Células madre mesenquimales autólogas de médula ósea alveolar para la reconstrucción de defectos periodontales infraóseos (PerioRegen)

Propósitos y objetivos El presente estudio describe un método novedoso para regenerar tejidos periodontales en defectos periodontales infraóseos usando BM-MSC autólogas, libres de reactivos derivados de animales, producidas en instalaciones de sala limpia enriquecidas con pegamento de fibrina autóloga y sembradas en andamios de colágeno disponibles comercialmente (vellón de colágeno ).

Objetivo principal Este estudio pretende evaluar la eficacia de un nuevo tratamiento regenerativo de los defectos periodontales infraóseos utilizando un biocomplejo de BM-MSC/pegamento de fibrina/vellón de colágeno, en comparación con un sustituto de injerto libre de células de pegamento de fibrina/vellón de colágeno y con un enfoque de tratamiento de control de desbridamiento con colgajo abierto sin uso complementario de materiales de injerto.

Objetivos secundarios

• Documentar la estabilidad del resultado mejorado del tratamiento y continuar evaluando la seguridad y la eficacia del trasplante de BM-MSC en comparación con el tratamiento de control de desbridamiento con colgajo abierto durante el período de estudio.
• Determinar los perfiles inmunológicos y microbiológicos de los participantes a lo largo del período de estudio en un intento por comprender los efectos locales y sistémicos del trasplante de BM-MSC en sitios con enfermedades crónicas, como el defecto periodontal infraóseo. Además, la respuesta de curación al tratamiento se determinará a lo largo del período de observación (línea de base a 12 meses).

Diseño del estudio

Productos en investigación Se establecerán cultivos de aBM-MSCs a partir de biopsias óseas derivadas de la médula ósea del hueso alveolar en cada paciente perteneciente al Grupo A. Brevemente, después de un enjuague bucal completo con clorhexidina al 0,12% durante 1min, se realizará una osteotomía con un taladro de trépano. se realiza en el hueso alveolar y se recolectará un núcleo óseo de 2x8 mm. El área se irrigará con solución salina y luego se suturarán los colgajos para lograr el cierre primario en el sitio donante. Luego, la muestra de hueso se colocará inmediatamente en tubos estériles que contienen HBSS y antibióticos/antimicóticos y se transportará a un centro autorizado que cumpla con las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y cumpla con las pautas de calidad establecidas por la Unión Europea para la preparación de vástagos de grado clínico. cultivos celulares para su entrega al paciente. El aislamiento de aBM-MSC se realizará mediante el método de disociación enzimática, como se describió anteriormente (Bakopoulou 2013). Para la expansión del cultivo, se utilizará suero autólogo obtenido de 60 ml de sangre venosa recolectada de cada sujeto para complementar un medio de cultivo celular MEM, con el fin de evitar el uso de reactivos derivados de animales, como el suero bovino. La biopsia ósea será procesada inmediatamente para asegurar una alta viabilidad de los cultivos establecidos. Después de la expansión de dos pases (tiempo aproximado necesario de 16 a 24 días según el donante de células), se recolectarán las células para entregarlas al paciente. Para la disociación celular y el paso, se utilizarán enzimas recombinantes compatibles con GMP altamente purificadas (Tryple, Thermo Fisher Scientific) para evitar el uso de tripsina porcina. En esta etapa, se requerirá una muestra de 20 ml de sangre venosa para la preparación de la cola de fibrina autóloga en el Grupo B, ya que en el Grupo A la sangría inicial (60 ml) cubrirá las necesidades de cultivos celulares y preparación de la cola de fibrina. Posteriormente, el pegamento de fibrina se cargará con (Grupo A) o sin (Grupo B) células madre en un andamio de vellón de colágeno disponible en el mercado directamente antes de la aplicación clínica.

Control de calidad de los cultivos de BM-MSC establecidos antes de la aplicación clínica

Antes de la entrega al paciente, todos los cultivos de BM-MSC se evaluarán para:

• Viabilidad usando la exclusión de Trypan Blue
• Esterilidad: los cultivos se analizarán en busca de posible contaminación por bacterias, micoplasmas y endotoxinas (prueba LAL)
• Propiedades de "stemness" basadas en los criterios mínimos establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) con respecto a las MSC (Dominici et al 2006).

Nota: La metodología sobre los métodos de caracterización de células madre se describe analíticamente en publicaciones anteriores de nuestro grupo de investigación (Bakopoulou et al. 2013).

Después de la aplicación de la mezcla de BM-MSC/pegamento de fibrina/CaCl2 en los andamios de colágeno, una pequeña muestra del biocomplejo de casos seleccionados al azar se separará con tijeras quirúrgicas y se transferirá al laboratorio para su posterior análisis (en paralelo a la aplicación clínica). ) caracterización ex vivo del comportamiento de células madre en un microambiente biomimético. Esto permitirá la correlación entre el comportamiento de las células madre y el resultado clínico, ya que la recuperación y el análisis de los tejidos regenerados directamente del huésped no es factible por razones éticas.

Preparación de cola de fibrina autóloga Se recogerán 20 ml de sangre venosa de la fosa antecubital de los pacientes de los Grupos A y B y las muestras de sangre se transferirán inmediatamente a un tubo falcon, que contiene anticoagulante. Después de la determinación del recuento de plaquetas, la muestra de sangre se centrifugará (2000 rpm, 10 min) y el plasma se separará y almacenará en otro halcón. A continuación, se determinarán los recuentos de plaquetas y la muestra se centrifugará de nuevo. A continuación, se separará el PRP (plasma rico en plaquetas que contiene 1 000 000 plts/ul) del PPP (plasma pobre en plaquetas) sobrenadante y ambas preparaciones se procesarán siguiendo un protocolo estándar para la preparación de cola de fibrina (Biohellenika, Thessaloniki, Grecia).

Diseño del brazo clínico del estudio

Preselección de Sujetos Los sujetos serán reclutados de nuevas referencias en el Departamento de Odontología Preventiva, Periodoncia y Biología de Implantes; no se realizará publicidad externa ni contratación. Los sujetos estarán en buen estado de salud general.

Admisión al estudio Antes de la admisión al estudio, el investigador principal informará a cada sujeto sobre la naturaleza y los riesgos del estudio, tanto de forma oral como por escrito (Formulario de información del sujeto) y se otorgará el consentimiento informado por escrito (Formulario de firma de consentimiento informado del sujeto). obtenido. A cada sujeto se le entregará una copia de su formulario de consentimiento debidamente firmado para que lo conserve para sus propios registros. Se registrará la demografía personal y el historial médico de los sujetos y la idoneidad para el estudio de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión establecidos en el protocolo. Los sujetos pueden continuar con cualquier medicamento no incluido en los criterios de exclusión; sin embargo, estos medicamentos deben documentarse junto con cualquier condición médica concurrente no preexcluida.

Procedimientos para la retirada o interrupción de sujetos Cualquier sujeto que desee retirarse del estudio por motivos personales o por cualquier otro motivo tiene derecho a hacerlo. Sin embargo, el investigador principal registrará el motivo del retiro de cualquier sujeto del estudio, además de si el motivo está relacionado con el producto de prueba. Cualquier participante que no asista más de dos veces se elimina del estudio. Los sujetos que experimenten un evento adverso serán excluidos de una mayor participación en el estudio.

Si un sujeto desea retirarse del estudio, se hará todo lo posible para completar e informar las observaciones lo más detalladamente posible hasta la fecha de retiro. Se les pedirá a los sujetos que consideren dar más información sobre los motivos del retiro. Cualquier información reportada será registrada.

Duración esperada de la participación de cada sujeto Se espera que cada sujeto asista a nueve visitas en total durante un período de 12 meses; una visita de detección, una visita de tratamiento para recibir tratamiento quirúrgico del área designada, cuatro revisiones de seguimiento y tres visitas adicionales para reevaluación clínica y radiográfica y recolección de muestras (saliva entera, líquido crevicular gingival (GCF), placa subgingival).

Calibración y aleatorización de los investigadores Un examinador evaluará la elegibilidad de los pacientes y los inscribirá de uno en uno de manera continua después de obtener un número de código. Un colaborador del ensayo que no participe en la recopilación de datos realizará la aleatorización y anunciará la modalidad de tratamiento al terapeuta mediante comunicación telefónica. Las evaluaciones clínicas serán realizadas por un solo examinador que no tendrá acceso a registros previos y no estará involucrado en otros procedimientos clínicos. Se realizará un ejercicio de calibración del investigador para obtener una reproducibilidad intraexaminador aceptable para PPD, CAL y evaluación de la anatomía del defecto. La reproducibilidad intraexaminador se evaluará mediante el coeficiente de correlación intraclase (ICC) y los límites de concordancia del 95 % de Bland-Altman (Bland y Altman, 1999).

Análisis estadístico de los datos experimentales El análisis se realizará utilizando el software IBM Statistics SPSS 20.0. Los datos se expresarán como medias +/- desviación estándar (DE). Los desequilibrios entre los grupos de prueba y de control generados por los procedimientos de aleatorización se evaluarán utilizando la prueba t de muestras independientes para variables continuas y la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi-cuadrado para variables categóricas. La importancia de los efectos del tratamiento sobre las variables dependientes cambios CAL, cambios PPD y cambios radiográficos se estimará mediante la construcción de modelos lineales mixtos utilizando el procedimiento SPSS MIXED. Para todos los análisis, la significación estadística se establecerá en p<0,05.

Consideraciones éticas/Autorizaciones para cultivos de células madre Biohellenika, Thessaloniki, Grecia, ofrece instalaciones y laboratorios de última generación que operan bajo las normas más estrictas para el procesamiento y almacenamiento de células madre. Los laboratorios están autorizados según la orden del Gobierno 26/24-3-2008 (reglamento de la ley griega según la ley europea 2004/23/K y el Consejo 31-3-2004 para el establecimiento de prototipos de calidad y seguridad para la donación, la compra, los controles de calidad, la crioconservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos (EEL 102/7-4-2004) y las directrices relacionadas 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) y 2006/86EK (EEL 294 /25-10-2006). La licencia F 6172/17514/1269 está publicada en el Diario Oficial 2589 del 31/12/2009.

Desde noviembre de 2014, Biohellenika opera bajo la nueva ley 3984, publicada en el Gob paper No. 150 de 2011 luego de una recomendación positiva del Comité Nacional de Trasplantes al Departamento de Salud y en este momento la nueva licencia está a punto de publicarse en el Gob paper.

Los laboratorios y los procedimientos están acreditados por la Asociación Americana de Bancos de Sangre (AABB), última inspección el 30 de septiembre de 2014 y por el Sistema Nacional de Acreditación según ISO 15189:2007. También los laboratorios están certificados según ISO 9001:2008, para procesamiento, control de calidad y criopreservación de linajes celulares autólogos e ISO 13485:2003 para el sistema de criopreservación, que también es una patente internacional de Biohellenika.

Las salas limpias funcionan según las directrices de BSR Ingenieur-Buro con ISO 14644-5. Los niveles de seguridad cumplen con todos los estándares ISO 27001 y la empresa está autorizada y regulada por la Autoridad de Protección de Datos.

Los laboratorios se inspeccionan las 24 horas para determinar la calidad del aire y están equipados con el sistema de base de datos Cryo-View, el sistema de código de barras ISBT 128, la temperatura: nivel de N2 líquido, alarmas de seguridad y dos generadores de energía.

Calendario del estudio Diseño clínico e intervenciones para el trasplante autólogo de BM-MSC Se programará a los sujetos con periodontitis crónica grave para recibir tratamiento periodontal no quirúrgico bajo anestesia local utilizando instrumentos manuales y eléctricos, además de motivación en el cuidado periodontal e instrucciones detalladas de higiene oral. . Los sujetos serán reevaluados clínicamente seis semanas después de completar el tratamiento no quirúrgico y aquellos sujetos con bolsas periodontales restantes (PPD y CAL ≥ 6 mm; componente infraóseo ≥ 3 mm) y sin signos manifiestos de inflamación gingival serán evaluados para determinar si son aptos para participar en el estudio actual. La visita de selección incluirá un examen periodontal inicial de toda la boca, un examen radiográfico intraoral y el cumplimiento de los criterios de inclusión/exclusión. En caso de idoneidad, se explicará detalladamente la naturaleza del estudio a todos los sujetos y se firmará un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Odontología, AUTh. se obtendrá de cada participante. Luego, los pacientes se asignarán aleatoriamente a uno de los tres grupos de tratamiento (-A, -B y -C). En cada paciente se tratará un único defecto.

Posteriormente, se tomará una biopsia ósea y muestras de sangre de los participantes del Grupo A en estrictas condiciones de esterilidad. Luego, cada muestra se colocará inmediatamente en tubos estériles y se transportará a Biohellenika, Thessaloniki, Grecia (http://www.biohellenika.gr) para el aislamiento y expansión de células madre de acuerdo con un protocolo estricto (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou et al. en preparación). Dado que las MSC se aislarán y expandirán in vitro en salas limpias de clase GLP que cumplan con las pautas de calidad establecidas por la Unión Europea y no se utilizarán reactivos derivados de animales durante los experimentos para el trasplante autólogo, las células se consideran seguras para aplicaciones de terapia celular clínica humana. . En las instalaciones de Biohellenika se recogerán 60ml de sangre venosa de cada sujeto del Grupo A poco después de la toma de la biopsia, de forma que se utilice suero autólogo para el aislamiento y expansión del cultivo de las células madre autólogas. Además, se utilizará cola de fibrina autóloga para cargar las BM-MSC en el vellón de colágeno. Además, se recogerá una muestra de sangre de 20 ml de los sujetos del Grupo B, para proporcionar pegamento de fibrina que enriquecerá la lana de colágeno antes de la colocación quirúrgica en el defecto óseo. Finalmente, los sujetos en el Grupo C no serán llamados para sangría ya que los defectos infraóseos en estos individuos serán tratados quirúrgicamente mediante desbridamiento con colgajo abierto sin el uso complementario de materiales de injerto.

Como parte del control de calidad GLP, las MSC se analizarán en busca de esterilidad y endotoxinas y también se analizarán para detectar posible contaminación por bacterias (BD BACTEC™), micoplasma y endotoxinas (prueba LAL).

Se infiltrará anestesia local (1,8ml de lidocaína al 2% con epinefrina 1:80.000; Lignospan especial, Septodont) en las caras vestibular y lingual de los dientes afectados evitando las papilas. Luego, se realizarán incisiones estrictamente intrasulculares para preservar los tejidos gingivales y en particular la papila interdental asociada al defecto óseo-dental (Cortellini, 2012; Cortellini y Tonetti 2007). El defecto se desbridará y la raíz se alisará cuidadosamente con el uso combinado de curetas Gracey e instrumentos eléctricos (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Suiza). Se tendrá cuidado de retener la pared de tejido blando de los defectos y se irrigará el defecto óseo con solución salina para controlar el sangrado.

En el Grupo A, el material de injerto (BM-MSC enriquecido con pegamento de fibrina) se entregará en dos jeringas de insulina, cada una de las cuales contiene 5x10E6 células/100 μl de fibrina, se cargará suavemente en la lana de colágeno y se polimerizará con la adición de CaCl2. Posteriormente, el biocomplejo se empaquetará suavemente en el defecto hasta su completo llenado. El manejo del andamio se realiza con cuidado para evitar la destrucción de células viables.

En el Grupo B, la lana de colágeno enriquecida con cola de fibrina desprovista de células viables rellenará con precaución el defecto óseo vertical. En los Grupos -A y -B, la administración de pegamento de fibrina con/sin células viables será idéntica, por lo que el terapeuta no conoce los procedimientos.

Grupo C, los pacientes recibirán un desbridamiento con colgajo abierto y alisado radicular de la superficie de la raíz de manera similar a los sujetos de los Grupos -A y -B, pero no habrá uso complementario de materiales de injerto.

El operador no conocerá la modalidad de tratamiento (Grupos -A y -B), mientras que en el Grupo C, dado que no se usarán materiales de injerto, la modalidad de tratamiento será obvia para el operador, pero esto tendrá lugar hacia la conclusión de la cirugía. , después de la recogida de datos clínicos. En todos los grupos se buscarán técnicas de preservación de la papila y técnicas quirúrgicas mínimamente invasivas, evitando marcar el periostio. Los colgajos se reposicionarán y se suturarán con una única sutura de colchonero interna modificada (5-0 Monosyn, Braun) en el área interdental asociada al defecto y se emplearán suturas similares para cerrar los colgajos en cualquier otra área interdental. Dos semanas después de la cirugía, se realizará una observación clínica en busca de curación sin incidentes o presencia de una reacción tisular adversa, seguida de la extracción de la sutura.

Serie de casos para ingeniería de tejidos En una serie de casos (cinco) que tienen criterios de inclusión/criterios similares a los anteriores pero sin pasar por la aleatorización, la ingeniería de tejidos se aplica siguiendo la misma metodología que en el Grupo A. En estos casos, la construcción de ingeniería de tejidos (biocomplejo) es aplicado para tratar defectos periodontales interdentales aislados utilizando una técnica quirúrgica de nuevo diseño, la denominada "técnica quirúrgica cerrada". En resumen, esta técnica implica la retracción de los colgajos gingivales de manera cerrada sin disecar los tejidos blandos ni la papila interdental. Esta técnica minimiza el trauma del tejido, las molestias posoperatorias y mejora la estética de los tejidos blandos.

Cuidados postoperatorios El dolor postoperatorio se controlará con Ibuprofeno (600mg) al finalizar el acto quirúrgico y 12h después si hay dolor. Se recetará amoxicilina (500 mg/8 horas durante cinco días) a todos los participantes. Se indicará a todos los pacientes que usen clorhexidina al 0,12 % dos veces al día y eviten cepillarse los dientes, usar hilo dental y masticar con fuerza en el área tratada durante cuatro semanas. Durante este período de 4 semanas, se instituirá un estricto programa de atención postoperatoria de apoyo a intervalos quincenales y, después de eso, los pacientes dejarán de enjuagarse con solución de clorhexidina y reanudarán la higiene bucal. La limpieza interdental comenzará seis semanas después de la cirugía para todos los Grupos. A partir de entonces, los sujetos serán vistos a los tres, seis y 12 meses para recibir atención de apoyo periodontal.

Registros clínicos Registros periodontales específicos del sitio y de toda la boca, incluido el BOP; Índice de placa (presencia/ausencia de placa); El PPD y el CAL se determinarán usando una sonda periodontal manual (Hu-Friedy XP-23/QW) al milímetro más cercano en seis sitios por diente y paralelo al eje largo en cuatro puntos de tiempo; línea de base, 6, 9, 12 meses. Las mediciones clínicas en los sitios designados (defectos infraóseos) se determinarán antes de la cirugía y antes de la anestesia (línea de base). Las valoraciones intraquirúrgicas se realizarán una vez durante la cirugía.

Evaluaciones clínicas intraquirúrgicas La morfología del defecto (una, dos, tres paredes o combinación) se determinará intraquirúrgicamente por el número de paredes óseas asociadas con la lesión; La distancia entre la unión cemento-esmalte y el fondo del defecto (CEJ-BD) se determinará en mm; La distancia desde la UCE hasta el nivel interproximal más coronal de la cresta ósea (CEJ-BC) se determinará en mm; La profundidad total del defecto: la distancia entre la cresta ósea y el fondo del defecto (BC-BD) se determinará en mm; El ancho del defecto (distancia horizontal entre la cresta ósea y la superficie radicular) se determinará en mm.

Si el CEJ no es detectable debido a una restauración cervical, el margen de restauración (RM) servirá como punto de referencia para las mediciones clínicas y radiográficas.

Evaluación radiográfica Se utilizará radiografía digital intraoral para determinar la regeneración ósea de los defectos infraóseos en seis momentos; línea base, 6 semanas, 3, 6, 9, 12 meses. Se obtendrán radiografías digitales periapicales estandarizadas (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., París, Francia) utilizando la técnica de paralelismo de cono largo. Para estandarizar la geometría de exposición, se ajustará un bloque de mordida personalizado de un material de impresión elástico en el soporte del sensor, se almacenará en recipientes de plástico sellados a temperatura ambiente y se reutilizará durante cada cita radiográfica de revisión.

De manera similar a la evaluación intraquirúrgica, se definirán en las radiografías los siguientes puntos de referencia anatómicos: la unión amelocementaria (UCE), el nivel más coronal del hueso alveolar (BC) y la extensión apical de la pérdida ósea ( BD). Con mayor detalle se identificará la ubicación del CEJ; el área más coronal donde el ligamento periodontal conserva un ancho uniforme se identificará en la radiografía para indicar la extensión más apical de la pérdida ósea. El defecto infraóseo se calculará midiendo el ancho del defecto en la cara más coronal y en la base; la distancia entre CEJ-BD y BC-BD; la distancia entre CEJ-BC; el ángulo entre el eje vertical de la raíz y la pared del hueso interdental (Tonetti et al. 1993). La evaluación radiográfica de la regeneración ósea se definirá en un monitor de alta definición por el mismo examinador calibrado que no conoce la modalidad de tratamiento y no tiene acceso a registros anteriores. Las evaluaciones se realizarán utilizando la herramienta de medición para mediciones numéricas (software VixWin™ Platinum|Gendex) con referencia a una barra de metal de longitud estándar (5 mm) que se acoplará al sensor.

Recolección de muestras Las muestras se recolectarán en el siguiente orden en seis puntos de tiempo; línea base, 6 semanas, 3, 6, 9, 12 meses.

(i) Saliva La saliva se recogerá antes de las mediciones periodontales clínicas o de cualquier intervención periodontal y, en general, por la mañana después de un ayuno nocturno durante el cual se solicita a los sujetos que no beban (excepto agua) ni mastiquen chicle. Las muestras de saliva entera se obtendrán expectorando en tubos de polipropileno de 30 ml durante 5 minutos.

(ii) Las muestras de fluido crevicular gingival GCF se obtendrán de los aspectos interdentales bucales de los defectos. Antes de la recolección de GCF, las superficies se secarán suavemente al aire y se aislarán de la saliva colocando rollos de algodón y usando un eyector de saliva. Luego, la placa supragingival se eliminará cuidadosamente con curetas estériles y se colocarán tiras de papel (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, EE. UU.) en la bolsa periodontal hasta que sienta una leve resistencia durante 30 s. Se tendrá cuidado de evitar traumatismos mecánicos al colocar las tiras y se desecharán aquellas tiras contaminadas con sangre. Cada tira por paciente se almacenará en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado y se almacenará a -70 °C. Antes del uso, las proteínas de las tiras se diluirán en 500 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con BSA (1 % v/v).

(iii) Placa Luego de la recolección de GCF, la placa subgingival se recolectará del sitio designado. El área de muestreo se aislará de la saliva, se secará suavemente con aire y, después de asegurarse de que no haya depósitos de placa supragingival, se colocarán dos puntas de papel durante 30 segundos en la bolsa periodontal y se recolectará una muestra. Todas las muestras se almacenarán en tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a -80 °C antes del procesamiento. Se utilizarán puntas de papel para la recolección de placa microbiana con el fin de evitar la alteración mecánica de los tejidos periodontales.

Gestión de datos Los investigadores deben asegurarse de que se mantenga el anonimato del sujeto. En cualquier documentación relacionada con el estudio, los sujetos solo deben ser identificables por sus iniciales, género y/o número de sujeto. Información personal (es decir, tarjetas médicas) se mantendrán en un lugar separado y seguro, lejos de otros datos específicos del estudio con acceso restringido solo al investigador principal.

Proceso de consentimiento informado Es responsabilidad del investigador principal obtener el consentimiento por escrito del sujeto. El formulario de consentimiento informado constará de dos documentos separados; un formulario de información del sujeto y un formulario de firma de consentimiento informado del sujeto; ambos documentos serán aprobados por el comité de Ética de la Facultad de Odontología, AUTh previo al estudio. El formulario de información del sujeto proporcionará una explicación adecuada, en un lenguaje nativo no técnico que sea comprensible para el sujeto, de los fines, objetivos, métodos, beneficios anticipados y peligros potenciales del estudio. A continuación, el investigador principal debe proporcionar tiempo suficiente para que el sujeto lea y comprenda el formulario de consentimiento informado y considere su participación en la investigación clínica. El investigador principal y el sujeto deben firmar y fechar el formulario antes de que el sujeto pueda participar en la investigación clínica. Luego, a cada sujeto se le entregará una copia de su formulario de consentimiento informado debidamente firmado y fechado y cualquier otra información escrita.