Autológ alveoláris csontvelő mezenchimális őssejtek az infravörös fogágyhibák helyreállítására (PerioRegen)

Célok és célkitűzések A jelen tanulmány egy új módszert ír le a parodontális szövetek regenerálására parodontális infracsont defektusokban autológ BM-MSC-k alkalmazásával, állati eredetű reagensektől mentes, tiszta helyiségekben, autológ fibrin ragasztóval dúsítva és kereskedelmi forgalomban kapható kollagén állványokba (kollagén gyapjúba) oltva. ).

Elsődleges cél A vizsgálat célja a parodontális infracsont defektusok új regeneratív kezelésének hatékonyságának felmérése BM-MSC/fibrin ragasztó/kollagén gyapjú biokomplex alkalmazásával, összehasonlítva a fibrin ragasztó/kollagén gyapjú sejtmentes grafthelyettesítővel és egy a nyitott szárnyú debridement kontroll kezelési megközelítése oltóanyagok kiegészítő használata nélkül.

Másodlagos célok

• Dokumentálni a megnövelt kezelési eredmény stabilitását, és folytatni a BM-MSC-transzplantáció biztonságosságának és hatékonyságának értékelését, összehasonlítva a nyitott lebeny debridement kontroll kezelésével a vizsgálati időszak alatt.
• Határozza meg a résztvevők immunológiai és mikrobiológiai profilját a vizsgálati időszak során annak érdekében, hogy megértse a BM-MSC-k krónikusan megbetegedett helyeken, például az infrabony periodontális defektusban történő transzplantációjának helyi és szisztémás hatásait. Ezenkívül a kezelésre adott gyógyulási választ a megfigyelési időszak alatt (a kiindulási állapottól 12 hónapig) meghatározzák.

Dizájnt tanulni

Vizsgálati termékek Az aBM-MSCs tenyészeteket az alveoláris csont csontvelőjéből származó csontbiopsziákból állítják elő minden A csoportba tartozó betegnél. Röviden, 0,12%-os klórhexidinnel 1 percig tartó alapos szájöblítést követően oszteotómiát végeznek trephine fúróval. alveoláris csontban végezzük és egy 2x8 mm-es csontos magot gyűjtünk be. A területet sóoldattal öntözzük, majd a szárnyakat összevarrjuk, hogy elérjük az elsődleges lezárást a donor helyen. A csontmintát ezután azonnal steril csövekbe helyezik, amelyek HBSS-t és antibiotikumokat/antimikotikumokat tartalmaznak, és a helyes laboratóriumi gyakorlatnak (GLP) megfelelő engedélyezett létesítménybe szállítják, amely megfelel az Európai Unió által a klinikai minőségű szár előkészítésére meghatározott minőségi irányelveknek. sejtkultúrák a beteghez való eljuttatáshoz. Az aBM-MSC izolálást az enzimatikus disszociációs módszerrel végezzük, a korábban leírtak szerint (Bakopoulou 2013). A tenyészet kiterjesztéséhez az egyes alanyoktól gyűjtött 60 ml vénás vérből nyert autológ szérumot használjuk az aMEM sejttenyésztő táptalaj kiegészítésére, hogy elkerüljük az állati eredetű reagensek, például szarvasmarhaszérum használatát. A csontbiopsziát azonnal feldolgozzák, hogy biztosítsák a kialakult tenyészetek magas életképességét. Két passzázs expanzió után (a sejtdonortól függően körülbelül 16-24 nap szükséges idő) a sejteket begyűjtik, hogy a beteghez eljuttassák. A sejtek disszociációjához és passzálásához nagy tisztaságú, GMP-kompatibilis rekombináns enzimeket (Tryple, Thermo Fisher Scientific) használnak, hogy elkerüljék a sertés tripszin használatát. Ebben a szakaszban 20 ml vénás vér mintára lesz szükség a B csoport autológ fibrin ragasztójának elkészítéséhez, mivel az A csoportban a kezdeti vérvétel (60 ml) fedezi a sejttenyészetek és a fibrin ragasztó elkészítésének szükségleteit. Ezt követően a fibrin ragasztót - (A csoport) vagy anélkül (B csoport) őssejtekkel töltik be egy kereskedelmi forgalomban kapható kollagén gyapjú vázba közvetlenül a klinikai alkalmazás előtt.

A kialakult BM-MSC kultúrák minőségellenőrzése a klinikai alkalmazás előtt

A betegnek való szállítás előtt minden BM-MSC tenyészetet értékelni kell a következők szempontjából:

• Életképesség tripánkék kizárással
• Sterilitás: a tenyészeteket megvizsgálják a baktériumok, mikoplazma és endotoxinok esetleges szennyeződése szempontjából (LAL-teszt)
• "Stemness" tulajdonságok az International Society for Cellular Therapy (ISCT) által az MSC-kre vonatkozóan megállapított minimális kritériumokon alapulnak (Dominici et al 2006).

Megjegyzés: Az őssejtjellemző módszerek módszertanát kutatócsoportunk korábbi publikációiban analitikusan ismertették (Bakopoulou et al. 2013).

A BM-MSC/fibrin ragasztó/CaCl2 keveréknek a kollagén állványokba történő felvitele után a véletlenszerűen kiválasztott esetek biokomplexének egy kis mintáját sebészeti ollóval választják el, és továbbítják a laborba (a klinikai alkalmazással párhuzamosan). ) az őssejtek viselkedésének ex vivo jellemzése biomimetikus mikrokörnyezetben. Ez lehetővé teszi az őssejtek viselkedése és a klinikai kimenetel közötti korrelációt, mivel a regenerált szövetek közvetlenül a gazdaszervezetből való előhívása és elemzése etikai okokból nem kivitelezhető.

Autológ fibrin ragasztó készítése Az A és B csoportba tartozó betegek ante-cubitalis üregéből húsz ml vénás vért veszünk, és a vérmintákat azonnal átvisszük egy véralvadásgátlót tartalmazó falcon csőbe. A vérlemezkeszám meghatározása után a vérmintát centrifugálják (2000 ford./perc, 10 perc), a plazmát elválasztják és egy másik sólyomban tárolják. Ezután meghatározzák a vérlemezkeszámot, és a mintát ismét centrifugálják. Ezután a PRP-t (1 000 000 plt/ul thrombocytában gazdag plazmát) elválasztják a felülúszó PPP-től (thrombocyta-szegény plazma), és mindkét készítményt tovább dolgozzák a fibrinragasztó elkészítésére vonatkozó szabványos protokoll szerint (Biohelenika, Thessaloniki, Görögország).

A vizsgálat klinikai ágának kialakítása

A tantárgyak előválogatása A tantárgyakat a Megelőző Fogászati, Parodontológiai és Implantátumbiológiai Klinika új beutalóiból toborozzuk; külső reklámozásra vagy toborzásra nem kerül sor. Az alanyok általános egészségi állapota jó lesz.

Jelentkezés a vizsgálatba A vizsgálatba való felvétel előtt a vezető kutató minden alanyt szóban és írásban is tájékoztat a vizsgálat természetéről és kockázatairól (Tárgyi információs űrlap), valamint írásos beleegyezését (Subject Informed Consent Signature Form). kapott. Minden alany megkapja a megfelelően aláírt beleegyezési űrlap egy példányát, hogy megőrizze saját nyilvántartása számára. Rögzítésre kerül az alanyok személyes demográfiai és kórelőzménye, valamint tanulmányi alkalmassága a jegyzőkönyvben rögzített felvételi és kizárási szempontoknak megfelelően. Az alanyok folytathatnak minden olyan gyógyszert, amely nem szerepel a kizárási kritériumok között; ezeket a gyógyszereket azonban dokumentálni kell minden egyidejű, előre nem kizárt egészségügyi állapottal együtt.

A vizsgálati alany visszavonására vagy abbahagyására vonatkozó eljárások Bármely alany jogosult erre, aki személyes vagy egyéb okból ki akar lépni a vizsgálatból. Mindazonáltal az alany vizsgálatból való kivonásának okát azon túlmenően, hogy az ok a vizsgált termékkel kapcsolatos-e, a vezető kutató rögzíti. Minden olyan résztvevőt, aki kétszer nem jelenik meg, eltávolítják a vizsgálatból. Azok az alanyok, akiknél nemkívánatos esemény jelentkezik, kizárásra kerülnek a vizsgálatban való további részvételből.

Ha egy alany ki kíván lépni a vizsgálatból, minden erőfeszítést meg kell tenni annak érdekében, hogy a kilépés időpontjáig a lehető legpontosabban kiegészítsék és jelentsék a megfigyeléseket. Az alanyokat felkérjük, hogy fontoljanak meg további tájékoztatást a visszavonás okáról. Minden jelentett információt rögzítünk.

Az egyes tantárgyak részvételének várható időtartama Minden alanynak összesen kilenc látogatáson kell részt vennie 12 hónapon keresztül; egy szűrővizsgálat, egy kezelési vizit a kijelölt terület sebészeti kezeléséhez, négy utóellenőrzés és három további vizit klinikai és radiográfiai újraértékelés és mintavétel céljából (teljes nyál, gingivális résfolyadék (GCF), szubgingivális plakk).

Vizsgálók kalibrálása és randomizálása A betegek alkalmasságát egy vizsgáló szűri, és a kódszám megszerzését követően folyamatosan, egyenként veszi fel őket. Az adatgyűjtésben részt nem vevő kísérleti közreműködő végzi el a randomizálást, és telefonos kommunikáción keresztül bejelenti a terapeutának a kezelési módot. A klinikai értékeléseket egyetlen vizsgáló végzi, aki nem fér hozzá a korábbi felvételekhez, és egyébként nem vesz részt más klinikai eljárásokban. El kell végezni a vizsgáló kalibrációs gyakorlatát annak érdekében, hogy a PPD, a CAL és a defektus anatómiájának értékelése során elfogadható vizsgálaton belüli reprodukálhatóságot kapjunk. A vizsgálón belüli reprodukálhatóságot az osztályon belüli korrelációs együttható (ICC) és a Bland-Altman 95%-os megegyezési határértékei alapján értékelik (Bland és Altman, 1999).

Kísérleti adatok statisztikai elemzése Az elemzés az IBM Statistics SPSS 20.0 szoftverrel történik. Az adatokat átlag +/- szórással (SD) kell megadni. A véletlenszerűsítési eljárásokkal létrehozott teszt- és kontrollcsoportok közötti egyensúlyhiányt a független minták t-próbája folytonos változók esetén, valamint a Fisher-féle pontos teszt vagy a Khi-négyzet teszt a kategorikus változók esetén értékelik. A kezelési hatások jelentőségét a függő változókra, a CAL-változásokra, a PPD-változásokra és a radiográfiai változásokra, lineáris vegyes modellek készítésével becsüljük meg az SPSS MIXED eljárással. Minden elemzésnél a statisztikai szignifikancia értéke p<0,05.

Etikai megfontolások / Őssejtkultúrák engedélyezése A Biohellenika, Thesszaloniki, Görögország a legkorszerűbb létesítményeket és laboratóriumokat biztosítja, amelyek a legszigorúbb őssejt-feldolgozási és -tárolási előírások szerint működnek. A laboratóriumok a 2008. március 26-i kormányrendelet (a görög jog szabályozása a 2004/23/K európai törvény és a 2004. március 31-i tanácsi tanács szerint az adományozás minőségi és biztonsági prototípusainak létrehozására) szerint engedélyezettek. vásárlás, minőségellenőrzi az emberi szövetek és sejtek mélyhűtését, tárolását és elosztását (EEL 102/7-4-2004), valamint a kapcsolódó 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) és 2006/86EK (EEL 294) irányelveket. /2006-10-25). Az F 6172/17514/1269 számú engedély a 2589. számú kormánylapban, 2009.12.31.

2014 novembere óta a Biohellenika az új 3984-es törvény szerint működik, amely a 2011. évi 150. számú kormánylapban jelent meg, miután az Országos Transzplantációs Bizottság pozitív ajánlást adott az Egészségügyi Minisztériumnak, és jelenleg az új engedély megjelenése a kormánylapban.

A laboratóriumokat és az eljárásokat az Amerikai Vérbankok Szövetsége (AABB), utolsó ellenőrzése 2014. szeptember 30-án, valamint a National System of Accreditation ISO 15189:2007 szabvány szerint akkreditálta. Emellett a laboratóriumok ISO 9001:2008 tanúsítvánnyal rendelkeznek az autológ sejtvonalak feldolgozására, minőségellenőrzésére és mélyhűtésére, valamint az ISO 13485:2003 tanúsítványra a mélyhűtési rendszerre vonatkozóan, amely szintén a Biohellenika nemzetközi szabadalma.

A tiszta helyiségek a BSR Ingenieur-Buro ISO 14644-5 szabvány szerinti irányelvei szerint működnek. A biztonsági szintek megfelelnek az összes ISO 27001 szabványnak, és a vállalat az Adatvédelmi Hatóság által engedélyezett és szabályozott.

A laboratóriumokban 24 órán át vizsgálják a levegő minőségét, és fel vannak szerelve Cryo-View adatbázis-rendszerrel, ISBT 128 vonalkódos rendszerrel, hőmérséklet-folyadék N2 szinttel, biztonsági riasztókkal és két áramfejlesztővel.

Tanulmányi ütemterv Klinikai tervezés és beavatkozások BM-MSC-k autológ transzplantációjához A súlyos krónikus parodontitiszben szenvedő alanyok helyi érzéstelenítésben nem sebészi kezelést kapnak kézi és erővel hajtott műszerekkel, a parodontális gondozás motivációja és az alapos szájhigiénés utasítások mellett. . Hat héttel a nem sebészeti kezelés befejezése után az alanyokat klinikailag újraértékelik, és azokat az alanyokat, akiknél megmaradt parodontális zseb (PPD és CAL ≥ 6 mm; infracsont komponens ≥ 3 mm), és nem mutatkoznak ínygyulladás nyilvánvaló jelei, megvizsgálják, hogy alkalmasak-e a vizsgálatban való részvételre. jelenlegi tanulmány. A szűrővizit magában foglalja a kezdeti teljes száj-fogágyvizsgálatot, az intraorális röntgenvizsgálatot és a beválasztási/kizárási kritériumok teljesítését. Alkalmasság esetén minden alanynak részletesen ismertetjük a vizsgálat jellegét, és a Fogorvosi Iskola Etikai Bizottsága, AUTh. minden résztvevőtől megkapjuk. Ezután a betegeket véletlenszerűen besorolják a három kezelési csoport (-A, -B és -C) egyikébe. Minden betegnél egyetlen hiba kerül kezelésre.

Ezt követően csontbiopsziát és vérmintát vesznek az A csoport résztvevőitől szigorú steril körülmények között. Ezután minden egyes mintát azonnal steril csövekbe helyeznek, és a görögországi Biohellenikába, Thesszalonikibe (http://www.biohellenika.gr) szállítják őssejt-izolálás és -tágítás céljából egy szigorú protokoll szerint (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou). et al. előkészítés alatt). Mivel az MSC-ket in vitro GLP-osztályú tisztaszobákban izolálják és kiterjesztik, megfelelnek az Európai Unió minőségi irányelveinek, és az autológ transzplantáció során nem használnak állati eredetű reagenseket, a sejteket biztonságosnak tekintik humán klinikai sejtterápiás alkalmazásokhoz. . A Biohellenika létesítményekben röviddel a biopszia begyűjtése után 60 ml vénás vért gyűjtenek az A csoport minden alanyától, így autológ szérumot használnak az autológ őssejtek izolálására és tenyészetének kiterjesztésére. Ezenkívül autológ fibrin ragasztót használnak a BM-MSC-k kollagén gyapjúra való feltöltéséhez. Ezenkívül 20 ml-es vérmintát vesznek a B csoportba tartozó alanyoktól, hogy fibrin ragasztót biztosítsanak, amely dúsítja a kollagén gyapjút, mielőtt műtétileg behelyeznék a csonthibába. Végül, a C csoportba tartozó alanyokat nem hívják be vérvételre, mivel ezeknél az egyéneknél az infracsont-rendellenességeket sebészileg kezelik nyitott lebeny debridációval, oltóanyagok kiegészítő használata nélkül.

A GLP minőségellenőrzés részeként az MSC-ket sterilitás és endotoxinok szempontjából elemzik, valamint megvizsgálják a baktériumok (BD BACTEC™), mikoplazma és endotoxinok (LAL teszt) esetleges szennyeződését.

Helyi érzéstelenítés (1,8 ml 2%-os lidokain 1:80 000 epinefrinnel; Lignospan special, Septodont) az érintett fogak bukkális és linguális oldalára infiltrálódik, elkerülve a papillákat. Ezután szigorúan intrasulcularis bemetszéseket hajtanak végre a fogínyszövetek és különösen a csont-foghiányhoz kapcsolódó interdentális papilla megőrzése érdekében (Cortellini, 2012; Cortellini és Tonetti 2007). A hibát kitisztítják, és a gyökeret gondosan meggyalulják a Gracey-küretták és a motoros műszerek (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Svájc) kombinált használatával. Gondoskodni kell a defektusok lágyszöveti falának megőrzéséről, és a csonthibát sóoldattal öntözni kell a vérzés megakadályozása érdekében.

Az A csoportban az oltóanyagot (fibrin ragasztóval dúsított BM-MSC-k) két inzulinfecskendőben szállítják, amelyek mindegyike 5x10E6 sejt/100 μl fibrint tartalmaz, majd óvatosan ráhelyezik a kollagén gyapjúra, és CaCl2 hozzáadásával polimerizálják. Ezt követően a biokomplexet finoman becsomagolják a defektusba, amíg teljesen meg nem töltődik. Az állványt óvatosan kell kezelni, hogy elkerüljük az életképes sejtek pusztulását.

A B csoportban az életképes sejtektől mentes fibrin ragasztóval dúsított kollagén gyapjú óvatosan kitölti a függőleges csonthibát. Az -A és -B csoportban a fibrin ragasztó bejuttatása életképes sejtekkel vagy anélkül azonos lesz, így a terapeuta nem látja az eljárásokat.

A C csoportban a betegek a -A és -B csoportokhoz hasonló módon kapnak nyitott lebeny-tisztítást és a gyökérfelszín gyökérgyalulását, de nem lesz szükség kiegészítő oltóanyag-használatra.

Az operátor vak lesz a kezelési módra (-A és -B csoport), míg a C csoportban, mivel oltóanyagot nem használnak, a kezelési mód nyilvánvalóvá válik a kezelő számára, de ez a műtét végén megtörténik. , a klinikai adatok gyűjtése után. Minden csoportban törekedni kell a papillák megőrzésére és a minimálisan invazív sebészeti technikákra, elkerülve a csonthártya pontozását. A szárnyakat egyetlen módosított belső matracvarrással (5-0 Monosyn, Braun) kell áthelyezni és összevarrni a hibával összefüggő interdentális területen, és hasonló varratokat alkalmaznak a szárnyak lezárására bármely más fogközi területen. A műtét után két héttel klinikai megfigyelés történik az eseménytelen gyógyulás vagy a nemkívánatos szöveti reakció jelenléte miatt, majd a varrat eltávolítása következik.

Esetsorozat a szövetsebészethez Egy sor (öt) esetsorozatban, amelyek a fentiekhez hasonló besorolási/kritériumokkal rendelkeznek, de randomizáció nélkül, a szövetsebészetet ugyanazt a módszert követve alkalmazzák, mint az A csoportban. Ezekben az esetekben a szövetsebészeti konstrukció (biokomplex) izolált interdentalis periodontális defektusok kezelésére alkalmazzák egy újonnan kifejlesztett sebészeti technikával, az úgynevezett "zárt műtéti technikával". Röviden, ez a technika magában foglalja a fogínylebenyek zárt visszahúzását anélkül, hogy a lágyszöveteket vagy az interdentális papillat feldarabolnák. Ez a technika minimalizálja a szöveti traumát, a posztoperatív kényelmetlenséget és javítja a lágyszövetek esztétikáját.

Posztoperatív ellátás A műtét utáni fájdalmat ibuprofénnel (600 mg) csillapítjuk a műtét végén, és 12 órával később, ha fájdalmasak. Amoxicillint (500 mg / 8 óra öt napig) minden résztvevőnek fel kell írni. Minden beteget arra utasítanak, hogy naponta kétszer használjon 0,12%-os klórhexidint, és négy hétig kerülje a fogmosást, a fogselyem használatát és a kemény rágását a kezelt területen. Ebben a 4 hetes időszakban kéthetente szigorú posztoperatív szupportív ellátást indítanak, majd ezt követően a betegek abbahagyják a klórhexidin oldatos öblítést, és folytatják a szájhigiéniát. A fogköz tisztítása minden csoportban a műtét után hat héttel kezdődik. Ezt követően az alanyokat három, hat és 12 hónapos korukban látják el periodontális támogató ellátás céljából.

Klinikai felvételek Teljes száj és helyspecifikus periodontális felvételek, beleértve a BOP-t; Plakk-index (plakk jelenléte/hiánya); A PPD-t és a CAL-t kézi periodontális szondával (Hu-Friedy XP-23/QW) határozzák meg a legközelebbi milliméteres pontossággal foganként hat helyen, és a hosszú tengellyel párhuzamosan négy időpontban; alapvonal, 6-, 9-, 12-hónapos. A klinikai méréseket a kijelölt helyeken (infrabony defektusok) a műtét előtt és az érzéstelenítés előtt (alapvonal) határozzák meg. A műtéten belüli értékelésre a műtét során egyszer kerül sor.

Sebészeti beavatkozáson belüli klinikai értékelések A defektus morfológiáját (egy-, két-, háromfalú vagy kombináció) a műtéten belül a lézióhoz kapcsolódó csontfalak száma határozza meg; A cement-zománc csomópont és a hiba alja közötti távolság (CEJ-BD) mm-ben kerül meghatározásra; A CEJ és a csonttalaj legkoronálisabb interproximális szintje (CEJ-BC) távolságát mm-ben kell meghatározni; A teljes hibamélység: a csont gerince és a defektus alja közötti távolság (BC-BD) mm-ben kerül meghatározásra; A hibaszélesség szélességét (a csonthéj és a gyökérfelület közötti vízszintes távolságot) mm-ben kell meghatározni.

Ha a CEJ a méhnyak helyreállítása miatt nem észlelhető, a helyreállítási határ (RM) referenciapontként szolgál a klinikai és radiográfiai mérésekhez.

Radiográfiai értékelés Intraorális digitális radiográfiával hat időpontban határozzuk meg az infrabony defektusok csontregenerációját; alapvonal, 6 hetes, 3, 6, 9, 12 hónapos. A szabványos periapikális digitális röntgenfelvételeket (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Párizs, Franciaország) a hosszú kúp párhuzamosítási technikával készítik. Az expozíciós geometria szabványosítása érdekében egy elasztikus lenyomatanyagból készült, testreszabott harapástömböt állítanak be az érzékelőtartón, zárt műanyag tartályokban tárolják szobahőmérsékleten, és minden visszahívási radiográfiai találkozó során újra felhasználják.

A műtéten belüli értékeléshez hasonlóan a következő anatómiai tereptárgyak kerülnek meghatározásra a röntgenfelvételeken: a cementzománc csomópont (CEJ), az alveoláris csont legkoronálisabb szintje (BC) és a csontvesztés apikális mértéke ( BD). Részletesebben meghatározzák a CEJ helyét; a legkoronálisabb terület, ahol a periodontális szalag egyenletes szélességet tart, a röntgenfelvételen azonosítani kell, jelezve a csontvesztés legapikálisabb kiterjedését. Az infrabonus defektus kiszámítása a hiba szélességének legkoronásabb oldali és tövénél mért mérésével történik; a CEJ-BD és a BC-BD közötti távolság; a CEJ-BC közötti távolság; a gyökér függőleges tengelye és az interdentális csontfal közötti szög (Tonetti et al. 1993). A csontregeneráció radiográfiás értékelését nagyfelbontású monitoron ugyanaz a kalibrált vizsgáló fogja meghatározni, aki nem látja a kezelési módot, és nem fér hozzá a korábbi felvételekhez. Az értékeléseket a numerikus mérésekhez használt mérőeszközzel (VixWin™ Platinum|Gendex szoftver) végzik, egy szabványos hosszúságú (5 mm-es) fémrúdra való hivatkozással, amelyet az érzékelőre kell rögzíteni.

Mintagyűjtés A minták a következő sorrendben kerülnek gyűjtésre hat időpontban; alapvonal, 6 hetes, 3, 6, 9, 12 hónapos.

(i) Nyál A nyálat össze kell gyűjteni a klinikai parodontális mérések vagy bármely parodontális beavatkozás előtt, és általában reggel az éjszakai koplalás után, amely során az alanyokat megkérik, hogy ne igyanak (kivéve a vizet) és ne rágjanak rágógumit. A teljes nyálmintákat 30 ml-es polipropilén csövekbe történő köptetéssel 5 percig vesszük.

(ii) GCF Gingival recvicularis folyadék mintákat veszünk a defektusok bukkális interdentális vonatkozásaiból. A GCF begyűjtése előtt a felületeket óvatosan levegőn szárítják, és pamuttekercsek elhelyezésével és nyálszívóval elkülönítik a nyáltól. Ezután a szupragingivális plakkot óvatosan eltávolítják steril küretekkel, és papírcsíkokat (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) helyeznek a parodontális zsebbe, amíg enyhe ellenállást nem éreznek 30 másodpercig. A csíkok elhelyezésekor ügyelni kell arra, hogy elkerüljük a mechanikai sérüléseket, és a vérrel szennyezett csíkokat el kell dobni. A páciensenkénti minden egyes csíkot külön 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőben kell tárolni, és -70°C-on kell tárolni. Használat előtt a csíkokon lévő fehérjéket 500 µl foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) eluáljuk, amelyet BSA-val (1% v/v) egészítünk ki.

(iii) Plakk A GCF gyűjtést követően a szubgingivális plakkot a kijelölt helyről kell gyűjteni. A mintavételi területet elkülönítik a nyáltól, óvatosan szárítják levegőn, és miután meggyőződtek arról, hogy ne legyenek supragingivális plakklerakódások, két papírpontot helyeznek el 30 másodpercre a parodontális zsebbe, és összegyűjtik a mintát. Az összes mintát Eppendorf-csövekben (Eppendorf, Hamburg, Németország) -80 °C-on tárolják a feldolgozás előtt. A mikrobiális lepedék gyűjtésére papírpontokat használunk, hogy elkerüljük a parodontális szövetek mechanikai sérülését.

Adatkezelés A nyomozóknak gondoskodniuk kell az alany anonimitásának megőrzéséről. A tanulmányokkal kapcsolatos dokumentumokon a személyek csak kezdőbetűik, nemük és/vagy tárgyszámuk alapján legyenek azonosíthatók. Személyes adatok (pl. orvosi kártyákat) elkülönített, biztonságos helyen tárolják, távol az egyéb vizsgálatspecifikus adatoktól, és csak a vezető kutató számára korlátozott hozzáféréssel.

Tájékozott hozzájárulási eljárás A vizsgálatvezető felelőssége, hogy írásos beleegyezést szerezzen az alanytól. A tájékoztatáson alapuló hozzájárulási űrlap két külön dokumentumból áll; egy alanyi információs űrlap és egy alanyi tájékoztatáson alapuló hozzájárulási aláírási űrlap; mindkét dokumentumot a Dental School Etikai Bizottsága (AUTH) hagyja jóvá a vizsgálat előtt. A tantárgyi tájékoztató űrlap megfelelő magyarázatot ad a vizsgálat céljairól, célkitűzéseiről, módszereiről, várható előnyeiről és lehetséges veszélyeiről anyanyelvén, az alany számára érthető, nem szaknyelven. A vezető kutatónak ezután elegendő időt kell biztosítania az alanynak, hogy elolvassa és megértse a beleegyező nyilatkozatot, és mérlegelje a klinikai vizsgálatban való részvételét. A vizsgálatvezetőnek és az alanynak is alá kell írnia és dátumoznia kell az űrlapot, mielőtt az alany részt vehetne a klinikai vizsgálatban. Ezt követően minden alany megkapja a megfelelően aláírt és keltezett beleegyező nyilatkozatát, valamint minden egyéb írásos információt.