Sammenligning mellom klinisk og MR multippel skleroseaktivitet og uttrykk for humant endogent retrovirus type W og herpesvirus

Bakgrunn/begrunnelse:

Multippel sklerose (MS) er en inflammatorisk demyeliniserende sykdom som rammer ryggmargen (spesielt i bakre ledninger). Den kliniske heterogeniteten til MS er godt beskrevet, men for tiden er det kjent at lesjoner av MS og mekanismer som er involvert i patologisk ødeleggelse av sentralnervesystemet (CNS) også er heterogene. Det er en multifaktoriell sykdom der en immunopatogen mekanisme er foreslått som ansvarlig for ødeleggelsen av skjedemyelinet.

Imidlertid antyder patologien til inflammatoriske leddlesjoner av MS at spesifikke autoimmune responser mot komponenter i CNS myelin kan ha en avgjørende rolle i ødeleggelsen av myelin. Dette konseptet støttes av det høye nivået av oligoklonalt immunoglobulin G (IgG) i cerebrospinalvæsken ved kobling med lokuset til det store histokompatibilitetskomplekset (MHC), utvidelse av B- og T-celler som er reaktive for myelin i MS-lesjoner og det faktum at immunisering med myelinproteiner induserer en MS-lignende sykdom hos dyr, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE).

Autoreaktiviteten for ulike myelinproteiner, inkludert myelinbasisk protein, proteolipidprotein og myelinassosiert glykoprotein i myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG), har blitt observert hos pasienter med MS.

Det bemerkes imidlertid at T-celler fra pasienter med MS viser en dominerende aktivitet mot MOG i forhold til andre myelinproteiner, og anti-MOG-antistoffer ble identifisert knyttet til myelins desintegrasjon rundt aksoner i akutte lesjoner av MS. I tillegg reproduserer sensibilisering med MOG den kliniske og demyeliniserende degenerative patologien til MS i gnagermodeller og primater.

En infeksiøs etiologi av MS har også blitt postulert, og over flere år har en rekke forskjellige virus blitt foreslått å utløse immunopatologi. Økte antistofftitler ble påvist for EBV, varicella zoster-virus og rubellavirus, mens spesifikke proteiner humane endogene retrovirus (HERV), spesielt fra HERV-W-familien, ble påvist i blod- og hjernelesjoner hos pasienter med MS.

HERV oppsto fra eldgamle infeksjoner av vertsceller i kimlinjen av eksogene retrovirus og utgjør i dag omtrent 8 % av det menneskelige genomet.

Retrovirus multippel sklerose-assosiert (MRSV), er et innkapslet virus med revers transkriptaseaktivitet, som representerer prototypen til HERV-W-familiens humane genom.

MRSV ble isolert i leptomeninges, i choroid plexus og i kulturer av monocytter/makrofager fra MS-pasienter, og deres opprinnelse er fortsatt under etterforskning. Har blitt foreslått at partikler stammer fra MSRV provirus HERV-W modifisert, eller overføres fra et medlem av samme eksogene familie. MSRV-virioner har egenskaper som superantigener, de induserer produksjonen av cytokiner av mononukleære celler i perifert humant blod.

HERV-partikler assosiert med revers transkriptaseaktivitet (RT) ble bekreftet å være et kjennetegn på uttrykk fra MSRV. En protokoll for påvisning av MSRV-virion ved RT PCR ble utviklet for å oppdage deres tilstedeværelse i serum og cerebrospinalvæske (CSF) hos pasienten.

Uavhengige studier av pasienter med MS og kontrollpopulasjoner viste korrelasjoner mellom MS og MSRV og dens prognose, inkludert konvertering av residiverende-remitterende MS i sin sekundære progressive form (SP-MS).

Parallelle studier viste immunopatogenesen til MSRV-virioner og identifiserte kappeproteinet (Env) til MSRV som ansvarlig for det pro-inflammatoriske og superantigeniske immunforsvaret. Env-antigenet ble påvist på MS-pasienter i studier av hjernen postmortem.

Transaktivering av HERV-W-promotorene av miljøvirus assosiert med MS har også vist seg å indusere en epigenetisk dysregulering i HERV-W, når den er tilstede i vertsgenomet.

Det absolutt viktigste herpesviruset assosiert med MS er EBV, forholdet mellom EBV-serologi og utviklingen av MS har blitt grundig studert. Videre kan interaksjonen mellom EBV og immunsystemet ubestridelig føre til en vedvarende immunrespons og immortalisering av lymfocytter. Det er også studier som korrelerer uttrykket av EBV med større aktivitet av MS. Til slutt er interaksjonen mellom EBV og endogene retrovirus et nyere og fascinerende studiefelt.

EBV var det første medlemmet av Herpesviridae-familien som ble implisert som en potensiell årsak til MS i 1971. EBV er en mulig kandidat på grunn av flere faktorer: den er utbredt i naturen, krever en lang hvilende virusinfeksjon som har kontinuerlig produksjon på grunn av perioder med reaktivering og modulerer det menneskelige immunsystemet.

Vanskeligheten med å assosiere MS for å bevise at EBV er virusinfeksjonen skjedde før utbruddet av autoimmun sykdom. Pohl et al. viste at EBV-seropositiviteten hos pasienter med MS i Europa (barn) - var 99 % høyere sammenlignet med kontrollgruppen, hvor virusantistoffer ble funnet hos 72 %.

Levin et al. estimerte tidspunktet for virusinfeksjon ved serumantistofftitere før MS og sammenlignet med en kontrollgruppe. Denne studien hadde tilgang til medisinske journaler til omtrent 8 millioner ansatte i den amerikanske hæren som hadde lagret blodprøver. Av denne gruppen ble case-kontrollstudien hvor 305 personer kom for å utvikle MS og 610 utvalgte kontrollpersoner paret; 10 tilfeller som utviklet MS og 32 kontroller var opprinnelig EBV-seronegative. Alle tilfellene hadde blitt positive EBV før MS, sammenlignet med bare 35,7 % av kontrollene som serokonverterte.

Andre studier har også forsøkt å vurdere forholdet mellom antistofftitere mot EBV og utbruddet av MS. I følge arbeidet til De Lorenze et al., hadde pasienter med MS en signifikant økning i antistoffer 20 år før de første symptomene på MS. Dette faktum kan forklares på to måter: eksistensen av en tidligere infeksjon som endrer balansen til EBV-reseptorcellene (minne T-celler) eller reinfeksjon med en annen EBV-stamme.

EBV infiserer B-lymfocytter og er vedvarende svært immunogene. De antigenspesifikke cytotoksiske T-lymfocyttene produseres kontinuerlig og øker i antall som respons på primærinfeksjon og høy viremi. Denne immunkontrollen er avgjørende for å forhindre EBV-relaterte maligniteter. Klarer i sin modulerende virkning å redde infiserte B-lymfocytter via ekspresjon av latente antigener og hjelper dem å differensiere til minne B-celler, der viruset vedvarer. Det er imidlertid ikke fastslått om de økte T-cellene spesifikke for EBV er en respons på økt stimulering ved spesifikk gjenkjennelse av myelinantigener. EBV viral belastning er ikke veldig høy i MS, i tillegg ser det ikke ut til at T-celler spesifikke for dette viruset kan skilles fra de samme cellene i verter uten MS.

En annen etterforsker opplyser at i perioder med MS-reaktivering er det økt aktivitet av virusreplikasjon i forhold til perioder med remisjon. Pasienter med antistoffrespons på tidlig antigen av EBV er mer sannsynlig å vise sykdomsaktivitet målt ved MR med gadolinium sammenlignet med pasienter uten humoral respons. Disse dataene førte til at vi trodde at sykdommens aktivitet kan være relatert til latent EBV-infeksjon så vel som sykdomsprogresjon.

Studier som korrelerer nivåer av antistoffer mot cytomegalovirus (CMV) og MS er kontroversielle. Selv om de fleste resultatene viser høye forekomster av CMV-infeksjon hos pasienter med MS, observeres derimot en mildere presentasjon av sykdommen.

Noen etterforskere så etter tilstedeværelsen av anti-CMV-antistoffer hos MS og friske individer. De fant positivt hos 98 % av MS-pasientene sammenlignet med 52 % i kontrollgruppen.

En annen etterforsker viste at pasienter som hadde antistoff mot CMV var: senere alder for sykdomsdebut, lavere forekomst av reaktivering av sykdommen og færre tegn på cerebral atrofi på MR. De som hadde høyere titere av disse antistoffene hadde mindre hjerneatrofi og færre lesjoner på bildediagnostikk, sammenlignet med pasienter som hadde lavere titere. En dyremodell med etterligning av MS-mønstre viste at dyr med CMV-infeksjoner demyeliniserende ramme før kliniske presentasjoner var svakere enn de som ikke var infisert. Disse studiene antyder en fordelaktig modulerende effekt av CMV-infeksjon på immunresponsen ved MS.

Herpesviruset (HHV-6 og HHV-7) er nært beslektet og har et lignende biologisk mønster. Disse virusene er i stand til å infisere celler i immunsystemet og modulere deres funksjoner. Arbeidet beskrevet av Krukle-Nora et al. forsøkte å undersøke assosiasjoner mellom HHV-6 og HHV-7 ved MS ved å analysere det perifere blodet til pasienter. Pasientene ble tilfeldig valgt og delt inn i 02 grupper: 14 pasienter med residiverende remitterende MS (RR-MS) og 14 med sekundær progressiv MS (SP-MS). Alle studiepasientene var i minst 3 måneder uten bruk av immundempende legemidler. Av de 28 pasientene hadde 25 latent HHV-6-infeksjon og/eller HHV-7. HHV-6 er funnet hos 9 pasienter med RR-MS og 9 med SP-MS. HHV-7 ble funnet hos 10 pasienter med RR-MS og 14 med SP-MS.

To etterforskere som bruker teknikken for fluorescerende in situ hybridisering, undersøkte menneskelig kadavervev for å evaluere ekspresjonen av tidlige og sene virale gener ved hvit substans i det berørte vevet til pasienter med MS og i hjerneprøver uten sykdom. Genet til HHV-6 ble funnet i alle prøver og var begrenset til oligodendrocytter. Kvantitativ analyse av ekspresjonen av viralt RNA viste at i begge gruppene av MS-pasienter (hjernevev med og uten endring av hvit substans) hadde prøver signifikant høyere ekspresjonsnivåer av dette viruset. Videre viste de at det skadede vevene var korrelert med høyere viralt uttrykk, et faktum som bidrar til teorien om HHV-6 er implisert i patogenesen av MS.

Ved å bruke alle disse metodene for virus ble det observert motstridende resultater. Faktisk når teknologiene som ble brukt ikke var i stand til å skille aktiv fra latent infeksjon med HHV-6 (ved analyse av leukocytter fra blodet, av cerebrospinalvæske inneholdende celler og vev i CNS), er det ingen forskjell funnet blant prøvepasientene og kontrollgruppen. Imidlertid, når diagnostiske teknologier brukes spesifikt for påvisning av aktiviteten til HHV-6, observeres en sterk korrelasjon mellom HHV-6 og patogenesen til MS. Vår gruppe har nylig undersøkt nivået av likhet mellom kappeproteinet til HERV-W og MOG. En sammenligning av konvolutten MOG identifiserte fem IgG-lignende domene av MOG-lignende som utvider ideen om HERV-W kan være involvert i immunopatogenesen av MS, kanskje for å lette gjenkjennelsen av immunsystemets MOG retrovirale regioner. Vi har også vist at de fleste pasienter viste uttrykk for HERV-W-konvolutten på et eller annet nivå. Ni av de ti testede prøvene hadde middels til høye nivåer av HERV-W-konvoluttekspresjon mot svært lave ekspresjonsnivåer eller ingen aktivitet hos friske kontroller, noe som bekrefter assosiasjonen mellom MS-aktivitet og HERV-W i vår populasjon.

En fersk studie i Italia viste at EBV stimulerer uttrykket av HERV-W i celler fra blod og hjerne in vitro. De antyder at patogenesen til MS, en mulig modell kan inkludere EBV som den første utløseren av MS, år senere, og viser HERV-W som reell for patogenisiteten til MS, i slående parallell med sykdommens oppførsel i deres remitterende form. bidragsyter den ankende part.

Mål:

Primært mål: korrelere klinisk og avbildning av MS-aktivitet med kvantitativ vurdering av HERV-W og virus fra Herpesviridae-familien i blodet til pasienter med MS.

Sekundært mål:

Vurder ekspresjon av HERV-W og Herpesvirus og sammenlign virusuttrykket blant pasienter med MS og friske kontroller med og uten andre nevrologiske sykdommer.

Betydning:

MS er en multifaktoriell sykdom, med genetisk og miljømessig etiologi. Det er stor interesse forskerne for assosierte faktorer for å etablere en årsakssammenheng. Flere virus har vært knyttet til patogenesen og sykdomsaktiviteten. Selv om herpesvirus og HERV-W-virus er de viktigste i forsøket på å etablere en årsakssammenheng og med aktiviteten til MS, er det til nå mange spørsmål som fortsatt er åpne om rollen til disse virusene i etiologien og utviklingen av sykdom.

Hypotese:

Med dette arbeidet forventes det å finne flere mulige svar på etiopatogenesen og inflammatorisk aktivitet relatert til MS, og dermed gi mer konsistente data som vil hjelpe formuleringen av stadig mer spesifikke og effektive terapier rettet mot denne patologien.

Metoder:

Til å begynne med vil alle prøvene analyseres med ELISA-immunoassay for påvisning av IgG og immunglobulin M (IgM) anti-EBV og CMV antistoffer i serumet til deltakerne, ved bruk av kommersielle sett.

Nukleinsyreekstraksjonen vil bli utført (DNA og RNA), i henhold til produsentens instruksjoner. Alle protokoller for å sikre renheten til RNA og fravær av DNA i prøvene vil bli tatt i bruk i analysen av ekspresjon (og dermed påvisning av transkripsjoner). Dermed blir nukleinsyrene underkastet behandling med DNAse og verifisering med RT-PCR HERV-W. Bare prøver som inneholder RNA vil bli transkribert og gjenstand for videre analyse. RNA-kvantifisering av HERV-W vil bli gjort på mononukleære celler (PBMC) ved en kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) spesifikk for subtypen MSRV av HERV-W-familien.

Påvisningen av herpesvirus-DNA vil i første omgang gjøres ved en PCR, ved bruk av to sett med primere (HSVPAN og VZVPAN). Etter amplifisering utføres en enzymatisk fordøyelse med BamHI og BstUI for å type herpesvirus åtte typer inkludert humant herpesvirus 6 (6A og 6B). For prøver som viser seg positive, vil det bli holdt en qRT-PCR for spesifikke virus.

Design:

En prospektiv, longitudinell studie som samlet inn biologisk materiale og tilstedeværelsen av en kontrollgruppe vil bli avholdt. Dette prosjektet vil bli analysert av individene, gjennom vilkåret for fritt og informert samtykke. Kun ved å signere samtykkeskjemaet vil pasienten kunne delta i denne undersøkelsen.

Blodprøver av pasienter fra nevrologisk poliklinikk (CATEM og andre spesialiteter) vil bli tatt under rutinebesøk av en kvalifisert fagperson. Blodet til pasientene fra Blodbanken vil bli samlet inn i forbindelse med den rutinemessige undersøkelsen. Alt materiale som samles inn vil bli sendt til virologilaboratoriet ved Institutt for tropisk medisin, Universitetet i São Paulo, hvor laboratorietester utføres.

Pasienter vil bli vurdert for grad av klinisk og bildediagnostisk sykdomsaktivitet ved å analysere årlig rate av tilbakefall, EDSS-skalaøkninger og økte kranialesjoner på MR og sykdomsaktivitet klassifisert som MILDE, MODERATE og ALVORLIGE i henhold til de foreslåtte kriteriene av Freedman et al. Kranial MR vil kun utføres for grupper med MS og med andre nevrologiske sykdommer.

Statistiske metoder:

Etter laboratorietestresultater vil data bli analysert og motta nødvendig behandling for statistisk tolkning og sammenligning med sykdomsaktiviteten ved bruk av parametriske og ikke-parametriske verktøy. Student-t- og Mann-Whitney-testene vil bli brukt til å evaluere sammenhenger mellom kliniske, demografiske og laboratorieparametre. Signifikansnivået på alfa = 0,05 eller 5 % for å forkaste nullhypotesen vil være fast.

Eksempelstørrelsesberegning:

Prøvestørrelsen ble bestemt basert på prosentandelen av populasjonen med og uten MS som viste påvisbart uttrykk av HERV-W i PBMC. Selv om antallet pasienter med MS som viser aktivitet retrovirus konvolutt er nær 95 %, antar vi mer konservative verdier for prøveberegningen. Derfor, forutsatt uttrykk med 50 % og 10 % for henholdsvis tilfeller og kontroller, er en prøvestørrelse på 28 tilfeller og 28 kontroller nødvendig, basert på et konfidensnivå = 95 % kraft for å oppdage 80 %, i henhold til Kelsey-metoden. Ettersom etterforskerne vil analysere tre grupper (med MS, uten MS og andre nevrologiske sykdommer) er den totale N 84 personer, 28 per gruppe.