Autologiczne mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego wyrostka zębodołowego do rekonstrukcji ubytków przyzębia podkostnego (PerioRegen)

Cele i zadania Niniejsze badanie opisuje nową metodę regeneracji tkanek przyzębia w ubytkach kości przyzębia przy użyciu autologicznych BM-MSC, wolnych od odczynników pochodzenia zwierzęcego, wyprodukowanych w pomieszczeniach czystych, wzbogaconych autologicznym klejem fibrynowym i zaszczepionych w dostępne w handlu rusztowania kolagenowe (włóknina kolagenowa ).

Główny cel Niniejsze badanie ma na celu ocenę skuteczności nowego leczenia regeneracyjnego ubytków kości przyzębia przy użyciu biokompleksu BM-MSC/kleju fibrynowego/włókniny kolagenowej w porównaniu z bezkomórkowym substytutem przeszczepu składającym się z kleju fibrynowego/włókniny kolagenowej oraz podejście do leczenia kontrolnego polegające na oczyszczeniu rany otwartym płatem bez dodatkowego użycia materiałów do przeszczepów.

Cele drugorzędne

• Aby udokumentować stabilność ulepszonych wyników leczenia i kontynuować ocenę bezpieczeństwa i skuteczności przeszczepu BM-MSC w porównaniu z leczeniem kontrolnym polegającym na oczyszczeniu otwartym płatem w okresie badania.
• Określenie profili immunologicznych i mikrobiologicznych uczestników w całym okresie badania w celu zrozumienia lokalnych i ogólnoustrojowych skutków przeszczepu BM-MSC w miejscach przewlekle chorych, takich jak ubytek przyzębia podkostnego. Ponadto przez cały okres obserwacji (początkowo do 12 miesięcy) będzie określana odpowiedź na leczenie.

Projekt badania

Badane produkty Hodowle aBM-MSCs zostaną ustalone na podstawie biopsji kostnych pobranych ze szpiku kostnego kości wyrostka zębodołowego u każdego pacjenta należącego do grupy A. W skrócie, po dokładnym płukaniu jamy ustnej 0,12% chlorheksydyną przez 1 min, zostanie wykonana osteotomia wiertłem trepanacyjnym w kości wyrostka zębodołowego i zostanie pobrany rdzeń kostny o wymiarach 2x8 mm. Obszar zostanie przepłukany roztworem soli fizjologicznej, a następnie zszyte zostaną płaty w celu uzyskania pierwotnego zamknięcia w miejscu pobrania. Próbka kości zostanie następnie natychmiast umieszczona w sterylnych probówkach zawierających HBSS i antybiotyki/środki przeciwgrzybicze i przetransportowana do autoryzowanego zakładu zgodnego z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP), spełniającego wytyczne jakościowe określone przez Unię Europejską w zakresie przygotowania trzpienia o jakości klinicznej hodowle komórkowe do dostarczenia pacjentowi. Izolacja aBM-MSC zostanie przeprowadzona przy użyciu metody dysocjacji enzymatycznej, jak opisano wcześniej (Bakopoulou 2013). Do ekspansji hodowli autologiczna surowica uzyskana z 60 ml krwi żylnej pobranej od każdego osobnika zostanie użyta do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowej aMEM, aby uniknąć stosowania jakichkolwiek odczynników pochodzenia zwierzęcego, takich jak surowica bydlęca. Biopsja kości zostanie natychmiast przetworzona, aby zapewnić wysoką żywotność ustalonych kultur. Po namnażaniu przez dwa pasaże (przybliżony czas potrzebny 16-24 dni w zależności od dawcy komórek) komórki zostaną zebrane w celu dostarczenia pacjentowi. Do dysocjacji komórek i pasażowania zostaną użyte wysoce oczyszczone, zgodne z GMP rekombinowane enzymy (Tryple, Thermo Fisher Scientific), aby uniknąć stosowania trypsyny wieprzowej. Na tym etapie do przygotowania autologicznego kleju fibrynowego w grupie B potrzebna będzie próbka 20 ml krwi żylnej, ponieważ w grupie A wstępne upuszczenie krwi (60 ml) pokryje potrzeby hodowli komórkowych i przygotowania kleju fibrynowego. Następnie klej fibrynowy zostanie załadowany z komórkami macierzystymi (Grupa A) lub bez (Grupa B) do dostępnego w handlu rusztowania z runa kolagenowego bezpośrednio przed zastosowaniem klinicznym.

Kontrola jakości ustalonych kultur BM-MSC przed zastosowaniem klinicznym

Przed dostarczeniem pacjentowi wszystkie hodowle BM-MSC zostaną ocenione pod kątem:

• Żywotność z wykluczeniem Trypan Blue
• Sterylność: kultury zostaną przebadane pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia bakteriami, mykoplazmami i endotoksynami (test LAL)
• Właściwości „łodygi” oparte na minimalnych kryteriach ustalonych przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT) w odniesieniu do MSC (Dominici i in. 2006).

Uwaga: Metodologia dotycząca metod charakteryzacji komórek macierzystych została analitycznie opisana we wcześniejszych publikacjach naszej grupy badawczej (Bakopoulou i in. 2013).

Po nałożeniu mieszaniny BM-MSCs/klej fibrynowy/CaCl2 na rusztowania kolagenowe, niewielka próbka biokompleksu losowo wybranych przypadków zostanie oddzielona nożyczkami chirurgicznymi i przekazana do laboratorium w celu dalszego (równolegle z zastosowaniem klinicznym) ) charakterystyka ex vivo zachowania się komórek macierzystych w mikrośrodowisku biomimetycznym. Umożliwi to korelację między zachowaniem komórek macierzystych a wynikiem klinicznym, ponieważ pobranie i analiza zregenerowanych tkanek bezpośrednio od gospodarza nie jest wykonalna ze względów etycznych.

Przygotowanie autologicznego kleju fibrynowego Z dołu przedłokciowego pacjentów z grupy A i B zostanie pobrane 20 ml krwi żylnej i próbki krwi zostaną niezwłocznie przeniesione do probówki Falcon zawierającej antykoagulant. Po oznaczeniu liczby płytek krwi próbka krwi zostanie odwirowana (2000 obr./min, 10 min), a osocze zostanie oddzielone i przechowane w innym sokole. Następnie zostanie określona liczba płytek krwi, a próbka zostanie ponownie odwirowana. PRP (osocze bogatopłytkowe zawierające 1 000 000 plt/ul) zostanie następnie oddzielone od supernatantu PPP (osocze ubogie w płytki) i oba preparaty będą dalej przetwarzane zgodnie ze standardowym protokołem przygotowania kleju fibrynowego (Biohellenika, Saloniki, Grecja).

Projekt klinicznej części badania

Preselekcja przedmiotów Pacjenci będą rekrutowani z nowych skierowań w Zakładzie Stomatologii Zachowawczej, Periodontologii i Biologii Implantologii; nie będzie prowadzona żadna zewnętrzna reklama ani rekrutacja. Pacjenci będą w dobrym ogólnym stanie zdrowia.

Wstęp do badania Przed przyjęciem do badania każdy uczestnik zostanie poinformowany przez głównego badacza o charakterze i ryzyku związanym z badaniem, zarówno ustnie, jak i pisemnie (formularz informacji o uczestniku), a pisemna świadoma zgoda (formularz podpisu świadomej zgody uczestnika) zostanie udzielona uzyskany. Każdy uczestnik otrzyma kopię należycie podpisanego formularza zgody, który będzie przechowywał we własnej dokumentacji. Rejestrowane będą osobiste dane demograficzne i historia medyczna pacjentów oraz przydatność do badania zgodnie z kryteriami włączenia i wyłączenia określonymi w protokole. Pacjenci mogą kontynuować leczenie dowolnymi lekami nieuwzględnionymi w kryteriach wykluczenia; jednak te leki powinny być udokumentowane wraz z wszelkimi współistniejącymi schorzeniami, które nie zostały wcześniej wykluczone.

Procedury wycofania lub przerwania udziału w badaniu Każdy uczestnik, który chce wycofać się z badania z powodów osobistych lub innych, ma do tego prawo. Jednak główny badacz odnotuje powód wycofania dowolnego uczestnika z badania, oprócz tego, czy powód jest związany z badanym produktem. Każdy uczestnik, który nie stawi się więcej niż dwa razy, zostaje usunięty z badania. Osoby, u których wystąpi zdarzenie niepożądane, zostaną wykluczone z dalszego udziału w badaniu.

Jeśli pacjent chce wycofać się z badania, zostaną podjęte wszelkie starania, aby uzupełnić i zgłosić obserwacje tak dokładnie, jak to możliwe, aż do daty wycofania się. Osoby badane zostaną poproszone o rozważenie podania dalszych informacji dotyczących powodu (powodów) wycofania. Wszelkie zgłoszone informacje zostaną zapisane.

Oczekiwany czas trwania każdego uczestnika Oczekuje się, że każdy uczestnik weźmie udział łącznie w dziewięciu wizytach w okresie 12 miesięcy; jedna wizyta przesiewowa, jedna wizyta zabiegowa w celu leczenia chirurgicznego wyznaczonego obszaru, cztery wizyty kontrolne i trzy dodatkowe wizyty w celu ponownej oceny klinicznej i radiologicznej oraz pobrania próbek (ślina pełna, płyn dziąsłowy (GCF), płytka poddziąsłowa).

Kalibracja i randomizacja badaczy Pacjenci będą sprawdzani pod kątem kwalifikowalności przez jednego egzaminatora i będą rejestrowani pojedynczo w sposób ciągły po uzyskaniu numeru kodu. Uczestnik badania, który nie jest zaangażowany w zbieranie danych, przeprowadzi randomizację i poinformuje terapeutę o sposobie leczenia za pomocą komunikacji telefonicznej. Oceny kliniczne będą przeprowadzane przez jednego egzaminatora, który nie będzie miał dostępu do poprzednich zapisów i nie będzie w inny sposób zaangażowany w inne procedury kliniczne. Wykonane zostanie ćwiczenie kalibracji badacza w celu uzyskania akceptowalnej powtarzalności wewnątrz egzaminatora dla PPD, CAL i oceny anatomii defektu. Odtwarzalność wewnątrz badającego zostanie oceniona za pomocą współczynnika korelacji wewnątrzklasowej (ICC) i 95% granic zgodności Blanda-Altmana (Bland i Altman, 1999).

Analiza statystyczna danych eksperymentalnych Analiza zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem oprogramowania IBM Statistics SPSS 20.0. Dane zostaną wyrażone jako średnie +/- odchylenie standardowe (SD). Nierównowagi między grupami testową i kontrolną, które są generowane przez procedury randomizacji, zostaną ocenione przy użyciu testu t dla prób niezależnych dla zmiennych ciągłych oraz testu dokładnego Fishera lub testu Chi-Square dla zmiennych kategorycznych. Znaczenie wpływu leczenia na zmienne zależne Zmiany CAL, zmiany PPD i zmiany radiograficzne zostaną oszacowane poprzez skonstruowanie liniowych modeli mieszanych przy użyciu procedury SPSS MIXED. Dla wszystkich analiz istotność statystyczna zostanie ustalona na poziomie p<0,05.

Względy etyczne / Zezwolenia na hodowle komórek macierzystych Biohellenika, Saloniki, Grecja zapewnia najnowocześniejsze obiekty i laboratoria, które działają zgodnie z najsurowszymi przepisami dotyczącymi przetwarzania i przechowywania komórek macierzystych. Laboratoria są licencjonowane zgodnie z zarządzeniem rządu 26/24-3-2008 (rozporządzenie prawa greckiego zgodnie z prawem europejskim 2004/23/K i Rady 31-3-2004 w sprawie ustanowienia prototypów jakości i bezpieczeństwa dawstwa, zakupu, kontroli jakości kriokonserwacji, przechowywania i dystrybucji tkanek i komórek ludzkich (EEL 102/7-4-2004) oraz związanych z nimi wytycznych 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) i 2006/86EK (EEL 294 /25-10-2006). Licencja F 6172/17514/1269 została opublikowana w dokumencie rządowym 2589 31.12.2009.

Od listopada 2014 roku Biohellenika działa na podstawie nowej ustawy 3984, opublikowanej w dokumencie Gov nr 150, 2011 po pozytywnej rekomendacji Krajowej Komisji Transplantacyjnej dla Ministerstwa Zdrowia iw chwili obecnej nowa licencja jest opublikowana w dokumencie Gov.

Laboratoria i procedury są akredytowane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Banków Krwi (AABB), ostatnia kontrola 30 września 2014 r. oraz przez Krajowy System Akredytacji zgodnie z ISO 15189:2007. Laboratoria posiadają również certyfikat ISO 9001:2008 w zakresie przetwarzania, kontroli jakości i kriokonserwacji autologicznych linii komórkowych oraz ISO 13485:2003 w zakresie systemu kriokonserwacji, który jest również międzynarodowym patentem firmy Biohellenika.

Pomieszczenia czyste działają zgodnie z wytycznymi BSR Ingenieur-Buro z normą ISO 14644-5. Poziomy bezpieczeństwa spełniają wszystkie normy ISO 27001, a firma jest licencjonowana i regulowana przez Urząd Ochrony Danych Osobowych.

Laboratoria są całodobowo monitorowane pod kątem jakości powietrza i wyposażone w system bazy danych Cryo-View, system kodów kreskowych ISBT 128, poziom temperatury i cieczy N2, alarmy bezpieczeństwa i dwa generatory prądu.

Harmonogram badań Projekt kliniczny i interwencje w celu autologicznego przeszczepu BM-MSC Pacjenci z ciężkim przewlekłym zapaleniem przyzębia zostaną zaplanowani na niechirurgiczne leczenie periodontologiczne w znieczuleniu miejscowym przy użyciu instrumentów ręcznych i mechanicznych, oprócz motywacji w opiece nad przyzębiem i dokładnych instrukcji dotyczących higieny jamy ustnej . Uczestnicy zostaną poddani ponownej ocenie klinicznej sześć tygodni po zakończeniu leczenia niechirurgicznego, a osoby z pozostałymi kieszonkami przyzębnymi (PPD i CAL ≥ 6 mm; komponenta podkostna ≥ 3 mm) i bez jawnych objawów zapalenia dziąseł zostaną poddane badaniu przesiewowemu pod kątem przydatności do udziału w aktualne badanie. Wizyta przesiewowa będzie obejmowała wstępne badanie periodontologiczne całej jamy ustnej, badanie radiologiczne wewnątrzustne oraz spełnienie kryteriów włączenia/wyłączenia. W przypadku przydatności, charakter badania zostanie szczegółowo wyjaśniony wszystkim uczestnikom i podpisany formularz zgody zatwierdzony przez Komisję Etyki Szkoły Stomatologicznej, AUTh. otrzyma od każdego uczestnika. Następnie pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z trzech grup terapeutycznych (-A, -B i -C). U każdego pacjenta leczona będzie pojedyncza wada.

Następnie od uczestników grupy A w ściśle sterylnych warunkach zostanie pobrana biopsja kości i próbki krwi. Każda próbka zostanie natychmiast umieszczona w sterylnych probówkach i przetransportowana do Biohellenika, Saloniki, Grecja (http://www.biohellenika.gr) w celu izolacji i namnażania komórek macierzystych zgodnie ze ścisłym protokołem (Bakopoulou i wsp. 2013, Bakopoulou) i wsp. w przygotowaniu). Ponieważ komórki MSC będą izolowane i namnażane in vitro w pomieszczeniach czystych klasy GLP, spełniających wytyczne jakościowe określone przez Unię Europejską, a podczas eksperymentów z autologicznymi przeszczepami nie będą używane żadne odczynniki pochodzenia zwierzęcego, komórki są uważane za bezpieczne do zastosowań w klinicznej terapii komórkowej u ludzi . W zakładach Biohellenika zostanie pobrane 60 ml krwi żylnej od każdego pacjenta z grupy A wkrótce po pobraniu biopsji, tak aby do izolacji i namnażania autologicznych komórek macierzystych użyto autologicznej surowicy. Ponadto autologiczny klej fibrynowy zostanie użyty do załadowania BM-MSC na runo kolagenowe. Dodatkowo od osób z grupy B zostanie pobrana próbka krwi o objętości 20 ml w celu dostarczenia kleju fibrynowego, który wzbogaci runo kolagenowe przed chirurgicznym umieszczeniem w ubytku kostnym. Wreszcie, pacjenci z grupy C nie będą wzywani do upuszczania krwi, ponieważ ubytki kości śródkostnej u tych osób będą leczone chirurgicznie przez oczyszczenie otwartego płata bez dodatkowego użycia materiałów do przeszczepów.

W ramach kontroli jakości GLP MSC zostaną przeanalizowane pod kątem sterylności i endotoksyn, a także zostaną przetestowane pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia bakteryjnego (BD BACTEC™), mykoplazmy i endotoksyn (test LAL).

Znieczulenie miejscowe (1,8 ml 2% lidokainy z epinefryną 1:80 000; Lignospan special, Septodont) będzie infiltrowane do policzkowej i językowej części dotkniętych zębów z pominięciem brodawek. Następnie wykonywane będą nacięcia stricte wewnątrzdziąsłowe w celu zachowania tkanek dziąsła, a w szczególności brodawki międzyzębowej związanej z ubytkiem kostno-zębowym (Cortellini, 2012; Cortellini i Tonetti 2007). Ubytek zostanie oczyszczony, a korzeń starannie wygładzony przy użyciu połączonych kiret Gracey i instrumentów napędzanych mechanicznie (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Szwajcaria). Należy zachować ostrożność, aby zachować ścianę tkanki miękkiej ubytku, a ubytek kostny zostanie przepłukany solą fizjologiczną w celu zatamowania krwawienia.

W grupie A materiał do przeszczepu (BM-MSC wzbogacony klejem fibrynowym) zostanie dostarczony w dwóch strzykawkach insulinowych, z których każda zawiera 5x10E6 komórek/100μl fibryny i zostanie delikatnie nałożony na włókninę kolagenową i poddany polimeryzacji z dodatkiem CaCl2. Następnie biokompleks zostanie delikatnie wtłoczony w ubytek aż do całkowitego wypełnienia. Obchodzenie się z rusztowaniem odbywa się z ostrożnością, aby uniknąć zniszczenia żywotnych komórek.

W grupie B włóknina kolagenowa wzbogacona klejem fibrynowym pozbawiona żywych komórek ostrożnie wypełni pionowy ubytek kostny. W grupach -A i -B podawanie kleju fibrynowego z żywymi komórkami/bez żywych komórek będzie identyczne, tak że terapeuta nie będzie wiedział o procedurach.

W grupie C pacjenci otrzymają oczyszczenie otwartego płata i wygładzenie powierzchni korzenia w podobny sposób jak pacjenci z grup -A i -B, ale nie będzie dodatkowego stosowania materiałów do przeszczepów.

Operator nie będzie wiedział o metodzie leczenia (grupy -A i -B), podczas gdy w grupie C, ponieważ nie będą używane żadne materiały do ​​przeszczepów, metoda leczenia stanie się oczywista dla operatora, ale nastąpi to pod koniec operacji , po zebraniu danych klinicznych. Techniki zachowania brodawek i minimalnie inwazyjne techniki chirurgiczne będą poszukiwane we wszystkich grupach, unikając nacięcia okostnej. Płatki zostaną przesunięte i zszyte przy użyciu pojedynczego zmodyfikowanego wewnętrznego szwu materacowego (5-0 Monosyn, Braun) w obszarze międzyzębowym związanym z ubytkiem, a podobne szwy zostaną użyte do zamknięcia płatków w innych obszarach międzyzębowych. Dwa tygodnie po operacji zostanie przeprowadzona obserwacja kliniczna pod kątem prawidłowego gojenia lub obecności niepożądanej reakcji tkankowej, a następnie usunięcie szwów.

Seria przypadków dla inżynierii tkankowej W serii przypadków (pięć) mających podobne kryteria włączenia/kryteria jak powyżej, ale bez przechodzenia przez randomizację, inżynieria tkankowa jest stosowana zgodnie z tą samą metodologią, co w grupie A. W tych przypadkach konstrukt inżynierii tkankowej (biokompleks) jest stosowane w leczeniu izolowanych ubytków międzyzębowych przyzębia nowo opracowaną techniką chirurgiczną tzw. „zamkniętą techniką chirurgiczną”. W skrócie, technika ta polega na retrakcji płatków dziąsłowych w sposób zamknięty, bez preparowania tkanek miękkich lub brodawek międzyzębowych. Technika ta minimalizuje uraz tkanek, dyskomfort pooperacyjny i poprawia estetykę tkanek miękkich.

Opieka pooperacyjna Ból pooperacyjny będzie kontrolowany za pomocą Ibuprofenu (600 mg) pod koniec zabiegu chirurgicznego i 12 godzin później, jeśli ból będzie odczuwalny. Amoksycylina (500 mg / 8 godzin przez pięć dni) zostanie przepisana wszystkim uczestnikom. Wszyscy pacjenci zostaną poinstruowani, aby stosowali 0,12% chlorheksydynę dwa razy dziennie i unikali szczotkowania, nitkowania i twardego żucia w leczonym obszarze przez cztery tygodnie. W ciągu tego 4-tygodniowego okresu, w odstępach dwutygodniowych zostanie wprowadzony rygorystyczny program pooperacyjnej opieki podtrzymującej, po czym pacjenci zaprzestaną płukania roztworem chlorheksydyny i powrócą do higieny jamy ustnej. Czyszczenie przestrzeni międzyzębowych rozpocznie się sześć tygodni po operacji dla wszystkich grup. Następnie pacjenci będą obserwowani w wieku trzech, sześciu i 12 miesięcy w celu leczenia podtrzymującego przyzębia.

Zapisy kliniczne Zapisy przyzębia pełnej jamy ustnej i miejsca, w tym BOP; wskaźnik płytki nazębnej (obecność/brak płytki nazębnej); PPD i CAL zostaną określone przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej (Hu-Friedy XP-23/QW) z dokładnością do milimetra w sześciu miejscach na ząb i równolegle do długiej osi w czterech punktach czasowych; linia bazowa, 6-, 9-, 12-miesięczna. Pomiary kliniczne w wyznaczonych miejscach (ubytki podkostne) zostaną określone przed operacją i przed znieczuleniem (linia wyjściowa). Ocena śródoperacyjna zostanie przeprowadzona jednorazowo w trakcie zabiegu.

Śródoperacyjna ocena kliniczna Morfologia ubytku (jedno-, dwu-, trójścienna lub kombinacja) zostanie określona śródoperacyjnie na podstawie liczby ścian kości związanych ze zmianą; Odległość między połączeniem cementowo-szkliwnym a dnem ubytku (CEJ-BD) zostanie określona w mm; Odległość od CEJ do najbardziej koronowego poziomu interproksymalnego grzebienia kości (CEJ-BC) zostanie określona w mm; Całkowita głębokość ubytku: odległość między grzebieniem kości a dnem ubytku (BC-BD) zostanie określona w mm; Szerokość szerokości ubytku (pozioma odległość między grzebieniem kości a powierzchnią korzenia) zostanie określona w mm.

Jeśli CEJ nie jest wykrywalny z powodu odbudowy szyjki macicy, margines odbudowy (RM) będzie służył jako punkt odniesienia dla pomiarów klinicznych i radiograficznych.

Ocena radiograficzna Wewnątrzustna radiografia cyfrowa zostanie wykorzystana do określenia regeneracji kości ubytków podkostnych w sześciu punktach czasowych; linia wyjściowa, 6 tygodni, 3, 6, 9, 12 miesięcy. Standaryzowane cyfrowe radiogramy okołowierzchołkowe (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Paryż, Francja) zostaną uzyskane przy użyciu techniki równoległej długiego stożka. Aby ustandaryzować geometrię ekspozycji, dostosowany blokada zgryzu z elastycznego materiału wyciskowego zostanie dopasowana do uchwytu czujnika, przechowywana w szczelnych plastikowych pojemnikach w temperaturze pokojowej i będzie ponownie używana podczas każdej ponownej wizyty radiologicznej.

W podobny sposób jak w przypadku oceny śródoperacyjnej na zdjęciach rentgenowskich zostaną określone anatomiczne punkty orientacyjne: połączenie cementowo-szkliwne (CEJ), najbardziej koronowy poziom kości wyrostka zębodołowego (BC) oraz wierzchołkowy stopień ubytku kostnego ( BD). Bardziej szczegółowo zostanie określona lokalizacja CEJ; najbardziej koronowy obszar, w którym więzadło ozębnej zachowuje równą szerokość, zostanie zidentyfikowany na radiogramie, aby wskazać najbardziej wierzchołkowe rozszerzenie utraty kości. Ubytek podkostny zostanie obliczony poprzez pomiar szerokości ubytku w części czołowej i u podstawy; odległość między CEJ-BD a BC-BD; odległość między CEJ-BC; kąt między pionową osią korzenia a ścianą kości międzyzębowej (Tonetti i wsp. 1993). Ocena radiograficzna regeneracji kości zostanie zdefiniowana na monitorze o wysokiej rozdzielczości przez tego samego skalibrowanego egzaminatora, który nie zna sposobu leczenia i nie ma dostępu do wcześniejszych zapisów. Oceny zostaną przeprowadzone za pomocą narzędzia pomiarowego do pomiarów numerycznych (oprogramowanie VixWin™ Platinum|Gendex) w odniesieniu do metalowego pręta o standardowej długości (5 mm), który zostanie przymocowany do czujnika.

Pobieranie próbek Próbki będą pobierane w następującej kolejności w sześciu punktach czasowych; linia wyjściowa, 6 tygodni, 3, 6, 9, 12 miesięcy.

(i) Ślina Ślina będzie zbierana przed klinicznymi pomiarami periodontologicznymi lub jakąkolwiek interwencją periodontologiczną i generalnie rano po całonocnym poście, podczas którego badani proszeni są o powstrzymanie się od picia (z wyjątkiem wody) lub żucia gumy. Próbki całej śliny będą pobierane przez odkrztuszanie do probówek polipropylenowych o pojemności 30 ml przez 5 minut.

(ii) Próbki płynu dziąsłowego GCF Gingival zostaną pobrane z międzyzębowych aspektów ubytku w policzkach. Przed pobraniem GCF powierzchnie zostaną delikatnie wysuszone powietrzem i odizolowane od śliny poprzez umieszczenie wacików i użycie ślinociągu. Następnie płytka naddziąsłowa zostanie ostrożnie usunięta sterylnymi kiretami i paski bibuły (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) zostaną umieszczone w kieszonce przyzębnej, aż do wyczucia lekkiego oporu przez 30 sekund. Podczas umieszczania pasków należy zachować ostrożność, aby uniknąć urazów mechanicznych, a paski zanieczyszczone krwią zostaną wyrzucone. Każdy pasek na pacjenta będzie przechowywany w oddzielnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywany w temperaturze -70°C. Przed użyciem białka na paskach będą eluowane w 500 µl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej BSA (1% obj./obj.).

(iii) Płytka nazębna Po pobraniu GCF płytka poddziąsłowa zostanie pobrana z wyznaczonego miejsca. Obszar pobierania próbek zostanie odizolowany od śliny, delikatnie osuszony powietrzem i po upewnieniu się, że naddziąsłowe złogi płytki nazębnej nie są obecne, dwa sączki papierowe zostaną umieszczone w kieszonce przyzębnej na 30 sekund i pobrana zostanie próbka zbiorcza. Przed obróbką wszystkie próbki będą przechowywane w probówkach Eppendorf (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) w temperaturze -80°C. Papierowe sączki zostaną użyte do pobrania płytki bakteryjnej w celu uniknięcia mechanicznego uszkodzenia tkanek przyzębia.

Zarządzanie danymi Badacze muszą zapewnić zachowanie anonimowości osoby badanej. We wszelkich dokumentach związanych z badaniem osoby badane powinny być identyfikowalne wyłącznie na podstawie ich inicjałów, płci i/lub numeru podmiotu. Dane osobowe (tj. karty medyczne) będą przechowywane w oddzielnym, bezpiecznym miejscu, z dala od innych danych związanych z badaniem, z ograniczonym dostępem wyłącznie do głównego badacza.

Proces świadomej zgody Główny badacz jest odpowiedzialny za uzyskanie pisemnej zgody uczestnika. Formularz świadomej zgody będzie składał się z dwóch oddzielnych dokumentów; formularz informacyjny podmiotu i formularz podpisu świadomej zgody podmiotu; oba dokumenty zostaną zatwierdzone przez komisję etyczną Szkoły Stomatologicznej AUT przed badaniem. Formularz informacyjny dla uczestnika będzie zawierał odpowiednie wyjaśnienie celów, zadań, metod, przewidywanych korzyści i potencjalnych zagrożeń związanych z badaniem w rodzimym, nietechnicznym języku, który jest zrozumiały dla uczestnika. Główny badacz musi wtedy zapewnić uczestnikowi wystarczająco dużo czasu na przeczytanie i zrozumienie formularza świadomej zgody oraz na rozważenie udziału w badaniu klinicznym. Główny badacz i uczestnik muszą podpisać i opatrzyć datą formularz, zanim uczestnik będzie mógł uczestniczyć w badaniu klinicznym. Każdemu uczestnikowi zostanie następnie wydana kopia należycie podpisanego i opatrzonego datą formularza świadomej zgody oraz wszelkie inne pisemne informacje.