь доступа к предыдущим записям и не будет иным образом участвовать в других клинических процедурах. Будет проведена калибровка исследователя, чтобы получить приемлемую воспроизводимость внутри исследователя для PPD, CAL и оценки анатомии дефекта. Воспроизводимость результатов внутри одного исследователя будет оцениваться с помощью коэффициента внутриклассовой корреляции (ICC) и 95-процентного предела согласия Бланда-Альтмана (Bland and Altman, 1999).

Статистический анализ экспериментальных данных. Анализ будет выполнен с использованием программного обеспечения IBM Statistics SPSS 20.0. Данные будут выражены как среднее +/- стандартное отклонение (SD). Несбалансированность между тестовой и контрольной группами, полученная в результате процедур рандомизации, будет оцениваться с использованием t-критерия независимых выборок для непрерывных переменных и точного критерия Фишера или критерия хи-квадрат для категориальных переменных. Значимость воздействия лечения на зависимые переменные изменения CAL, изменения PPD и рентгенографические изменения будут оцениваться путем построения линейных смешанных моделей с использованием процедуры SPSS MIXED. Для всех анализов статистическая значимость будет установлена ​​на уровне p<0,05.

Этические соображения / Разрешения на использование культур стволовых клеток Компания Biohellenika, Салоники, Греция, располагает современным оборудованием и лабораториями, которые работают в соответствии с самыми строгими правилами обработки и хранения стволовых клеток. Лаборатории лицензированы в соответствии с постановлением правительства 26/24-3-2008 (регламент греческого законодательства в соответствии с европейским законом 2004/23/K и Советом 31-3-2004 для создания прототипов качества и безопасности для донорства, покупка, контроль качества криоконсервации, хранения и распространения тканей и клеток человека (EEL 102/7-4-2004) и соответствующие руководства 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) и 2006/86EK (EEL 294). /25-10-2006). Лицензия F 6172/17514/1269 опубликована в Gov. paper 2589 31/12/2009.

С ноября 2014 года Biohellenika действует в соответствии с новым законом 3984, опубликованным в правительственной газете № 150 в 2011 году после положительной рекомендации Национального комитета по трансплантации Министерству здравоохранения, и в настоящее время новая лицензия готовится к публикации в правительственной газете.

Лаборатории и процедуры аккредитованы Американской ассоциацией банков крови (AABB), последняя проверка 30 сентября 2014 г., и Национальной системой аккредитации в соответствии со стандартом ISO 15189:2007. Кроме того, лаборатории сертифицированы в соответствии с ISO 9001:2008 для обработки, контроля качества и криоконсервации аутологичных клеточных линий и ISO 13485:2003 для системы криоконсервации, которая также является международным патентом Biohellenika.

Чистые помещения работают в соответствии с рекомендациями BSR Ingenieur-Buro с ISO 14644-5. Уровни безопасности соответствуют всем стандартам ISO 27001, а компания лицензирована и регулируется Управлением по защите данных.

Лаборатории круглосуточно проверяются на предмет качества воздуха и оснащены системой базы данных Cryo-View, системой штрих-кодирования ISBT 128, датчиками температуры и уровня жидкого азота, сигнализацией безопасности и двумя генераторами электроэнергии.

График исследования Клинический дизайн и вмешательства для аутологичной трансплантации BM-MSC Субъектам с тяжелым хроническим пародонтитом будет назначено нехирургическое лечение пародонта под местной анестезией с использованием ручных и механических инструментов, в дополнение к мотивации в уходе за пародонтом и тщательным инструкциям по гигиене полости рта. . Субъекты будут клинически повторно оценены через шесть недель после завершения нехирургического лечения, и субъекты с оставшимися пародонтальными карманами (PPD и CAL ≥ 6 мм; внутрикостный компонент ≥ 3 мм) и без явных признаков воспаления десен будут проверены на пригодность для участия в исследовании. текущее исследование. Скрининговый визит будет включать в себя начальное полное обследование пародонта, внутриротовое рентгенографическое исследование и выполнение критериев включения/исключения. В случае пригодности характер исследования будет подробно объяснен всем субъектам и подписанной форме согласия, утвержденной Комитетом по этике Стоматологической школы, AUTh. будет получено от каждого участника. Затем пациенты будут случайным образом распределены в одну из трех групп лечения (-A, -B и -C). У каждого пациента будет лечиться один дефект.

Впоследствии у участников группы А будут взяты костная биопсия и образцы крови в строгих стерильных условиях. Затем каждый образец будет немедленно помещен в стерильные пробирки и доставлен в Biohellenika, Салоники, Греция (http://www.biohellenika.gr) для выделения и размножения стволовых клеток в соответствии со строгим протоколом (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou). и др. в процессе подготовки). Поскольку МСК будут выделять и размножать in vitro в чистых помещениях класса GLP, соответствующих рекомендациям по качеству, установленным Европейским союзом, и в ходе экспериментов по аутологичной трансплантации не будут использоваться реагенты животного происхождения, клетки считаются безопасными для применения в клинической клеточной терапии человека. . В учреждениях Biohellenika 60 мл венозной крови будет взято у каждого субъекта в группе А вскоре после сбора биопсии, чтобы аутологичная сыворотка использовалась для выделения и культивирования аутологичных стволовых клеток. Кроме того, аутологичный фибриновый клей будет использоваться для загрузки BM-MSC на коллагеновый флис. Кроме того, у субъектов группы B будет взят образец крови объемом 20 мл, чтобы получить фибриновый клей, который обогащает коллагеновый слой перед хирургическим размещением в костном дефекте. Наконец, субъекты в группе C не будут вызываться для кровопускания, так как внутрикостные дефекты у этих людей будут устраняться хирургическим путем путем санации открытого лоскута без дополнительного использования материалов для трансплантации.

В рамках контроля качества GLP МСК будут проанализированы на стерильность и эндотоксины, а также будут проверены на потенциальное заражение бактериями (BD BACTEC™), микоплазмой и эндотоксинами (LAL-тест).

Местная анестезия (1,8 мл 2% лидокаина с адреналином 1:80 000; Lignospan special, Septodont) будет введена в щечные и язычные области пораженных зубов, избегая сосочков. Затем будут выполняться строго внутрибороздковые разрезы для сохранения тканей десны и, в частности, межзубного сосочка, связанного с костно-зубным дефектом (Cortellini, 2012; Cortellini and Tonetti 2007). Дефект будет иссечен, а корень тщательно выровнен с помощью комбинированного использования кюрет Gracey и механических инструментов (EMS Piezon®, EMS, Ньон, Швейцария). Будут предприняты меры для сохранения мягких тканей стенки дефекта, а костный дефект будет промыт физиологическим раствором для остановки кровотечения.

В группе A материал для трансплантации (BM-MSC, обогащенный фибриновым клеем) будет доставлен в двух инсулиновых шприцах, каждый из которых содержит 5x10E6 клеток/100 мкл фибрина, и будет осторожно загружен на коллагеновый нетканый материал и полимеризован с добавлением CaCl2. В последующем биокомплекс аккуратно забивается в дефект до полного заполнения. Обращение с каркасом осуществляется с осторожностью, чтобы избежать разрушения жизнеспособных клеток.

В группе B коллагеновый ворс, обогащенный фибриновым клеем, лишенным жизнеспособных клеток, будет с осторожностью заполнять вертикальный костный дефект. В группах -А и -В введение фибринового клея с/без жизнеспособных клеток будет идентичным, так что терапевт не видит процедуры.

В группе C пациенты получат санацию открытым лоскутом и выравнивание поверхности корня так же, как и пациенты в группах -A и -B, но без дополнительного использования трансплантационных материалов.

Оператор не будет знать метод лечения (группы -A и -B), в то время как в группе C, поскольку трансплантационные материалы не будут использоваться, метод лечения станет очевидным для оператора, но это произойдет ближе к завершению операции. , после сбора клинических данных. Методы сохранения сосочка и малоинвазивные хирургические методы будут применяться во всех группах, избегая повреждения надкостницы. Лоскуты будут перемещены и сшиты с использованием одного модифицированного внутреннего матрасного шва (5-0 Monosyn, Braun) в межзубной области, связанной с дефектом, и аналогичные швы будут использоваться для закрытия лоскутов в любых других межзубных областях. Через две недели после операции будет проведено клиническое наблюдение на предмет нормального заживления или наличия побочных реакций со стороны тканей с последующим снятием швов.

Серия случаев тканевой инженерии В серии случаев (пять), имеющих те же критерии включения/критерии, что и выше, но без проведения рандомизации, применяется тканевая инженерия по той же методике, что и в группе А. В этих случаях используется тканевая инженерная конструкция (биокомплекс). применяется для лечения изолированных межзубных дефектов периодонта с использованием недавно разработанной хирургической техники, так называемой «закрытой хирургической техники». Вкратце, этот метод предполагает ретракцию десневых лоскутов закрытым способом без рассечения мягких тканей или межзубных сосочков. Этот метод минимизирует травму тканей, послеоперационный дискомфорт и улучшает эстетику мягких тканей.

Послеоперационный уход. Послеоперационную боль контролируют с помощью ибупрофена (600 мг) в конце хирургической процедуры и через 12 часов, если возникает боль. Всем участникам будет назначен амоксициллин (500 мг/8 часов в течение пяти дней). Все пациенты будут проинструктированы использовать 0,12% хлоргексидин два раза в день и избегать чистки зубов щеткой, зубной нитью и жесткого жевания в обработанной области в течение четырех недель. В течение этого 4-недельного периода будет проводиться строгая послеоперационная поддерживающая программа ухода с интервалом в две недели, после чего пациенты прекратят полоскание раствором хлоргексидина и возобновят гигиену полости рта. Очистка межзубных промежутков начнется через шесть недель после операции для всех групп. После этого субъекты будут осмотрены через три, шесть и 12 месяцев для поддерживающей терапии пародонта.

Клинические записи Записи пародонта всего рта и отдельных участков, включая BOP; Индекс зубного налета (наличие/отсутствие зубного налета); PPD и CAL будут определяться с помощью ручного периодонтального зонда (Hu-Friedy XP-23/QW) с точностью до миллиметра в шести точках на зуб и параллельно длинной оси в четырех временных точках; исходный уровень, 6-, 9-, 12-мес. Клинические измерения в обозначенных местах (внутрикостные дефекты) будут определяться до операции и до анестезии (базовый уровень). Интраоперационные оценки будут проводиться один раз во время операции.

Интраоперационная клиническая оценка Морфология дефекта (одно-, двух-, трехстенная или комбинированная) будет определяться интраоперационно по количеству костных стенок, связанных с поражением; Расстояние между цементно-эмалевой границей и дном дефекта (CEJ-BD) определяют в мм; Расстояние от CEJ до самого коронарного интерпроксимального уровня костного гребня (CEJ-BC) будет определяться в мм; Общая глубина дефекта: расстояние между костным гребнем и дном дефекта (BC-BD) будет определяться в мм; Ширина дефекта (горизонтальное расстояние между гребнем кости и поверхностью корня) будет определяться в мм.

Если CEJ не определяется из-за цервикальной реставрации, граница реставрации (RM) будет служить точкой отсчета для клинических и рентгенографических измерений.

Рентгенологическая оценка Внутриротовая цифровая рентгенография будет использоваться для определения костной регенерации внутрикостных дефектов в шести временных точках; исходный уровень, 6 недель, 3, 6, 9, 12 месяцев. Стандартизированные периапикальные цифровые рентгенограммы (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Париж, Франция) будут получены с использованием техники параллелизма с длинным конусом. Для стандартизации геометрии экспонирования на держателе датчика будет подогнана индивидуальная накусочная пластина из эластичного оттискного материала, которая будет храниться в герметичных пластиковых контейнерах при комнатной температуре и будет повторно использоваться во время каждого повторного визита к рентгенологу.

Так же, как и при интраоперационной оценке, на рентгеновских снимках будут определены следующие анатомические ориентиры: цементно-эмалевая граница (CEJ), самый корональный уровень альвеолярной кости (BC) и апикальная степень потери костной массы ( БД). Более подробно будет указано местонахождение CEJ; самая коронковая область, где периодонтальная связка сохраняет постоянную ширину, будет идентифицирована на рентгенограмме, чтобы указать самое апикальное распространение потери костной массы. Внутрикостной дефект будет рассчитан путем измерения ширины дефекта в самой корональной части и у основания; расстояние между CEJ-BD и BC-BD; расстояние между CEJ-BC; угол между вертикальной осью корня и стенкой межзубной кости (Tonetti et al., 1993). Рентгенографическая оценка регенерации кости будет проводиться на мониторе высокой четкости тем же квалифицированным исследователем, который не знает о методе лечения и не имеет доступа к предыдущим записям. Оценки будут проводиться с использованием измерительного инструмента для числовых измерений (программное обеспечение VixWin™ Platinum|Gendex) со ссылкой на металлический стержень стандартной длины (5 мм), который будет прикреплен к датчику.

Сбор образцов Образцы будут собираться в следующем порядке в шесть временных точек; исходный уровень, 6 недель, 3, 6, 9, 12 месяцев.

(i) Слюна Слюна будет собираться перед клиническими пародонтальными измерениями или любым пародонтальным вмешательством и, как правило, утром после ночного голодания, во время которого субъектов просят не пить (кроме воды) и не жевать резинку. Образцы цельной слюны получают путем отхаркивания в полипропиленовые пробирки объемом 30 мл в течение 5 минут.

(ii) GCF Образцы жидкости десневой борозды будут получены из щечных межзубных поверхностей дефектов. Перед сбором GCF поверхности будут аккуратно высушены воздухом и изолированы от слюны путем размещения ватных валиков и использования слюноотсоса. Затем наддесневой зубной налет осторожно удаляют стерильными кюретками, а бумажные полоски (Periopaper, OraFlow Inc., Смиттаун, штат Нью-Йорк, США) помещают в пародонтальный карман до ощущения легкого сопротивления в течение 30 с. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать механических травм при размещении полосок, а полоски, загрязненные кровью, будут утилизированы. Каждая полоска для каждого пациента будет храниться в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл при температуре -70°C. Перед использованием белки на полосках будут элюированы 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) с добавлением BSA (1% по объему).

(iii) Зубной налет. После сбора GCF будет взят поддесневой зубной налет в указанном месте. Зона отбора будет изолирована от слюны, осторожно высушена воздухом, и после того, как будет проверено отсутствие отложений наддесневого зубного налета, две бумажные штифты будут помещены на 30 с в пародонтальный карман, после чего будет взят объединенный образец. Все образцы будут храниться в пробирках Эппендорф (Эппендорф, Гамбург, Германия) при температуре -80°C перед обработкой. Бумажные штифты будут использоваться для сбора микробного налета во избежание механического повреждения тканей пародонта.

Управление данными Исследователи должны обеспечить сохранение анонимности субъекта. В любой документации, связанной с исследованием, испытуемые должны быть идентифицированы только по их инициалам, полу и/или номеру субъекта. Личная информация (т.е. медицинские карты) будут храниться в отдельном безопасном месте, вдали от других данных, относящихся к конкретному исследованию, с ограниченным доступом только для главного исследователя.

Процесс получения информированного согласия В обязанности главного исследователя входит получение письменного согласия субъекта. Форма информированного согласия будет состоять из двух отдельных документов; форму информации о субъекте и форму подписи информированного согласия субъекта; оба документа будут одобрены Этическим комитетом стоматологической школы AUTh до начала исследования. Форма информации об испытуемом будет содержать адекватное объяснение на родном нетехническом языке, понятном для испытуемого, целей, задач, методов, ожидаемых преимуществ и потенциальных опасностей исследования. Затем главный исследователь должен предоставить субъекту достаточно времени для прочтения и понимания формы информированного согласия и рассмотрения возможности участия в клиническом исследовании. Главный исследователь и субъект должны подписать форму и поставить дату, прежде чем субъект сможет участвовать в клиническом исследовании. Затем каждому субъекту будет выдана копия должным образом подписанной и датированной формы информированного согласия и любая другая письменная информация.