Vergleich zwischen klinischer und MRT-Multiple-Sklerose-Aktivität und Expression von humanem endogenem Retrovirus Typ W und Herpesvirus

Hintergrund/Begründung:

Multiple Sklerose (MS) ist eine entzündliche demyelinisierende Erkrankung, die das Rückenmark betrifft (insbesondere im hinteren Rückenmark). Die klinische Heterogenität von MS ist gut beschrieben, aber derzeit ist bekannt, dass Läsionen von MS und Mechanismen, die an der pathologischen Zerstörung des Zentralnervensystems (ZNS) beteiligt sind, ebenfalls heterogen sind. Es handelt sich um eine multifaktorielle Erkrankung, bei der ein immunopathogener Mechanismus für die Zerstörung des Scheidenmyelins verantwortlich gemacht wird.

Die Pathologie von entzündlichen Gelenkläsionen bei MS legt jedoch nahe, dass spezifische Autoimmunreaktionen gegen Komponenten des ZNS-Myelins eine entscheidende Rolle bei der Zerstörung von Myelin spielen können. Dieses Konzept wird unterstützt durch die hohe Konzentration an oligoklonalen Immunglobulin G (IgG) in der Zerebrospinalflüssigkeit durch die Verbindung mit dem Locus des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), die Expansion von B- und T-Zellen, die auf Myelin in MS-Läsionen reagieren, und die Tatsache, dass die Immunisierung mit Myelinproteine ​​induzieren bei Tieren eine MS-ähnliche Erkrankung, die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE).

Die Autoreaktivität für verschiedene Myelinproteine, einschließlich Myelin-Basisprotein, Proteolipidprotein und Myelin-assoziiertes Glykoprotein in Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), wurde bei Patienten mit MS beobachtet.

Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass T-Zellen von Patienten mit MS eine vorherrschende Aktivität gegen MOG im Vergleich zu anderen Myelinproteinen zeigen, und Anti-MOG-Antikörper wurden im Zusammenhang mit dem Zerfall des Myelins um Axone in akuten MS-Läsionen identifiziert. Darüber hinaus reproduziert die Sensibilisierung mit MOG die klinische und demyelinisierende degenerative Pathologie von MS in Nagetiermodellen und Primaten.

Eine infektiöse Ätiologie von MS wurde ebenfalls postuliert, und über mehrere Jahre hinweg wurde eine Reihe verschiedener Viren vorgeschlagen, um eine Immunpathologie auszulösen. Es wurden vermehrt Antikörper für EBV, Varizella-Zoster-Virus und Rötelnvirus nachgewiesen, während spezifische Proteine ​​humaner endogener Retroviren (HERV), insbesondere der HERV-W-Familie, im Blut und in Hirnläsionen von MS-Patienten nachgewiesen wurden.

HERV entstand aus alten Infektionen von Wirtszellen der Keimbahn durch exogene Retroviren und macht heute etwa 8 % des menschlichen Genoms aus.

Das Multiple-Sklerose-assoziierte Retrovirus (MRSV) ist ein umhülltes Virus mit reverser Transkriptase-Aktivität, das den Prototyp des menschlichen Genoms der HERV-W-Familie darstellt.

Das MRSV wurde in Leptomeningen, im Plexus choroideus und in Kulturen von Monozyten/Makrophagen von MS-Patienten isoliert und seine Herkunft wird noch untersucht. Es wurde vorgeschlagen, dass Partikel von MSRV-Provirus stammen, HERV-W modifiziert oder von einem Mitglied der gleichen exogenen Familie übertragen wurden. MSRV-Virionen haben Eigenschaften wie Superantigene, sie induzieren die Produktion von Zytokinen durch mononukleäre Zellen im peripheren menschlichen Blut.

Es wurde bestätigt, dass HERV-Partikel, die mit Reverse-Transkriptase-Aktivität (RT) assoziiert sind, ein Kennzeichen der Expression von MSRV sind. Ein Protokoll zum Nachweis von MSRV-Virionen durch RT-PCR wurde entwickelt, um ihre Anwesenheit im Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) des Patienten nachzuweisen.

Unabhängige Studien bei Patienten mit MS und Kontrollpopulationen zeigten Korrelationen zwischen MS und MSRV und ihrer Prognose, einschließlich der Umwandlung von schubförmig remittierender MS in ihre sekundär progrediente Form (SP-MS).

Parallele Studien zeigten die Immunpathogenese von MSRV-Virionen und identifizierten das Hüllprotein (Env) von MSRV als verantwortlich für die entzündungsfördernde und superantigene Immunität. Das Env-Antigen wurde bei MS-Patienten in Untersuchungen des postmortalen Gehirns nachgewiesen.

Es wurde auch gezeigt, dass die Transaktivierung der HERV-W-Promotoren durch mit MS assoziierte Umweltviren eine epigenetische Dysregulation in HERV-W induziert, wenn es im Wirtsgenom vorhanden ist.

Sicherlich ist das wichtigste mit MS assoziierte Herpesvirus EBV, das Verhältnis zwischen EBV-Serologie und der Entwicklung von MS wurde ausführlich untersucht. Darüber hinaus ist die Wechselwirkung zwischen EBV und dem Immunsystem unbestreitbar, was zu einer anhaltenden Immunantwort und Immortalisierung von Lymphozyten führt. Es gibt auch Studien, die die Expression von EBV mit einer größeren Aktivität von MS korrelieren. Schließlich ist die Wechselwirkung zwischen EBV und endogenen Retroviren ein neues und faszinierendes Studiengebiet.

EBV war das erste Mitglied der Herpesviridae-Familie, das 1971 als mögliche Ursache von MS in Verbindung gebracht wurde. EBV ist aufgrund mehrerer Faktoren ein möglicher Kandidat: Es ist in der Natur weit verbreitet, erfordert eine lange ruhende Virusinfektion, die aufgrund von Perioden der Reaktivierung eine kontinuierliche Produktion aufweist und das menschliche Immunsystem moduliert.

Die Schwierigkeit, MS in Verbindung zu bringen, um zu beweisen, dass EBV die Virusinfektion ist, trat vor dem Einsetzen der Autoimmunerkrankung auf. Pohlet al. zeigten, dass die EBV-Seropositivität bei Patienten mit MS in Europa (Kinder) - 99 % höher war im Vergleich zur Kontrollgruppe, in der bei 72 % Virus-Antikörper gefunden wurden.

Levin et al. schätzten den Zeitpunkt der viralen Infektion durch Antikörpertiter im Serum vor der MS und verglichen sie mit einer Kontrollgruppe. Diese Studie hatte Zugriff auf die Krankenakten von etwa 8 Millionen Mitarbeitern der US-Armee, die Blutproben aufbewahrt hatten. Aus dieser Gruppe wurde die Fall-Kontroll-Studie, bei der 305 Personen kamen, um später MS zu entwickeln, und 610 ausgewählte Kontrollpersonen gepaart; 10 Fälle, die MS entwickelten, und 32 Kontrollen waren anfänglich EBV-seronegativ. Alle Fälle waren vor der MS EBV-positiv geworden, verglichen mit nur 35,7 % der Kontrollen, die serokonvertierten.

Andere Studien haben ebenfalls versucht, die Beziehung zwischen Antikörpertitern gegen EBV und dem Ausbruch von MS zu beurteilen. Laut der Arbeit von De Lorenze et al. hatten Patienten mit MS 20 Jahre vor den ersten MS-Symptomen einen signifikanten Anstieg der Antikörper. Diese Tatsache kann auf zwei Arten erklärt werden: das Vorhandensein einer früheren Infektion, die das Gleichgewicht der EBV-Rezeptorzellen (Gedächtnis-T-Zellen) verändert, oder eine erneute Infektion mit einem anderen EBV-Stamm.

EBV infiziert B-Lymphozyten und ist anhaltend hoch immunogen. Die Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten werden als Reaktion auf eine Primärinfektion und eine hohe Virämie kontinuierlich produziert und zahlenmäßig erhöht. Diese Immunkontrolle ist wesentlich, um EBV-bedingte Malignome zu verhindern. Durch seine modulierende Wirkung gelingt es, infizierte B-Lymphozyten durch die Expression latenter Antigene zu retten und ihnen zu helfen, sich in Gedächtnis-B-Zellen zu differenzieren, in denen das Virus persistiert. Es ist jedoch nicht geklärt, ob die erhöhten T-Zellen, die für EBV spezifisch sind, eine Reaktion auf erhöhte Stimulation durch spezifische Erkennung von Myelin-Antigenen sind. Die EBV-Viruslast ist bei MS nicht sehr hoch, außerdem scheinen sich für dieses Virus spezifische T-Zellen nicht von denselben Zellen in Wirten ohne MS zu unterscheiden.

Ein anderer Forscher stellt fest, dass es während Phasen der MS-Reaktivierung eine erhöhte Aktivität der Virusreplikation im Verhältnis zu Phasen der Remission gibt. Patienten mit einer Antikörperreaktion auf frühes EBV-Antigen zeigen im Vergleich zu Patienten ohne humorale Reaktion mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Krankheitsaktivität, gemessen durch MRT mit Gadolinium. Diese Daten veranlassten uns zu der Annahme, dass die Krankheitsaktivität sowohl mit einer latenten EBV-Infektion als auch mit dem Fortschreiten der Krankheit zusammenhängen könnte.

Studien, die Antikörperspiegel gegen Cytomegalovirus (CMV) und MS korrelieren, sind umstritten. Obwohl die meisten Ergebnisse hohe CMV-Infektionsraten bei Patienten mit MS zeigen, wird andererseits eine mildere Präsentation der Krankheit beobachtet.

Einige Forscher suchten nach dem Vorhandensein von Anti-CMV-Antikörpern bei MS und gesunden Personen. Sie fanden bei 98 % der MS-Patienten positive Ergebnisse, verglichen mit 52 % in der Kontrollgruppe.

Ein anderer Forscher zeigte, dass Patienten, die Antikörper gegen CMV hatten: ein späteres Alter des Krankheitsbeginns, niedrigere Reaktivierungsraten der Krankheit und weniger Anzeichen einer zerebralen Atrophie im MRT aufwiesen. Diejenigen, die höhere Titer dieser Antikörper hatten, hatten weniger Hirnatrophie und weniger Läsionen bei bildgebenden Tests, verglichen mit Patienten, die niedrigere Titer hatten. Ein Tiermodell, das die Muster von MS nachahmte, zeigte, dass Tiere mit CMV-Infektionen, die den demyelinisierenden Rahmen vor der klinischen Präsentation aufwiesen, schwächer waren als diejenigen, die nicht infiziert waren. Diese Studien deuten auf einen vorteilhaften modulierenden Effekt einer CMV-Infektion auf die Immunantwort bei MS hin.

Die Herpesviren (HHV-6 und HHV-7) sind eng verwandt und haben ein ähnliches biologisches Muster. Diese Viren sind in der Lage, Zellen des Immunsystems zu infizieren und deren Funktionen zu modulieren. Die von Krukle-Nora et al. versuchten, Assoziationen zwischen HHV-6 und HHV-7 bei MS zu untersuchen, indem sie das periphere Blut von Patienten analysierten. Die Patienten wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in 02 Gruppen eingeteilt: 14 Patienten mit schubförmig remittierender MS (RR-MS) und 14 mit sekundär progredienter MS (SP-MS). Alle Studienpatienten waren mindestens 3 Monate ohne Anwendung von Immunsuppressiva. Von den 28 Patienten hatten 25 eine latente HHV-6-Infektion und/oder HHV-7. HHV-6 wurde bei 9 Patienten mit RR-MS und 9 mit SP-MS gefunden. HHV-7 wurden bei 10 Patienten mit RR-MS und 14 mit SP-MS gefunden.

Zwei Forscher, die die Technik der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verwendeten, untersuchten menschliche Leichengewebe, um die Expression von frühen und späten viralen Genen in der weißen Substanz in dem betroffenen Gewebe von Patienten mit MS und in Gehirnproben ohne Erkrankung zu bewerten. Das Gen von HHV-6 wurde in allen Proben gefunden und war auf Oligodendrozyten beschränkt. Die quantitative Analyse der Expression viraler RNA zeigte, dass in beiden Gruppen von MS-Patienten (Gehirngewebe mit und ohne Veränderung der weißen Substanz) die Proben dieses Virus signifikant stärker exprimierten. Darüber hinaus zeigten sie, dass die verletzten Gewebe mit einer höheren Virusexpression korrelierten, eine Tatsache, die zur Theorie beiträgt, dass HHV-6 in die Pathogenese von MS verwickelt ist.

Mit all diesen Methoden für Viren wurden widersprüchliche Ergebnisse beobachtet. In der Tat, wenn die verwendeten Technologien nicht in der Lage waren, eine aktive von einer latenten Infektion durch HHV-6 zu unterscheiden (durch Analyse von Leukozyten aus dem Blut, von Zellen enthaltender Zerebrospinalflüssigkeit und von Gewebe des ZNS), wurde kein Unterschied zwischen den Proben von Patienten und Patienten gefunden die Kontrollgruppe. Wenn jedoch diagnostische Technologien speziell zum Nachweis der Aktivität von HHV-6 verwendet werden, wird eine starke Korrelation zwischen HHV-6 und der Pathogenese von MS beobachtet. Unsere Gruppe hat kürzlich den Grad der Ähnlichkeit zwischen dem Hüllprotein von HERV-W und MOG untersucht. Ein Vergleich der MOG-Hülle identifizierte fünf IgG-ähnliche Domäne von MOG-ähnlicher Erweiterung der Idee, dass HERV-W an der Immunpathogenese von MS beteiligt sein könnte, vielleicht um die Erkennung retroviraler MOG-Regionen durch das Immunsystem zu erleichtern. Wir haben auch gezeigt, dass die meisten Patienten eine Expression der HERV-W-Hülle auf einem gewissen Niveau zeigten. Neun der zehn getesteten Proben wiesen ein mittleres bis hohes Maß an HERV-W-Hüllexpression gegenüber sehr niedrigen Expressionsniveaus oder keiner Aktivität bei gesunden Kontrollen auf, was den Zusammenhang zwischen MS-Aktivität und HERV-W in unserer Population bestätigt.

Eine kürzlich in Italien durchgeführte Studie zeigte, dass EBV die Expression von HERV-W in Blut- und Gehirnzellen in vitro stimuliert. Sie schlagen vor, dass die Pathogenese von MS, ein mögliches Modell, EBV Jahre später als anfänglichen Auslöser von MS beinhalten könnte, und zeigt, dass HERV-W tatsächlich zur Pathogenität von MS führt, in auffallender Parallele zum Verhalten der Krankheit in ihrer remittierenden Form Mitwirkender der Beschwerdeführer.

Ziele:

Primäres Ziel: Korrelation der klinischen und bildgebenden MS-Aktivität mit der quantitativen Bewertung von HERV-W und Viren der Herpesviridae-Familie im Blut von Patienten mit MS.

Sekundäres Ziel:

Bewerten Sie die Expression von HERV-W und Herpesvirus und vergleichen Sie die Virenexpression bei Patienten mit MS und gesunden Kontrollpersonen mit und ohne andere neurologische Erkrankungen.

Bedeutung:

MS ist eine multifaktorielle Erkrankung mit genetischer und umweltbedingter Ätiologie. Es ist groß das Interesse der Forscher an assoziierten Faktoren, um einen kausalen Zusammenhang herzustellen. Mehrere Viren wurden mit der Pathogenese und Krankheitsaktivität in Verbindung gebracht. Obwohl Herpesvirus und HERV-W-Viren die wichtigsten bei dem Versuch sind, einen kausalen Zusammenhang und mit der Aktivität von MS herzustellen, bleiben bis jetzt viele Fragen über die Rolle dieser Viren in der Ätiologie und Entwicklung von Krankheiten offen.

Hypothese:

Es wird erwartet, dass diese Arbeit mehr mögliche Antworten auf die Ätiopathogenese und entzündliche Aktivität im Zusammenhang mit MS findet und somit konsistentere Daten liefert, die bei der Formulierung immer spezifischerer und wirksamerer Therapien für diese Pathologie helfen werden.

Methoden:

Zunächst werden alle Proben mittels ELISA-Immunoassay zum Nachweis von IgG- und Immunglobulin M (IgM)-Anti-EBV- und CMV-Antikörpern im Serum der Teilnehmer unter Verwendung handelsüblicher Kits analysiert.

Die Nukleinsäureextraktion wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (DNA und RNA). Alle Protokolle, um die Reinheit der RNA und das Fehlen von DNA in den Proben sicherzustellen, werden bei der Analyse der Expression (und damit dem Nachweis von Transkripten) übernommen. Daher werden die Nukleinsäuren einer Behandlung mit DNAse und einer Überprüfung durch RT-PCR HERV-W unterzogen. Nur Proben, die RNA enthalten, werden transkribiert und einer weiteren Analyse unterzogen. Die RNA-Quantifizierung des HERV-W erfolgt an mononukleären Zellen (PBMC) durch eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), die für den Subtyp MSRV der HERV-W-Familie spezifisch ist.

Der Nachweis von Herpesvirus-DNA erfolgt zunächst durch eine PCR unter Verwendung von zwei Primersätzen (HSVPAN und VZVPAN). Nach der Amplifikation erfolgt ein enzymatischer Verdau mit BamHI und BstUI zur Typisierung der acht Herpesvirustypen einschließlich des humanen Herpesvirus 6 (6A und 6B). Bei positiven Proben wird eine qRT-PCR für bestimmte Viren durchgeführt.

Design:

Es wird eine prospektive Längsschnittstudie durchgeführt, die biologisches Material und die Anwesenheit einer Kontrollgruppe sammelt. Dieses Projekt wird von den Einzelpersonen während der Frist der freien und informierten Zustimmung analysiert. Nur durch Unterzeichnung der Einverständniserklärung kann der Patient an dieser Umfrage teilnehmen.

Blutproben von Patienten aus der neurologischen Ambulanz (CATEM und andere Fachrichtungen) werden während des Routinebesuchs durch eine qualifizierte Fachkraft entnommen. Das Blut der Patienten aus der Blutbank wird im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Untersuchung abgenommen. Alle gesammelten Materialien werden an das Virologielabor des Instituts für Tropenmedizin der Universität São Paulo geschickt, wo Labortests durchgeführt werden.

Die Patienten werden auf den Grad der klinischen und bildgebenden Krankheitsaktivität beurteilt, indem die annualisierte Rate von Schüben, Anstiege auf der EDSS-Skala und erhöhte Schädelläsionen im MRT und die Krankheitsaktivität analysiert werden, die gemäß den vorgeschlagenen Kriterien von Freedman et al. Die kraniale MRT wird nur für Gruppen mit MS und anderen neurologischen Erkrankungen durchgeführt.

Statistische Methoden:

Nach den Labortestergebnissen werden die Daten analysiert und erhalten die notwendige Behandlung für ihre statistische Interpretation und den Vergleich mit der Krankheitsaktivität unter Verwendung von parametrischen und nicht-parametrischen Werkzeugen. Die Student-t- und Mann-Whitney-Tests werden verwendet, um Zusammenhänge zwischen klinischen, demografischen und Laborparametern zu bewerten. Das Signifikanzniveau von Alpha = 0,05 oder 5 % zur Ablehnung der Nullhypothese wird festgelegt.

Berechnung der Stichprobengröße:

Die Probengröße wurde basierend auf dem Prozentsatz der Population mit und ohne MS bestimmt, die eine nachweisbare Expression von HERV-W in PBMC zeigte. Obwohl die Zahl der Patienten mit MS, die eine aktive Retrovirushülle aufweisen, bei fast 95 % liegt, gehen wir für die Stichprobenberechnung von konservativeren Werten aus. Unter der Annahme einer Expression von 50 % bzw. 10 % für Fälle bzw. Kontrollen ist eine Stichprobengröße von 28 Fällen und 28 Kontrollen erforderlich, basierend auf einem Konfidenzniveau von 95 %, um 80 % nach der Kelsey-Methode zu erkennen. Da die Ermittler also drei Gruppen (mit MS, ohne MS und andere neurologische Erkrankungen) analysieren werden, beträgt die Gesamtzahl N 84 Probanden, 28 pro Gruppe.