Vergelijking tussen klinische en MRI multiple sclerose-activiteit en expressie van humaan endogeen retrovirus type W en herpesvirus

Achtergrond/grondgedachte:

Multiple sclerose (MS) is een inflammatoire demyeliniserende ziekte die het ruggenmerg aantast (vooral in de achterste koorden). De klinische heterogeniteit van MS is goed beschreven, maar momenteel is bekend dat laesies van MS en mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische vernietiging van het centrale zenuwstelsel (CZS) ook heterogeen zijn. Het is een multifactoriële ziekte waarbij wordt gesuggereerd dat één immunopathogeen mechanisme verantwoordelijk is voor de vernietiging van de myeline-omhulling.

De pathologie van inflammatoire gewrichtslaesies van MS suggereert echter dat specifieke auto-immuunreacties tegen componenten van CZS-myeline een cruciale rol kunnen spelen bij de vernietiging van myeline. Dit concept wordt ondersteund door het hoge niveau van oligoklonaal immunoglobuline G (IgG) in cerebrospinale vloeistof door koppeling met de locus van het major histocompatibility complex (MHC), expansie van B- en T-cellen die reageren op myeline in MS-laesies en het feit dat immunisatie met myeline-eiwitten induceren een MS-achtige ziekte bij dieren, experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE).

De autoreactiviteit voor verschillende myeline-eiwitten, waaronder myeline-basiseiwit, proteolipide-eiwit en myeline-geassocieerd glycoproteïne in myeline-oligodendrocyt-glycoproteïne (MOG), is waargenomen bij patiënten met MS.

Er wordt echter opgemerkt dat T-cellen van patiënten met MS een overheersende activiteit vertonen tegen MOG in relatie tot andere myeline-eiwitten, en er werden anti-MOG-antilichamen geïdentificeerd die verband houden met de desintegratie van de myeline rond axonen in acute laesies van MS. Bovendien reproduceert sensibilisatie met MOG de klinische en demyeliniserende degeneratieve pathologie van MS in knaagdiermodellen en primaten.

Er is ook een infectieuze etiologie van MS gepostuleerd, en gedurende een aantal jaren is gesuggereerd dat een aantal verschillende virussen immunopathologie teweegbrengen. Verhoogde titels van antilichaam werden gedetecteerd voor EBV, varicella zoster-virus en rubella-virus, terwijl specifieke eiwitten menselijke endogene retrovirussen (HERV), in het bijzonder van de HERV-W-familie, werden gedetecteerd in het bloed en hersenlaesies bij patiënten met MS.

HERV is ontstaan ​​uit oude infecties van gastheercellen van de kiembaan door exogene retrovirussen en vormt tegenwoordig ongeveer 8% van het menselijk genoom.

Het retrovirus multiple sclerose-geassocieerde (MRSV) is een omhuld virus met reverse transcriptase-activiteit, dat het prototype vertegenwoordigt van het menselijke genoom van de HERV-W-familie.

Het MRSV werd geïsoleerd in leptomeninges, in de choroïde plexus en in culturen van monocyten/macrofagen van MS-patiënten en hun oorsprong wordt nog onderzocht. Er is gesuggereerd dat deeltjes afkomstig zijn van gemodificeerd MSRV-provirus HERV-W of zijn overgedragen door een lid van dezelfde exogene familie. MSRV-virions hebben eigenschappen zoals superantigenen, ze induceren de productie van cytokines door mononucleaire cellen in perifeer menselijk bloed.

Er werd bevestigd dat HERV-deeltjes geassocieerd met reverse transcriptase-activiteit (RT) een kenmerk van expressie van MSRV zijn. Een protocol voor de detectie van MSRV-virion door middel van RT-PCR werd ontworpen om hun aanwezigheid in serum en cerebrospinale vloeistof (CSF) van de patiënt te detecteren.

Onafhankelijke onderzoeken bij patiënten met MS en controlepopulaties toonden correlaties tussen MS en MSRV en de prognose ervan, waaronder de omzetting van relapsing-remitting MS in zijn secundaire progressieve vorm (SP-MS).

Parallelle onderzoeken toonden de immunopathogenese van MSRV-virionen aan en identificeerden het envelopeiwit (Env) van MSRV als verantwoordelijk voor het pro-inflammatoire en superantigeniciteitsimmuun. Het Env-antigeen werd gedetecteerd bij MS-patiënten in postmortaal hersenonderzoek.

Er is ook aangetoond dat de transactivering van de HERV-W-promoters door omgevingsvirus geassocieerd met MS een epigenetische ontregeling in HERV-W induceert, indien aanwezig in het gastheergenoom.

Zeker het belangrijkste herpesvirus geassocieerd met MS is EBV, de verhouding tussen EBV-serologie en het ontstaan ​​van MS is uitgebreid bestudeerd. Bovendien is de interactie tussen EBV en het immuunsysteem onmiskenbaar, wat leidt tot een aanhoudende immuunrespons en onsterfelijkheid van lymfocyten. Er zijn ook onderzoeken die de expressie van EBV correleren met een grotere activiteit van MS. Ten slotte is de interactie tussen EBV en endogene retrovirussen een recent en fascinerend studiegebied.

EBV was het eerste lid van de Herpesviridae-familie dat in 1971 werd geïmpliceerd als mogelijke oorzaak van MS. EBV is een mogelijke kandidaat vanwege verschillende factoren: het is wijdverspreid van aard, vereist een langdurige, rustige virale infectie die continu wordt geproduceerd en perioden van reactivering vereist, en moduleert het menselijke immuunsysteem.

De moeilijkheid om MS te associëren om te bewijzen dat EBV de virusinfectie is, vond plaats vóór het begin van de auto-immuunziekte. Pohl et al. bleek dat de EBV-seropositiviteit bij patiënten met MS in Europa (kinderen) - 99% hoger was in vergelijking met de controlegroep, waarvan bij 72% antistoffen tegen het virus werden gevonden.

Levin et al. schatte de tijd van virale infectie door serumantilichaamtiters vóór de MS en vergeleek met een controlegroep. Deze studie had toegang tot de medische dossiers van ongeveer 8 miljoen werknemers van het Amerikaanse leger die bloedmonsters hadden opgeslagen. Van deze groep werden de patiënt-controlestudie waarbij 305 mensen kwamen om later MS te ontwikkelen en 610 geselecteerde controlepersonen gekoppeld; 10 gevallen die MS ontwikkelden en 32 controles waren aanvankelijk EBV-seronegatief. Alle gevallen waren vóór de MS positief EBV geworden, vergeleken met slechts 35,7% van de controles die seroconversie hadden ondergaan.

Andere studies hebben ook geprobeerd de relatie tussen antilichaamtiters tegen EBV en het begin van MS te beoordelen. Volgens het werk van De Lorenze et al. hadden patiënten met MS 20 jaar vóór de eerste symptomen van MS een significante toename van antilichamen. Dit feit kan op twee manieren worden verklaard: het bestaan ​​van een eerdere infectie die de balans van de EBV-receptorcellen (geheugen-T-cellen) verandert of herinfectie met een andere EBV-stam.

EBV infecteert B-lymfocyten en is aanhoudend zeer immunogeen. De antigeenspecifieke cytotoxische T-lymfocyten worden continu geproduceerd en nemen in aantal toe als reactie op primaire infectie en hoge viremie. Deze immuuncontrole is essentieel om EBV-gerelateerde maligniteiten te voorkomen. In zijn modulerende werking slaagt het erin geïnfecteerde B-lymfocyten te redden door expressie van latente antigenen en helpt het hen te differentiëren tot geheugen-B-cellen, waar het virus aanhoudt. Het is echter niet vastgesteld of de verhoogde T-cellen die specifiek zijn voor EBV een reactie is op verhoogde stimulatie door specifieke herkenning van myeline-antigenen. EBV-virale belasting is niet erg hoog bij MS, bovendien lijken T-cellen die specifiek zijn voor dit virus niet te worden onderscheiden van dezelfde cellen in gastheren zonder MS.

Een andere onderzoeker stelt dat er tijdens perioden van MS-reactivering een verhoogde activiteit van virusreplicatie is in verhouding tot perioden van remissie. Patiënten met een antilichaamrespons op vroeg antigeen van EBV vertonen meer kans op ziekteactiviteit zoals gemeten met MRI met gadolinium, in vergelijking met patiënten zonder humorale respons. Deze gegevens brachten ons ertoe te geloven dat de activiteit van de ziekte mogelijk verband houdt met latente EBV-infectie en met ziekteprogressie.

Studies die niveaus van antilichamen tegen cytomegalovirus (CMV) en MS correleren, zijn controversieel. Hoewel de meeste resultaten een hoge mate van CMV-infectie bij patiënten met MS laten zien, wordt aan de andere kant een mildere presentatie van de ziekte waargenomen.

Sommige onderzoekers zochten naar de aanwezigheid van anti-CMV-antilichamen bij MS en gezonde personen. Ze vonden positief bij 98% van de MS-patiënten vergeleken met 52% in de controlegroep.

Een andere onderzoeker toonde aan dat patiënten die antilichamen tegen CMV hadden: latere leeftijd waarop de ziekte begon, lagere reactiveringspercentages van de ziekte en minder tekenen van cerebrale atrofie op MRI. Degenen met hogere titers van deze antilichamen hadden minder hersenatrofie en minder laesies bij beeldvormingstests, vergeleken met patiënten met lagere titers. Een diermodel met het nabootsen van de patronen van MS toonde aan dat dieren met een demyeliniserende frame van CMV-infecties vóór klinische presentaties zwakker waren dan degenen die niet geïnfecteerd waren. Deze studies suggereren een gunstig modulerend effect van CMV-infectie op de immuunrespons bij MS.

Het herpesvirus (HHV-6 en HHV-7) zijn nauw verwant en hebben een vergelijkbaar biologisch patroon. Deze virussen kunnen cellen van het immuunsysteem infecteren en hun functies moduleren. Het werk beschreven door Krukle-Nora et al. geprobeerd associaties tussen HHV-6 en HHV-7 bij MS te onderzoeken door het perifere bloed van patiënten te analyseren. Patiënten werden willekeurig geselecteerd en verdeeld in 02 groepen: 14 patiënten met relapsing remitting MS (RR-MS) en 14 met secundair progressieve MS (SP-MS). Alle studiepatiënten hadden ten minste 3 maanden geen immunosuppressiva gebruikt. Van de 28 patiënten hadden er 25 een latente HHV-6-infectie en/of HHV-7. HHV-6 is gevonden bij 9 patiënten met RR-MS en 9 met SP-MS. HHV-7 werd gevonden bij 10 patiënten met RR-MS en 14 met SP-MS.

Twee onderzoekers gebruikten de techniek van fluorescerende in situ hybridisatie, menselijk kadaverweefsel onderzocht om de expressie van vroege en late virale genen in witte stof in het aangetaste weefsel van patiënten met MS en in hersenmonsters zonder ziekte te evalueren. Het gen van HHV-6 werd gevonden in alle monsters en was beperkt tot oligodendrocyten. Kwantitatieve analyse van de expressie van viraal RNA toonde aan dat in beide groepen MS-patiënten (hersenweefsel met en zonder verandering van witte stof) monsters significant hogere niveaus van expressie van dit virus hadden. Bovendien toonden ze aan dat de beschadigde weefsels gecorreleerd waren met een hogere virale expressie, een feit dat bijdraagt ​​aan de theorie van HHV-6 en betrokken is bij de pathogenese van MS.

Bij het gebruik van al deze methoden voor virussen werden tegenstrijdige resultaten waargenomen. Wanneer de gebruikte technologieën niet in staat waren om actieve van latente infectie door HHV-6 te onderscheiden (door analyse van leukocyten uit het bloed, van cerebrospinale vloeistof bevattende cellen en van weefsel van het CZS), werd er geen verschil gevonden tussen de monsters patiënten en de controlegroep. Wanneer diagnostische technologieën echter specifiek worden gebruikt voor de detectie van activiteit van HHV-6, wordt een sterke correlatie tussen HHV-6 en de pathogenese van MS waargenomen. Onze groep heeft onlangs de mate van overeenkomst tussen het envelopeiwit van HERV-W en MOG onderzocht. Een vergelijking van de envelop-MOG identificeerde vijf IgG-achtige domeinen van MOG-achtige domeinen die het idee van de HERV-W uitbreidden en mogelijk betrokken zijn bij de immunopathogenese van MS, misschien om herkenning door de MOG-retrovirale regio's van het immuunsysteem te vergemakkelijken. We hebben ook aangetoond dat de meeste patiënten op een bepaald niveau expressie van de HERV-W-envelop vertoonden. Negen van de tien geteste monsters hadden gemiddelde tot hoge niveaus van HERV-W-envelopexpressie tegen zeer lage expressieniveaus of geen activiteit bij gezonde controles, wat de associatie tussen MS-activiteit en HERV-W in onze populatie bevestigt.

Een recente studie in Italië toonde aan dat EBV in vitro de expressie van HERV-W in cellen uit het bloed en de hersenen stimuleert. Ze suggereren dat de pathogenese van MS, een mogelijk model, jaren later EBV zou kunnen omvatten als de eerste trigger van MS, en toont aan dat de HERV-W reëel is voor de pathogeniciteit van MS, opvallend parallel met het gedrag van de ziekte in hun remitterende vorm. inbrenger van appellant.

Doelstellingen:

Primaire doelstelling: klinische en beeldvorming van MS-activiteit correleren met kwantitatieve beoordeling van HERV-W en virussen van de Herpesviridae-familie in het bloed van patiënten met MS.

Secundaire doelstelling:

Beoordeel de expressie van HERV-W en Herpesvirus en vergelijk de virusexpressie bij patiënten met MS en gezonde controles met en zonder andere neurologische aandoeningen.

Betekenis:

MS is een multifactoriële ziekte, met genetische en omgevingsfactoren. Het is groot dat de onderzoekers geïnteresseerd zijn in geassocieerde factoren om een ​​oorzakelijk verband vast te stellen. Verschillende virussen zijn in verband gebracht met de pathogenese en ziekteactiviteit. Hoewel herpesvirus en HERV-W-virussen de belangrijkste zijn in de poging om een ​​oorzakelijk verband en met de activiteit van MS vast te stellen, blijven er tot nu toe veel vragen open over de rol van deze virussen in de etiologie en ontwikkeling van ziekte.

Hypothese:

Met dit werk wordt verwacht meer mogelijke antwoorden te vinden op de etiopathogenese en ontstekingsactiviteit gerelateerd aan MS, en dus consistentere gegevens te verschaffen die zullen helpen bij het formuleren van steeds specifiekere en effectievere therapieën gericht op deze pathologie.

methoden:

In eerste instantie zullen alle monsters worden geanalyseerd door ELISA-immunoassay voor de detectie van IgG- en immunoglobuline M (IgM) anti-EBV- en CMV-antilichamen in het serum van de deelnemers, met behulp van commerciële kits.

De nucleïnezuurextractie zal worden uitgevoerd (DNA en RNA), volgens de instructies van de fabrikant. Alle protocollen om de zuiverheid van het RNA en de afwezigheid van DNA in de monsters te waarborgen, zullen worden toegepast bij de analyse van expressie (en dus detectie van transcripten). Aldus worden de nucleïnezuren onderworpen aan behandeling met DNAse en verificatie door RT-PCR HERV-W. Alleen monsters die RNA bevatten, worden getranscribeerd en onderworpen aan verdere analyse. RNA-kwantificering van de HERV-W zal gebeuren op mononucleaire cellen (PBMC) door een kwantitatieve polymerasekettingreactie (qRT-PCR) die specifiek is voor het subtype MSRV van de HERV-W-familie.

De detectie van herpesvirus-DNA zal in eerste instantie gebeuren door middel van een PCR, waarbij gebruik wordt gemaakt van twee sets primers (HSVPAN en VZVPAN). Na amplificatie wordt een enzymatische digestie uitgevoerd met BamHI en BstUI voor het typeren van het herpesvirus acht typen waaronder humaan herpesvirus 6 (6A en 6B). Voor monsters die positief blijken, zal een qRT-PCR worden gehouden voor specifieke virussen.

Ontwerp:

Er zal een prospectieve, longitudinale studie worden gehouden die biologisch materiaal verzamelt en de aanwezigheid van een controlegroep. Dit project zal worden geanalyseerd door de individuen, gedurende de termijn van vrije en geïnformeerde toestemming. Alleen door ondertekening van het toestemmingsformulier kan de patiënt deelnemen aan dit onderzoek.

Bloedmonsters van patiënten van de polikliniek neurologie (CATEM en andere specialiteiten) worden tijdens routinebezoek door een gekwalificeerde professional afgenomen. Het bloed van de patiënten van de Bloedbank wordt afgenomen in combinatie met het routinematig uitgevoerde onderzoek. Alle verzamelde materialen worden naar het virologisch laboratorium van het Instituut voor Tropische Geneeskunde van de Universiteit van São Paulo gestuurd, waar laboratoriumtests worden uitgevoerd.

Patiënten zullen worden beoordeeld op de mate van klinische en beeldvormende ziekteactiviteit door analyse van het jaarlijkse aantal recidieven, EDSS-schaalstijgingen en toegenomen craniale laesies op MRI en ziekteactiviteit geclassificeerd als LICHT, MATIG en ERNSTIG volgens de voorgestelde criteria door Freedman et al. De craniale MRI wordt alleen uitgevoerd bij groepen met MS en andere neurologische aandoeningen.

Statistische methoden:

Na laboratoriumtestresultaten zullen de gegevens worden geanalyseerd en de nodige behandeling krijgen voor de statistische interpretatie en vergelijking met de activiteit van de ziekte met behulp van parametrische en niet-parametrische hulpmiddelen. De Student-t- en Mann-Whitney-tests zullen worden gebruikt om associaties tussen klinische, demografische en laboratoriumparameters te evalueren. Het significantieniveau van alfa = 0,05 of 5% om de nulhypothese te verwerpen, wordt vastgesteld.

Berekening van de steekproefomvang:

De steekproefomvang werd bepaald op basis van het percentage van de populatie met en zonder MS dat een detecteerbare expressie van HERV-W in PBMC vertoonde. Hoewel het aantal patiënten met MS dat activiteit retrovirus-envelop vertoont bijna 95% bedraagt, gaan we uit van meer conservatieve waarden voor de voorbeeldberekening. Daarom, uitgaande van een uitdrukking van 50% en 10% voor respectievelijk gevallen en controles, is een steekproefomvang van 28 gevallen en 28 controles nodig, gebaseerd op een betrouwbaarheidsniveau = 95% vermogen om 80% te detecteren, volgens de Kelsey-methode. Aangezien de onderzoekers dus drie groepen zullen analyseren (met MS, zonder MS en andere neurologische aandoeningen), is het totaal N 84 proefpersonen, 28 per groep.