多発性硬化症活性とヒト内因性レトロウイルスタイプWおよびヘルペスウイルスの発現と臨床およびMRIの比較

背景/根拠:

多発性硬化症 (MS) は、脊髄 (特に後部脊髄) に影響を与える炎症性脱髄疾患です。 MS の臨床的不均一性は十分に説明されていますが、現在、MS の病変と中枢神経系 (CNS) の病理学的破壊に関与するメカニズムも不均一であることが知られています。 これは多因子性疾患であり、1 つの免疫病原性メカニズムが鞘ミエリンの破壊の原因であると示唆されています。

しかし、MS の炎症性関節病変の病理学は、CNS ミエリンの成分に対する特定の自己免疫応答が、ミエリンの破壊に重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。 この概念は、主要組織適合複合体 (MHC) の遺伝子座との連鎖による脳脊髄液中の高レベルのオリゴクローナル免疫グロブリン G (IgG)、MS 病変におけるミエリンに反応する B および T 細胞の拡大、およびミエリンタンパク質は、動物に MS 様疾患である実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) を誘発します。

ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質 (MOG) のミエリン関連糖タンパク質を含む、さまざまなミエリンタンパク質に対する自己反応性が、MS 患者で観察されています。

ただし、MS 患者の T 細胞は、他のミエリンタンパク質に関連して MOG に対して優勢な活性を示し、MS の急性病変における軸索周囲のミエリンの崩壊に関連して抗 MOG 抗体が同定されたことに注意してください。 さらに、MOG による感作は、げっ歯類モデルおよび霊長類における MS の臨床的および脱髄変性病理を再現します。

MS の感染病因も仮定されており、数年にわたって、免疫病理学を引き起こす多くの異なるウイルスが示唆されてきました。 EBV、水痘帯状疱疹ウイルス、風疹ウイルスの抗体が検出された一方で、特定のタンパク質であるヒト内因性レトロウイルス (HERV)、特に HERV-W ファミリーが、MS 患者の血液および脳病変で検出されました。

HERV は、外因性レトロウイルスによる生殖系列の宿主細胞の古代の感染から生じ、今日ではヒトゲノムの約 8% を構成しています。

レトロウイルス多発性硬化症関連 (MRSV) は、逆転写酵素活性を持つエンベロープウイルスであり、HERV-W ファミリーのヒトゲノムの原型を表しています。

MRSV は軟髄膜、脈絡叢、および MS 患者の単球/マクロファージの培養で分離され、その起源はまだ調査中です。 粒子は、変更された MSRV プロウイルス HERV-W に由来するか、同じ外因性ファミリーのメンバーから伝達されることが示唆されています。 MSRV ビリオンはスーパー抗原などの特性を持ち、末梢血の単核細胞によるサイトカインの産生を誘導します。

逆転写酵素活性 (RT) に関連付けられている HERV 粒子は、MSRV からの発現の特徴であることが確認されました。 RT PCRによるMSRVビリオンの検出のためのプロトコルは、患者の血清および脳脊髄液(CSF)中のそれらの存在を検出するために設計されました。

MS 患者と対照集団を対象とした独立した研究では、再発寛解型 MS が二次進行型 (SP-MS) に移行するなど、MS と MSRV とその予後との間に相関関係があることが示されました。

並行研究は、MSRV ビリオンの免疫病因を示し、MSRV のエンベロープタンパク質 (Env) が炎症誘発性および超抗原性免疫の原因であることを特定しました。 Env 抗原は、脳の死後研究で MS 患者から検出されました。

MSに関連する環境ウイルスによるHERV-Wプロモーターのトランス活性化は、宿主ゲノムに存在する場合、HERV-Wのエピジェネティックな調節不全を誘発することも示されています。

確かに、MS に関連する最も重要なヘルペス ウイルスは EBV であり、EBV 血清学と MS の発症との比率が広く研究されています。 さらに、EBV と免疫系との相互作用は否定できず、持続的な免疫応答とリンパ球の不死化につながります。 EBV の発現と MS のより大きな活性を関連付ける研究もあります。 最後に、EBV と内在性レトロウイルスとの相互作用は、最近の興味深い研究分野です。

EBV は、1971 年に MS の潜在的な原因として関与した最初のヘルペス ウイルス科のメンバーでした。 EBV は、いくつかの要因により候補となる可能性があります。それは、自然界に広まっており、再活性化の期間のために継続的な生産を行い、ヒトの免疫系を調節する、長期間の休止状態のウイルス感染を必要とします。

MS を関連付けて EBV が自己免疫疾患の発症前に発生したウイルス感染であることを証明することの難しさ。 ポール等。は、ヨーロッパのMS患者（子供）のEBV血清陽性が、ウイルス抗体が72％で見つかった対照群と比較して99％高いことを示しました。

レビン等。 MS の前に血清抗体価によってウイルス感染の時間を推定し、対照群と比較しました。 この研究では、血液サンプルを保管していた米陸軍の約 800 万人の従業員の医療記録にアクセスできました。 このグループのうち、305 人が後に MS を発症するようになった症例対照研究と、選択された 610 人の対照被験者がペアにされました。 MS を発症した 10 例と 32 例の対照は、最初は EBV 血清反応陰性でした。 セロコンバートしたコントロールのわずか 35.7% と比較して、すべてのケースが MS の前に陽性の EBV になりました。

他の研究では、EBV に対する抗体価と MS の発症との関係を評価することも試みられています。 De Lorenze らの研究によると、MS 患者は、MS の最初の症状の 20 年前に抗体が大幅に増加していました。 この事実は 2 つの方法で説明できます: EBV 受容体細胞 (記憶 T 細胞) のバランスを変更する以前の感染の存在、または異なる株の EBV による再感染です。

EBV は B リンパ球に感染し、持続的に高い免疫原性を示します。 抗原特異的細胞傷害性 T リンパ球は、一次感染および高ウイルス血症に応答して継続的に産生され、数が増加します。 この免疫制御は、EBV 関連の悪性腫瘍を予防するために不可欠です。 その調節作用において、潜伏抗原の発現を介して感染した B リンパ球を救出し、ウイルスが持続するメモリー B 細胞への分化を助けます。 ただし、EBV に特異的な T 細胞の増加が、ミエリン抗原の特異的認識による刺激の増加に対する応答であるかどうかは確立されていません。 EBV ウイルス負荷は MS ではあまり高くなく、さらに、このウイルスに特異的な T 細胞は、MS のない宿主の同じ細胞と区別されないようです。

別の研究者は、MS の再活性化の期間中、寛解期間に関連してウイルス複製の活動が増加していると述べています。 EBV の早期抗原に対する抗体反応を示す患者は、液性反応のない患者と比較して、ガドリニウムを使用した MRI で測定した場合、疾患活動性を示す可能性が高くなります。 これらのデータから、この疾患の活動性は潜伏性 EBV 感染および疾患の進行に関連している可能性があると考えるに至りました。

サイトメガロ ウイルス (CMV) と MS に対する抗体のレベルを関連付ける研究は、物議を醸しています。 ほとんどの結果は、MS 患者の CMV 感染率が高いことを示していますが、一方で、疾患の軽度の症状が観察されています。

一部の研究者は、MS および健常者における抗 CMV 抗体の存在を調べました。 彼らは、対照群の52％と比較して、MS患者の98％で陽性を発見しました.

別の研究者は、CMVに対する抗体を持っている患者は、病気の発症年齢が高く、病気の再発率が低く、MRIでの脳萎縮の兆候が少ないことを示しました. これらの抗体の力価が高い患者は、力価が低い患者と比較して、脳の萎縮が少なく、画像検査で病変が少なかった. MS のパターンを模倣した動物モデルは、臨床症状の前に CMV 感染脱髄フレームを持つ動物が感染していない動物よりも弱いことを示しました。 これらの研究は、MS の免疫応答に対する CMV 感染の有益な調節効果を示唆しています。

ヘルペス ウイルス (HHV-6 と HHV-7) は密接に関連しており、同様の生物学的パターンを持っています。 これらのウイルスは、免疫系の細胞に感染し、その機能を調節することができます。 Krukle-Nora らによって記述された作業。患者の末梢血を分析することにより、MS における HHV-6 と HHV-7 の関連性を調査しようとしました。 患者は無作為に選択され、02 群に分けられました。 すべての研究患者は、免疫抑制剤を使用せずに少なくとも 3 か月間過ごしました。 28 人の患者のうち、25 人が潜在的な HHV-6 感染および/または HHV-7 を持っていました。 HHV-6 は、RR-MS の 9 人の患者と SP-MS の 9 人の患者で発見されました。 HHV-7 は、RR-MS で 10 人の患者、SP-MS で 14 人の患者で発見されました。

2 人の研究者が、蛍光 in situ ハイブリダイゼーションの技術を使用して、MS 患者の罹患組織および疾患のない脳サンプルの白質における初期および後期ウイルス遺伝子の発現を評価するために、ヒト死体組織を調べました。 HHV-6 の遺伝子はすべてのサンプルで検出され、オリゴデンドロ サイトに限定されていました。 ウイルス RNA の発現の定量分析は、MS 患者の両方のグループ (白質の変化がある脳組織とない脳組織) で、サンプルがこのウイルスの発現レベルが有意に高いことを示しました。 さらに、彼らは、損傷した組織がより高いウイルス発現と相関していることを示しました.HHV-6の理論に寄与する事実は、MSの病因に関係しています.

ウイルスに対してこれらすべての方法を使用すると、相反する結果が観察されました。 実際、使用された技術が HHV-6 による潜伏感染と活動性感染を区別することができなかった場合 (血液からの白血球、細胞を含む脳脊髄液、および CNS の組織の分析による)、サンプル患者と患者の間で違いは見られませんでした。コントロールグループ。 しかし、特にHHV-6の活性を検出するために診断技術を使用すると、HHV-6とMSの病因との間に強い相関関係が観察されます。 私たちのグループは最近、HERV-W と MOG のエンベロープタンパク質の類似性レベルを調査しました。 エンベロープ MOG の比較により、HERV-W の考えを拡張する MOG 様の 5 つの IgG 様ドメインが、おそらく免疫系 MOG レトロウイルス領域による認識を促進するために、MS の免疫病因に関与している可能性があることが確認されました。 また、ほとんどの患者がある程度のHERV-Wエンベロープの発現を示したことも示しました。 テストした 10 個のサンプルのうち 9 個の HERV-W エンベロープの発現レベルは、健康なコントロールでは非常に低い発現レベルまたは活性がないのに対し、中レベルから高レベルであり、集団における MS 活性と HERV-W との関連性が確認されました。

イタリアでの最近の研究では、EBV が in vitro で血液および脳の細胞で HERV-W の発現を刺激することが示されました。 彼らは、MS の病因には、数年後に MS の最初の引き金として EBV が含まれるモデルが考えられることを示唆しており、HERV-W が MS の病原性に現実的であることを示しており、寛解型の疾患の挙動と並行して際立っています。原告の寄稿者。

目的:

主な目的: MS 患者の血液中の HERV-W およびヘルペスウイルス科のウイルスの定量的評価と、MS 活動の臨床的および画像化を関連付けます。

副次的な目的:

HERV-W とヘルペス ウイルスの発現を評価し、MS 患者と他の神経疾患の有無にかかわらず健康なコントロールのウイルス発現を比較します。

意義：

MS は、遺伝的および環境的病因を伴う多因子疾患です。 因果関係を確立するために、関連する要因に対する研究者の関心は非常に高いものです。 いくつかのウイルスは、病因と病気の活動に関連付けられています。 ヘルペス ウイルスと HERV-W ウイルスは、MS の活動との因果関係を確立する試みにおいて最も重要ですが、病因と疾患の発症におけるこれらのウイルスの役割については、今まで多くの疑問が残されています。

仮説：

この研究により、MS に関連する病因と炎症活動に関するより多くの可能性のある答えが見つかることが期待されており、したがって、この病状に向けられたますます特異的で効果的な治療法の処方に役立つ、より一貫したデータが提供されます。

方法:

最初に、市販のキットを使用して、参加者の血清中の IgG および免疫グロブリン M (IgM) 抗 EBV および CMV 抗体を検出するために、すべてのサンプルを ELISA イムノアッセイによって分析します。

核酸抽出は、製造元の指示に従って (DNA および RNA) 実行されます。 RNA の純度とサンプル中の DNA の不在を確保するためのすべてのプロトコルは、発現の分析 (したがって転写産物の検出) に採用されます。 したがって、核酸は、ＤＮＡｓｅで処理され、ＲＴ－ＰＣＲ ＨＥＲＶ－Ｗによって検証される。 RNA を含むサンプルのみが転写され、さらに分析されます。 ＨＥＲＶ－ＷファミリーのサブタイプＭＳＲＶに特異的な定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により、単核細胞（ＰＢＭＣ）上でＨＥＲＶ－ＷのＲＮＡ定量化を行う。

ヘルペスウイルス DNA の検出は、最初に 2 セットのプライマー (HSVPAN および VZVPAN) を使用した PCR によって行われます。 増幅後、ヒトヘルペスウイルス 6 (6A および 6B) を含む 8 種類のヘルペスウイルスをタイピングするために、BamHI および BstUI で酵素消化を行います。 陽性であることが証明されたサンプルについては、特定のウイルスについて qRT-PCR が行われます。

デザイン：

生物学的材料と対照群の存在を収集した前向き縦断研究が行われます。 このプロジェクトは、自由かつインフォームド コンセントの期間を通じて、個人によって分析されます。 同意書に署名することによってのみ、患者はこの調査に参加することができます。

神経科の外来診療所（CATEMおよびその他の専門分野）からの患者の血液サンプルは、資格のある専門家による定期的な訪問中に行われます. 血液銀行からの患者の血液は、定期的に行われる検査と併せて収集されます。 収集されたすべての資料は、サンパウロ大学熱帯医学研究所のウイルス学研究所に送られ、そこで検査が行われます。

患者は、再発の年率、EDSSスケールの増加、およびMRIでの頭蓋病変の増加を分析することにより、臨床的および画像的疾患活動性の程度について評価され、Freedmanらによって提案された基準に従ってMILD、MODERATE、およびSEVEREに分類される疾患活動性が評価されます。 頭蓋 MRI は、MS および他の神経疾患のグループに対してのみ実行されます。

統計的方法:

臨床検査結果の後、データは分析され、パラメトリックおよびノンパラメトリック ツールを使用して、その統計的解釈および疾患の活動性との比較に必要な処理が行われます。 Student-t および Mann-Whitney 検定を使用して、臨床、人口統計、および検査パラメーター間の関連性を評価します。 帰無仮説を棄却する alpha = 0.05 または 5% の有意水準は固定されます。

サンプルサイズの計算:

サンプル サイズは、PBMC で検出可能な HERV-W の発現を示す MS を含む集団と含まない集団の割合に基づいて決定されました。 活性レトロウイルスエンベロープを示す MS 患者の数は 95% に近いですが、サンプル計算ではより保守的な値を想定しています。 したがって、ケースとコントロールの発現がそれぞれ 50% と 10% であると仮定すると、Kelsey 法によると、80% を検出する信頼水準 = 95% の検出力に基づいて、28 のケースと 28 のコントロールのサンプル サイズが必要です。 したがって、研究者は 3 つのグループ (MS あり、MS およびその他の神経疾患なし) を分析するため、合計 N は 84 人の被験者で、グループあたり 28 人です。