Сравнение между клинической и МРТ-активностью рассеянного склероза и экспрессией эндогенного ретровируса человека типа W и вируса герпеса

Предыстория/обоснование:

Рассеянный склероз (РС) — воспалительное демиелинизирующее заболевание, поражающее спинной мозг (особенно задние отделы). Клиническая гетерогенность РС хорошо описана, но в настоящее время известно, что поражения РС и механизмы, лежащие в основе патологического поражения центральной нервной системы (ЦНС), также неоднородны. Это многофакторное заболевание, при котором предполагается, что один иммунопатогенный механизм отвечает за разрушение миелиновой оболочки.

Однако патология воспалительных поражений суставов при РС предполагает, что специфические аутоиммунные реакции против компонентов миелина ЦНС могут играть решающую роль в разрушении миелина. Эта концепция подтверждается высоким уровнем олигоклонального иммуноглобулина G (IgG) в спинномозговой жидкости за счет связи с локусом главного комплекса гистосовместимости (MHC), экспансией В- и Т-клеток, реагирующих на миелин в поражениях РС, и тем фактом, что иммунизация белки миелина индуцируют у животных заболевание, подобное рассеянному склерозу, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ).

У пациентов с рассеянным склерозом наблюдалась аутореактивность различных белков миелина, включая основной белок миелина, протеолипидный белок и миелин-ассоциированный гликопротеин в миелиновом олигодендроцитном гликопротеине (MOG).

Однако отмечается, что Т-клетки больных РС проявляют преобладающую активность в отношении МОГ по отношению к другим белкам миелина, а анти-МОГ-антитела были идентифицированы в связи с распадом миелина вокруг аксонов при острых поражениях РС. Кроме того, сенсибилизация МОГ воспроизводит клиническую и демиелинизирующую дегенеративную патологию РС на моделях грызунов и приматов.

Также была постулирована инфекционная этиология РС, и в течение нескольких лет предполагалось, что ряд различных вирусов вызывают иммунопатологию. Выявлены повышенные титры антител к ВЭБ, вирусам ветряной оспы и краснухи, а специфические белки эндогенных ретровирусов человека (HERV), в частности семейства HERV-W, обнаружены в крови и очагах поражения головного мозга у больных РС.

HERV возник в результате древних инфекций клеток-хозяев зародышевой линии экзогенными ретровирусами и сегодня составляет около 8% генома человека.

Ретровирус, ассоциированный с рассеянным склерозом (MRSV), представляет собой оболочечный вирус с активностью обратной транскриптазы, который представляет собой прототип генома человека семейства HERV-W.

MRSV был выделен в лептоменингисе, сосудистом сплетении и в культурах моноцитов/макрофагов больных РС, и их происхождение все еще исследуется. Было высказано предположение, что частицы происходят из модифицированного провируса MSRV HERV-W или передаются от члена того же экзогенного семейства. Вирионы MSRV обладают такими свойствами, как суперантигены, они индуцируют продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека.

Было подтверждено, что частицы HERV, связанные с активностью обратной транскриптазы (RT), являются отличительной чертой экспрессии MSRV. Протокол обнаружения вирионов MSRV с помощью ОТ-ПЦР был разработан для выявления их присутствия в сыворотке и спинномозговой жидкости (ЦСЖ) пациента.

Независимые исследования пациентов с РС и контрольной популяции показали корреляцию между РС и MSRV и его прогнозом, включая преобразование рецидивирующе-ремиттирующего РС во вторично-прогрессирующую форму (ВП-РС).

Параллельные исследования показали иммунопатогенез вирионов MSRV и идентифицировали оболочечный белок (Env) MSRV как ответственный за провоспалительный и суперантигенный иммунный ответ. Антиген Env был обнаружен у больных рассеянным склерозом при посмертном исследовании головного мозга.

Также было показано, что трансактивация промоторов HERV-W вирусом из окружающей среды, ассоциированным с РС, вызывает эпигенетическую дисрегуляцию в HERV-W, когда он присутствует в геноме хозяина.

Безусловно, наиболее важным вирусом герпеса, связанным с РС, является EBV, соотношение между серологией EBV и развитием РС тщательно изучалось. Кроме того, взаимодействие между EBV и иммунной системой неоспоримо, что приводит к стойкому иммунному ответу и иммортализации лимфоцитов. Есть также исследования, которые связывают экспрессию ВЭБ с большей активностью РС. Наконец, взаимодействие между EBV и эндогенными ретровирусами является недавней и увлекательной областью исследований.

ВЭБ был первым представителем семейства Herpesviridae, который в 1971 году был назван потенциальной причиной рассеянного склероза. ВЭБ является возможным кандидатом из-за нескольких факторов: он широко распространен в природе, требует длительной покоящейся вирусной инфекции, имеет непрерывную продукцию в связи с периодами реактивации и модулирует иммунную систему человека.

Трудность связать РС с доказательством того, что ВЭБ является вирусной инфекцией, возникшей до начала аутоиммунного заболевания. Поль и др. показали, что EBV-серопозитивность у больных РС в Европе (дети) - была на 99% выше при сравнении с контрольной группой, к которой антитела к вирусу были обнаружены у 72%.

Левин и др. оценивали время вирусной инфекции по титру сывороточных антител до МС и сравнивали с контрольной группой. Это исследование имело доступ к медицинским записям примерно 8 миллионов служащих армии США, у которых хранились образцы крови. Из этой группы исследование случай-контроль, в котором 305 человек пришли к более позднему развитию рассеянного склероза, и 610 выбранных контрольных субъектов были объединены в пары; 10 случаев, у которых развился РС, и 32 контрольных пациента были изначально серонегативными по EBV. Все случаи стали положительными на EBV до MS, по сравнению с сероконверсией только в 35,7% контрольной группы.

В других исследованиях также предпринимались попытки оценить взаимосвязь между титрами антител против ВЭБ и началом рассеянного склероза. Согласно работе De Lorenze et al., у пациентов с РС за 20 лет до появления первых симптомов РС наблюдалось значительное повышение уровня антител. Этот факт можно объяснить двумя способами: наличием предшествующей инфекции, изменяющей баланс рецепторных клеток ВЭБ (Т-клеток памяти), или реинфекцией другим штаммом ВЭБ.

ВЭБ инфицирует В-лимфоциты и обладает стойкой высокой иммуногенностью. Антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты продуцируются постоянно, и их число увеличивается в ответ на первичную инфекцию и высокую виремию. Этот иммунный контроль необходим для предотвращения злокачественных новообразований, связанных с EBV. Благодаря своему модулирующему действию удается спасти инфицированные В-лимфоциты за счет экспрессии латентных антигенов и помогает им дифференцироваться в В-клетки памяти, где сохраняется вирус. Однако не установлено, является ли увеличение Т-клеток, специфичных для ВЭБ, ответом на усиление стимуляции путем специфического распознавания миелиновых антигенов. Вирусная нагрузка EBV не очень высока при РС, кроме того, Т-клетки, специфичные для этого вируса, по-видимому, не отличаются от тех же клеток у хозяев без РС.

Другой исследователь утверждает, что в периоды реактивации РС наблюдается повышенная активность репликации вируса по сравнению с периодами ремиссии. У пациентов с антигенным ответом на ранний антиген EBV более вероятно проявление активности заболевания по данным МРТ с гадолинием по сравнению с пациентами без гуморального ответа. Эти данные позволили нам предположить, что активность заболевания может быть связана как с латентной инфекцией ВЭБ, так и с прогрессированием заболевания.

Исследования, связывающие уровни антител против цитомегаловируса (ЦМВ) и РС, противоречивы. Хотя большинство результатов показывают высокие показатели ЦМВ-инфекции у пациентов с РС, с другой стороны, наблюдается более легкое течение заболевания.

Некоторые исследователи искали наличие антител против ЦМВ у РС и у здоровых людей. Они оказались положительными у 98% пациентов с РС по сравнению с 52% в контрольной группе.

Другие исследователи показали, что у пациентов, у которых были обнаружены антитела против ЦМВ, был более поздний возраст начала заболевания, более низкие показатели реактивации заболевания и меньшее количество признаков церебральной атрофии на МРТ. Те, у кого были более высокие титры этих антител, имели меньшую атрофию головного мозга и меньше поражений при визуализирующих тестах по сравнению с пациентами с более низкими титрами. Модель животных с имитацией паттернов РС продемонстрировала, что животные с ЦМВ-инфекциями с демиелинизирующим каркасом до клинических проявлений были слабее, чем неинфицированные. Эти исследования предполагают благотворное модулирующее влияние ЦМВ-инфекции на иммунный ответ при РС.

Вирусы герпеса (HHV-6 и HHV-7) тесно связаны между собой и имеют сходную биологическую структуру. Эти вирусы способны инфицировать клетки иммунной системы и модулировать их функции. Работа, описанная Krukle-Nora et al. попытались исследовать ассоциации между HHV-6 и HHV-7 при РС путем анализа периферической крови пациентов. Пациенты были отобраны случайным образом и разделены на 02 группы: 14 пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим РС (РР-РС) и 14 пациентов со вторично-прогрессирующим РС (ВП-РС). Все пациенты исследования находились не менее 3 мес без применения иммуносупрессивных препаратов. Из 28 пациентов у 25 была латентная инфекция HHV-6 и/или HHV-7. HHV-6 был обнаружен у 9 пациентов с RR-MS и у 9 с SP-MS. HHV-7 был обнаружен у 10 пациентов с RR-MS и у 14 с SP-MS.

Два исследователя, используя метод флуоресцентной гибридизации in situ, исследовали ткани трупа человека для оценки экспрессии ранних и поздних вирусных генов в белом веществе в пораженной ткани пациентов с РС и в образцах головного мозга без заболевания. Ген HHV-6 был обнаружен во всех образцах и был ограничен олигодендроцитами. Количественный анализ экспрессии вирусной РНК показал, что в обеих группах больных РС (ткань головного мозга с изменением белого вещества и без него) образцы имели достоверно более высокие уровни экспрессии этого вируса. Кроме того, они показали, что поврежденные ткани коррелируют с более высокой экспрессией вируса, факт, который способствует теории о том, что HHV-6 участвует в патогенезе РС.

При использовании всех этих методов для вируса наблюдались противоречивые результаты. Фактически, когда используемые технологии не позволяли отличить активную инфекцию ВГЧ-6 от латентной (по анализу лейкоцитов из крови, спинномозговой жидкости, содержащей клетки, и ткани ЦНС), между образцами пациентов и контрольная группа. Однако при использовании диагностических технологий специально для выявления активности ВГЧ-6 наблюдается сильная корреляция между ВГЧ-6 и патогенезом РС. Наша группа недавно исследовала уровень сходства между белком оболочки HERV-W и MOG. Сравнение оболочки MOG идентифицировало пять IgG-подобных доменов MOG-подобного, расширяя представление о том, что HERV-W может быть вовлечен в иммунопатогенез MS, возможно, для облегчения распознавания иммунной системой MOG ретровирусных областей. Мы также показали, что у большинства пациентов наблюдалась экспрессия оболочки HERV-W на каком-то уровне. Девять из десяти протестированных образцов имели уровни экспрессии оболочки HERV-W от среднего до высокого по сравнению с очень низкими уровнями экспрессии или отсутствием активности у здоровых контролей, что подтверждает связь между активностью MS и HERV-W в нашей популяции.

Недавнее исследование в Италии показало, что ВЭБ стимулирует экспрессию HERV-W в клетках крови и головного мозга in vitro. Они предполагают, что патогенез РС, возможная модель, может включать ВЭБ в качестве начального триггера РС спустя годы, и показывает HERV-W как реальный фактор патогенности РС, что поразительно параллельно с поведением заболевания в его ремиттирующей форме. вкладчик заявитель.

Цели:

Основная цель: соотнести клиническую и визуализирующую активность РС с количественной оценкой HERV-W и вирусов семейства Herpesviridae в крови пациентов с РС.

Второстепенная цель:

Оцените экспрессию HERV-W и вируса герпеса и сравните экспрессию вирусов среди пациентов с РС и здоровых людей с другими неврологическими заболеваниями и без них.

Значение:

РС является многофакторным заболеванием с генетической и экологической этиологией. Велик интерес исследователей к сопутствующим факторам для установления причинно-следственной связи. Несколько вирусов были связаны с патогенезом и активностью заболевания. Хотя герпесвирусы и вирусы HERV-W являются наиболее важными в попытке установить причинно-следственную связь и с активностью РС, до сих пор остается открытым много вопросов о роли этих вирусов в этиологии и развитии заболевания.

Гипотеза:

Ожидается, что с помощью этой работы будет найдено больше возможных ответов на этиопатогенез и воспалительную активность, связанную с РС, и, таким образом, будут получены более согласованные данные, которые помогут разработать более специфические и эффективные методы лечения, направленные на эту патологию.

Методы:

Первоначально все образцы будут проанализированы с помощью иммуноферментного анализа на выявление IgG и иммуноглобулина М (IgM) антител к ВЭБ и ЦМВ в сыворотке участников с использованием коммерческих наборов.

Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) будет проводиться в соответствии с инструкциями производителя. Все протоколы для обеспечения чистоты РНК и отсутствия ДНК в образцах будут приняты при анализе экспрессии (и, следовательно, обнаружении транскриптов). Таким образом, нуклеиновые кислоты подвергают обработке ДНКазой и проверке методом ОТ-ПЦР HERV-W. Только образцы, содержащие РНК, будут расшифрованы и подвергнуты дальнейшему анализу. Количественное определение РНК HERV-W будет производиться на мононуклеарных клетках (PBMC) с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR), специфичной для подтипа MSRV семейства HERV-W.

Обнаружение ДНК вируса герпеса первоначально будет производиться с помощью ПЦР с использованием двух наборов праймеров (HSVPAN и VZVPAN). После амплификации проводят ферментативное расщепление BamHI и BstUI для типирования восьми типов вируса герпеса, включая вирус герпеса человека 6 (6А и 6В). Для образцов, которые окажутся положительными, будет проведена qRT-PCR для конкретных вирусов.

Дизайн:

Будет проведено проспективное лонгитюдное исследование со сбором биологического материала и наличием контрольной группы. Этот проект будет проанализирован отдельными лицами на условиях свободного и информированного согласия. Только подписав форму согласия, пациент сможет принять участие в этом исследовании.

Образцы крови пациентов из неврологической амбулатории (CATEM и другие специальности) будут взяты во время планового визита квалифицированного специалиста. Кровь пациентов из банка крови будет собираться одновременно с обычным обследованием. Все собранные материалы будут отправлены в вирусологическую лабораторию Института тропической медицины Университета Сан-Паулу, где будут проведены лабораторные исследования.

Пациенты будут оцениваться по степени клинической и визуальной активности заболевания путем анализа частоты рецидивов в годовом исчислении, увеличения по шкале EDSS и увеличения поражений черепа на МРТ, а также активности заболевания, классифицируемой как МЯГКАЯ, УМЕРЕННАЯ и ТЯЖЕЛАЯ в соответствии с критериями, предложенными Freedman et al. МРТ черепа будет проводиться только для групп с РС и другими неврологическими заболеваниями.

Статистические методы:

После получения результатов лабораторных исследований данные будут проанализированы и подвергнуты необходимой обработке для их статистической интерпретации и сравнения с активностью заболевания с использованием параметрических и непараметрических инструментов. Тесты Стьюдента-t и Манна-Уитни будут использоваться для оценки связи между клиническими, демографическими и лабораторными параметрами. Уровень значимости альфа = 0,05 или 5% для отклонения нулевой гипотезы будет фиксированным.

Расчет размера выборки:

Размер выборки определяли на основе процентной доли популяции с РС и без него, демонстрирующей обнаруживаемую экспрессию HERV-W в РВМС. Хотя число больных РС, у которых проявляет активность ретровирусная оболочка, близко к 95%, мы принимаем более консервативные значения для расчета выборки. Поэтому, предполагая экспрессию на 50 % и 10 % для случаев и контролей, соответственно, необходим размер выборки из 28 случаев и 28 контролей, исходя из уровня достоверности = 95 % мощности для обнаружения 80 % в соответствии с методом Келси. Таким образом, поскольку исследователи будут анализировать три группы (с РС, без РС и других неврологических заболеваний), общее N составляет 84 человека, по 28 человек в группе.