Comparaison entre l'activité clinique et IRM de la sclérose en plaques et l'expression du rétrovirus endogène humain de type W et du virus de l'herpès

Contexte/Justification :

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante qui affecte la moelle épinière (surtout dans les cordons postérieurs). L'hétérogénéité clinique de la SEP est bien décrite, mais on sait actuellement que les lésions de la SEP et les mécanismes sous-jacents impliqués dans la destruction pathologique du système nerveux central (SNC) sont également hétérogènes. Il s'agit d'une maladie multifactorielle dans laquelle un mécanisme immunopathogène est suggéré comme responsable de la destruction de la gaine de myéline.

Cependant, la pathologie des lésions articulaires inflammatoires de la SEP suggère que des réponses auto-immunes spécifiques contre des composants de la myéline du SNC pourraient jouer un rôle crucial dans la destruction de la myéline. Ce concept est étayé par le niveau élevé d'immunoglobuline G oligoclonale (IgG) dans le liquide céphalo-rachidien par liaison avec le locus du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC), l'expansion des cellules B et T réactives à la myéline dans les lésions de SEP et le fait que l'immunisation avec protéines de myéline induit une maladie semblable à la SEP chez les animaux, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).

L'autoréactivité pour diverses protéines de la myéline, y compris la protéine basique de la myéline, la protéine protéolipidique et la glycoprotéine associée à la myéline dans la glycoprotéine des oligodendrocytes de la myéline (MOG), a été observée chez des patients atteints de SEP.

On note cependant que les lymphocytes T des patients atteints de SEP présentent une activité prédominante contre le MOG par rapport aux autres protéines de la myéline, et des anticorps anti-MOG ont été identifiés liés à la désintégration de la myéline autour des axones dans les lésions aiguës de la SEP. De plus, la sensibilisation au MOG reproduit la pathologie dégénérative clinique et démyélinisante de la SEP chez les modèles rongeurs et primates.

Une étiologie infectieuse de la SEP a également été postulée et, sur plusieurs années, un certain nombre de virus différents ont été suggérés pour déclencher une immunopathologie. Des titres accrus d'anticorps ont été détectés, pour l'EBV, le virus varicelle-zona et le virus de la rubéole, tandis que des protéines spécifiques des rétrovirus endogènes humains (HERV), en particulier de la famille HERV-W, ont été détectées dans les lésions sanguines et cérébrales chez les patients atteints de SEP.

HERV est issu d'infections anciennes de cellules hôtes de la lignée germinale par des rétrovirus exogènes et constitue aujourd'hui environ 8% du génome humain.

Le rétrovirus associé à la sclérose en plaques (MRSV), est un virus enveloppé à activité transcriptase inverse, qui représente le prototype du génome humain de la famille HERV-W.

Le MRSV a été isolé dans des leptoméninges, dans le plexus choroïde et dans des cultures de monocytes/macrophages de patients atteints de SEP et leur origine est toujours à l'étude. Il a été suggéré que les particules proviennent du provirus MSRV HERV-W modifié, ou transmises par un membre de la même famille exogène. Les virions MSRV ont des propriétés telles que des superantigènes, ils induisent la production de cytokines par les cellules mononucléaires du sang humain périphérique.

Les particules de HERV associées à l'activité de transcriptase inverse (RT) ont été confirmées comme étant une caractéristique de l'expression de MSRV. Un protocole de détection du virion MSRV par RT PCR a été conçu pour détecter leur présence dans le sérum et le liquide céphalo-rachidien (LCR) du patient.

Des études indépendantes chez des patients atteints de SEP et des populations témoins ont montré des corrélations entre la SEP et le MSRV et son pronostic, y compris la conversion de la SEP récurrente-rémittente en sa forme progressive secondaire (SP-MS).

Des études parallèles ont montré l'immunopathogenèse des virions MSRV et identifié la protéine d'enveloppe (Env) du MSRV comme étant responsable de la pro-inflammatoire et de la superantigénicité immunitaire. L'antigène Env a été détecté sur des patients atteints de SEP dans des études sur le cerveau post-mortem.

Il a également été démontré que la transactivation des promoteurs de HERV-W par des virus environnementaux associés à la SEP induit une dérégulation épigénétique de HERV-W, lorsqu'il est présent dans le génome de l'hôte.

Le virus de l'herpès le plus important associé à la SEP est certainement l'EBV, le rapport entre la sérologie de l'EBV et le développement de la SEP a été largement étudié. De plus, les interactions entre l'EBV et le système immunitaire sont indéniables conduisant à une réponse immunitaire persistante et à l'immortalisation des lymphocytes. Il existe également des études qui corrèlent l'expression de l'EBV avec une plus grande activité de la SEP. Enfin, l'interaction entre l'EBV et les rétrovirus endogènes est un domaine d'étude récent et passionnant.

L'EBV a été le premier membre de la famille des Herpesviridae à être impliqué comme cause potentielle de SEP en 1971. L'EBV est un candidat possible en raison de plusieurs facteurs : il est répandu dans la nature, nécessite une longue infection virale quiescente qui a une production continue en raison de périodes de réactivation et module le système immunitaire humain.

La difficulté d'associer la SEP pour prouver que l'EBV est l'infection virale s'est produite avant l'apparition de la maladie auto-immune. Pohl et al. ont montré que la séropositivité à l'EBV chez les patients atteints de SEP en Europe (enfants) était supérieure de 99 % par rapport au groupe témoin, dont 72 % des anticorps anti-virus ont été trouvés.

Lévin et al. estimé le temps d'infection virale par les titres d'anticorps sériques avant la SEP et comparé à un groupe témoin. Cette étude a eu accès aux dossiers médicaux d'environ 8 millions d'employés de l'armée américaine qui avaient conservé des échantillons de sang. De ce groupe, l'étude cas-témoin où 305 personnes sont venues développer ultérieurement la SEP et 610 sujets témoins sélectionnés ont été appariés ; 10 cas qui ont développé la SEP et 32 ​​témoins étaient initialement séronégatifs à l'EBV. Tous les cas étaient devenus positifs à l'EBV avant la SEP, contre seulement 35,7 % des témoins qui se sont séroconvertis.

D'autres études ont également tenté d'évaluer la relation entre les titres d'anticorps contre l'EBV et l'apparition de la SEP. Selon les travaux de De Lorenze et al., les patients atteints de SEP présentaient une augmentation significative des anticorps 20 ans avant les premiers symptômes de la SEP. Ce fait peut s'expliquer de deux manières : l'existence d'une infection antérieure altérant l'équilibre des cellules réceptrices de l'EBV (lymphocytes T mémoires) ou la réinfection par une autre souche d'EBV.

EBV infecte les lymphocytes B et persiste fortement immunogène. Les lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène sont produits en continu et leur nombre augmente en réponse à une infection primaire et à une virémie élevée. Ce contrôle immunitaire est essentiel pour prévenir les tumeurs malignes liées à l'EBV. Dans son action modulatrice, parvient à sauver les lymphocytes B infectés via l'expression d'antigènes latents et les aide à se différencier en cellules B mémoire, où le virus persiste. Cependant, il n'est pas établi si l'augmentation des lymphocytes T spécifiques de l'EBV est une réponse à une stimulation accrue par reconnaissance spécifique des antigènes de la myéline. La charge virale EBV n'est pas très élevée dans la SEP, de plus, les lymphocytes T spécifiques de ce virus ne semblent pas se distinguer des mêmes cellules chez les hôtes sans SEP.

Un autre chercheur déclare que pendant les périodes de réactivation de la SEP, il y a une activité accrue de réplication virale par rapport aux périodes de rémission. Les patients présentant une réponse anticorps à l'antigène précoce de l'EBV sont plus susceptibles de présenter une activité de la maladie telle que mesurée par IRM avec gadolinium, par rapport aux patients sans réponse humorale. Ces données nous ont amenés à penser que l'activité de la maladie pourrait être liée à l'infection latente à EBV ainsi qu'à la progression de la maladie.

Les études corrélant les niveaux d'anticorps contre le cytomégalovirus (CMV) et la SEP sont controversées. Bien que la plupart des résultats montrent des taux élevés d'infection à CMV chez les patients atteints de SEP, on observe en revanche une présentation plus bénigne de la maladie.

Certains chercheurs ont recherché la présence d'anticorps anti-CMV chez les personnes atteintes de SEP et en bonne santé. Ils se sont révélés positifs chez 98 % des patients atteints de SEP, contre 52 % dans le groupe témoin.

Un autre chercheur a montré que les patients qui avaient des anticorps contre le CMV étaient : un âge plus avancé d'apparition de la maladie, des taux plus faibles de réactivation de la maladie et moins de signes d'atrophie cérébrale à l'IRM. Ceux qui avaient des titres plus élevés de ces anticorps avaient moins d'atrophie cérébrale et moins de lésions lors des tests d'imagerie, par rapport aux patients qui avaient des titres plus faibles. Un modèle animal imitant les schémas de la SEP a démontré que les animaux atteints d'infections à CMV démyélinisant le cadre avant les présentations cliniques étaient plus faibles que ceux non infectés. Ces études suggèrent un effet modulateur bénéfique de l'infection à CMV sur la réponse immunitaire dans la SEP.

Les virus de l'herpès (HHV-6 et HHV-7) sont étroitement apparentés et ont un schéma biologique similaire. Ces virus sont capables d'infecter les cellules du système immunitaire et de moduler leurs fonctions. Le travail décrit par Krukle-Nora et al. ont tenté d'étudier les associations entre le HHV-6 et le HHV-7 dans la SEP en analysant le sang périphérique des patients. Les patients ont été sélectionnés au hasard et répartis en 02 groupes : 14 patients atteints de SEP récurrente-rémittente (RR-MS) et 14 patients atteints de SEP progressive secondaire (SP-MS). Tous les patients de l'étude étaient au moins 3 mois sans utilisation de médicaments immunosuppresseurs. Parmi les 28 patients, 25 avaient une infection latente par le HHV-6 et/ou le HHV-7. Le HHV-6 a été trouvé chez 9 patients avec RR-MS et 9 avec SP-MS. HHV-7 ont été trouvés chez 10 patients atteints de RR-MS et 14 avec le SP-MS.

Deux enquêteurs utilisant la technique d'hybridation fluorescente in situ, des tissus cadavériques humains ont examiné pour évaluer l'expression de gènes viraux précoces et tardifs au niveau de la substance blanche dans le tissu affecté de patients atteints de SEP et dans des échantillons de cerveau sans maladie. Le gène du HHV-6 a été retrouvé dans tous les échantillons et limité aux oligodendrocytes. L'analyse quantitative de l'expression de l'ARN viral a montré que dans les deux groupes de patients atteints de SEP (tissu cérébral avec et sans modification de la substance blanche), les échantillons présentaient des niveaux d'expression significativement plus élevés de ce virus. De plus, ils ont montré que les tissus lésés étaient corrélés à une expression virale plus élevée, un fait qui contribue à la théorie selon laquelle le HHV-6 est impliqué dans la pathogenèse de la SEP.

En utilisant toutes ces méthodes pour le virus, on a observé des résultats contradictoires. En effet, lorsque les technologies utilisées n'étaient pas capables de distinguer l'infection active de l'infection latente par le HHV-6 (par analyse des leucocytes du sang, des cellules contenant du liquide céphalo-rachidien et des tissus du SNC), aucune différence n'est constatée entre les échantillons patients et le groupe témoin. Cependant, lorsque les technologies de diagnostic sont utilisées spécifiquement pour la détection de l'activité du HHV-6, une forte corrélation entre le HHV-6 et la pathogenèse de la SEP est observée. Notre groupe a récemment étudié le niveau de similarité entre la protéine d'enveloppe de HERV-W et MOG. Une comparaison de l'enveloppe MOG a permis d'identifier cinq domaines IgG-like de MOG-like étendant l'idée du HERV-W pouvant être impliqué dans l'immunopathogenèse de la SEP, peut-être pour faciliter la reconnaissance par le système immunitaire des régions rétrovirales MOG. Nous avons également montré que la plupart des patients présentaient une expression de l'enveloppe HERV-W à un certain niveau. Neuf des dix échantillons testés avaient des niveaux moyens à élevés d'expression de l'enveloppe HERV-W contre des niveaux d'expression très faibles ou aucune activité chez les témoins sains, confirmant l'association entre l'activité de la SEP et HERV-W dans notre population.

Une étude récente en Italie a montré que l'EBV stimule l'expression de HERV-W dans les cellules du sang et du cerveau in vitro. Ils suggèrent que la pathogenèse de la SEP, un modèle possible pourrait inclure l'EBV comme déclencheur initial de la SEP, des années plus tard, et montre que le HERV-W est réel pour la pathogénicité de la SEP, en parallèle frappant avec le comportement de la maladie dans sa forme rémittente. cotisant l'appelant.

Objectifs:

Objectif principal : corréler l'activité clinique et d'imagerie de la SEP avec l'évaluation quantitative du HERV-W et des virus de la famille des Herpesviridae dans le sang des patients atteints de SEP.

Objectif secondaire :

Évaluez l'expression du HERV-W et de l'herpèsvirus et comparez l'expression des virus chez les patients atteints de SEP et les témoins sains avec et sans autres maladies neurologiques.

Importance:

La SEP est une maladie multifactorielle, avec une étiologie génétique et environnementale. Il est grand l'intérêt que portent les chercheurs aux facteurs associés pour établir une relation causale. Plusieurs virus ont été liés à la pathogenèse et à l'activité de la maladie. Bien que l'herpèsvirus et les virus HERV-W soient les plus importants dans la tentative d'établir une relation causale et avec l'activité de la SEP, jusqu'à présent, de nombreuses questions restent ouvertes sur le rôle de ces virus dans l'étiologie et le développement de la maladie.

Hypothèse:

Avec ce travail, on s'attend à trouver plus de réponses possibles sur l'étiopathogénie et l'activité inflammatoire liées à la SEP, et ainsi, fournir des données plus cohérentes qui aideront à la formulation de thérapies de plus en plus spécifiques et efficaces dirigées contre cette pathologie.

Méthodes :

Dans un premier temps, tous les échantillons seront analysés par immunodosage ELISA pour la détection des anticorps IgG et immunoglobuline M (IgM) anti-EBV et CMV dans le sérum des participants, à l'aide de kits commerciaux.

L'extraction des acides nucléiques sera effectuée (ADN et ARN), selon les instructions du fabricant. Tous les protocoles pour assurer la pureté de l'ARN et l'absence d'ADN dans les échantillons seront adoptés dans l'analyse de l'expression (et donc la détection des transcrits). Ainsi, les acides nucléiques sont soumis à un traitement à la DNAse et à une vérification par RT-PCR HERV-W. Seuls les échantillons contenant de l'ARN seront transcrits et soumis à une analyse plus approfondie. La quantification de l'ARN du HERV-W sera faite sur des cellules mononucléaires (PBMC) par une réaction quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) spécifique du sous-type MSRV de la famille HERV-W.

La détection de l'ADN de l'herpèsvirus se fera dans un premier temps par une PCR, en utilisant deux jeux d'amorces (HSVPAN et VZVPAN). Après amplification, on réalise une digestion enzymatique par BamHI et BstUI pour typer les huit types d'herpèsvirus dont l'herpèsvirus humain 6 (6A et 6B). Pour les échantillons qui s'avèrent positifs, une qRT-PCR sera organisée pour des virus spécifiques.

Conception:

Une étude longitudinale prospective qui a recueilli du matériel biologique et la présence d'un groupe témoin aura lieu. Ce projet sera analysé par les individus, à travers le terme de consentement libre et éclairé. Ce n'est qu'en signant le formulaire de consentement que le patient pourra participer à cette enquête.

Des prélèvements sanguins des patients de la clinique externe de neurologie (CATEM et autres spécialités) seront effectués lors de la visite de routine par un professionnel qualifié. Le sang des patients de la banque de sang sera collecté en conjonction avec l'examen effectué de manière routinière. Tous les matériaux collectés seront envoyés au laboratoire de virologie de l'Institut de médecine tropicale de l'Université de São Paulo, où des tests de laboratoire sont effectués.

Les patients seront évalués pour le degré d'activité clinique et d'imagerie de la maladie en analysant le taux annualisé de rechutes, les augmentations de l'échelle EDSS et l'augmentation des lésions crâniennes sur l'IRM et l'activité de la maladie classée comme LÉGÈRE, MODÉRÉE et SÉVÈRE selon les critères proposés par Freedman et al. L'IRM crânienne sera réalisée uniquement pour les groupes atteints de SEP et d'autres maladies neurologiques.

Méthodes statistiques:

Après les résultats des tests de laboratoire, les données seront analysées et recevront le traitement nécessaire pour leur interprétation statistique et leur comparaison avec l'activité de la maladie à l'aide d'outils paramétriques et non paramétriques. Les tests Student-t et Mann-Whitney seront utilisés pour évaluer les associations entre les paramètres cliniques, démographiques et de laboratoire. Le niveau de signification d'alpha = 0,05 ou 5 % pour rejeter l'hypothèse nulle sera fixé.

Calcul de la taille de l'échantillon :

La taille de l'échantillon a été déterminée en fonction du pourcentage de la population avec et sans SEP montrant une expression détectable de HERV-W dans les PBMC. Bien que le nombre de patients atteints de SEP qui présentent une enveloppe d'activité rétrovirale soit proche de 95 %, nous supposons des valeurs plus conservatrices pour le calcul de l'échantillon. Par conséquent, en supposant une expression de 50 % et 10 % pour les cas et les témoins, respectivement, une taille d'échantillon de 28 cas et 28 contrôles est nécessaire, sur la base d'un niveau de confiance = 95 % de puissance pour détecter 80 %, selon la méthode de Kelsey. Ainsi, comme les enquêteurs analyseront trois groupes (avec SEP, sans SEP et autres maladies neurologiques), le N total est de 84 sujets, 28 par groupe.