Vertailu ihmisen endogeenisen retrovirustyypin W ja herpesviruksen kliinisen ja MRI-multippeliskleroosiaktiivisuuden ja ilmentymisen välillä

Tausta/perustelut:

Multippeliskleroosi (MS) on tulehduksellinen demyelinisoiva sairaus, joka vaikuttaa selkäytimeen (etenkin takajohtoihin). MS-taudin kliininen heterogeenisuus on kuvattu hyvin, mutta tällä hetkellä tiedetään, että MS-leesiot ja keskushermoston patologiseen tuhoutumiseen liittyvät mekanismit ovat myös heterogeenisiä. Se on monitekijäinen sairaus, jossa yhden immunopatogeenisen mekanismin oletetaan olevan vastuussa vaipan myeliinin tuhoutumisesta.

MS-taudin tulehduksellisten nivelleesioiden patologia viittaa kuitenkin siihen, että spesifisillä autoimmuunivasteilla keskushermoston myeliinin komponentteja vastaan ​​voi olla ratkaiseva rooli myeliinin tuhoutumisessa. Tätä konseptia tukee korkea oligoklonaalisen immunoglobuliini G:n (IgG) taso aivo-selkäydinnesteessä, koska se on sitoutunut suuren histokompatibiliteettikompleksin (MHC) lokukseen, myeliinille reaktiivisten B- ja T-solujen laajeneminen MS-leesioissa ja se, että immunisointi myeliiniproteiinit aiheuttavat MS-taudin kaltaisen taudin eläimillä, kokeellisen autoimmuunisen enkefalomyeliitin (EAE).

MS-potilailla on havaittu autoreaktiivisuutta useille myeliiniproteiineille, mukaan lukien myeliinin emäksinen proteiini, proteolipidiproteiini ja myeliiniin liittyvä glykoproteiini myeliinioligodendrosyyttien glykoproteiinissa (MOG).

On kuitenkin huomattava, että MS-potilaiden T-soluilla on hallitseva aktiivisuus MOG:tä vastaan ​​suhteessa muihin myeliiniproteiineihin, ja anti-MOG-vasta-aineita tunnistettiin yhteydessä myeliinin hajoamiseen aksonien ympärillä MS:n akuuteissa leesioissa. Lisäksi MOG-herkistäminen toistaa MS-taudin kliinisen ja demyelinoivan rappeuttavan patologian jyrsijämalleissa ja kädellisissä.

MS-taudin tarttuvan etiologian on myös oletettu, ja useiden vuosien aikana on ehdotettu useiden eri virusten laukaisevan immunopatologian. Lisääntynyt vasta-ainenimike havaittiin EBV:lle, varicella zoster -virukselle ja vihurirokkovirukselle, kun taas spesifisiä proteiineja, ihmisen endogeenisiä retroviruksia (HERV), erityisesti HERV-W-perheeseen, havaittiin MS-potilaiden veressä ja aivovaurioissa.

HERV syntyi muinaisista eksogeenisten retrovirusten aiheuttamista ituradan isäntäsolujen infektioista ja muodostaa nykyään noin 8 % ihmisen genomista.

Multippeliskleroosiin liittyvä retrovirus (MRSV) on vaipallinen virus, jolla on käänteiskopioijaaktiivisuutta ja joka edustaa HERV-W-perheen ihmisen genomin prototyyppiä.

MRSV eristettiin MS-potilaiden leptomeningeista, suonipunosta ja monosyytti-/makrofagiviljelmistä, ja niiden alkuperää tutkitaan edelleen. On ehdotettu, että hiukkaset ovat peräisin MSRV-proviruksesta HERV-W modifioituna tai välittyneet saman eksogeenisen perheen jäsenestä. MSRV-virioneilla on ominaisuuksia, kuten superantigeenit, ne indusoivat sytokiinien tuotantoa ihmisen ääreisveren mononukleaarisissa soluissa.

Käänteistranskriptaasiaktiivisuuteen (RT) liittyvät HERV-partikkelit vahvistettiin olevan MSRV:n ilmentymisen tunnusmerkki. Protokolla MSRV-virionin havaitsemiseksi RT PCR:llä suunniteltiin havaitsemaan niiden esiintyminen potilaan seerumissa ja aivo-selkäydinnesteessä (CSF).

Riippumattomat tutkimukset MS-potilailla ja kontrollipopulaatioilla osoittivat korrelaatioita MS-taudin ja MSRV:n ja sen ennusteen välillä, mukaan lukien relapsoivan ja remittoivan MS-taudin muuttuminen sekundaarisesti progressiiviseen muotoonsa (SP-MS).

Rinnakkaiset tutkimukset osoittivat MSRV-virionien immunopatogeneesin ja tunnistivat MSRV:n vaippaproteiinin (Env) olevan vastuussa proinflammatorisesta ja superantigeenisestä immuunijärjestelmästä. Env-antigeeni havaittiin MS-potilailla aivojen kuolemanjälkeisissä tutkimuksissa.

MS-tautiin liittyvän ympäristöviruksen aiheuttaman HERV-W-promoottorien transaktivaation on myös osoitettu aiheuttavan epigeneettisen säätelyhäiriön HERV-W:ssä, kun sitä on läsnä isäntägenomissa.

Varmasti tärkein MS-tautiin liittyvä herpesvirus on EBV, EBV-serologian ja MS-taudin kehittymisen välistä suhdetta on tutkittu laajasti. Lisäksi EBV:n ja immuunijärjestelmän välinen vuorovaikutus on kiistatonta, mikä johtaa jatkuvaan immuunivasteeseen ja lymfosyyttien kuolemattomuuksiin. On myös tutkimuksia, jotka korreloivat EBV:n ilmentymisen ja MS:n suuremman aktiivisuuden. Lopuksi, EBV:n ja endogeenisten retrovirusten välinen vuorovaikutus on uusi ja kiehtova tutkimusala.

EBV oli ensimmäinen Herpesviridae-perheen jäsen, joka yhdistettiin mahdolliseksi MS-taudin aiheuttajaksi vuonna 1971. EBV on mahdollinen ehdokas useista tekijöistä johtuen: se on laajalle levinnyt luonnossa, vaatii pitkän lepäävän virusinfektion, jolla on jatkuvaa tuotantoa uudelleenaktivoitumisjaksojen aikana ja joka moduloi ihmisen immuunijärjestelmää.

Vaikeus yhdistää MS-tautia osoittamaan, että EBV on virusinfektio, tapahtui ennen autoimmuunisairauden puhkeamista. Pohl et ai. osoitti, että EBV-seropositiivisuus MS-potilailla Euroopassa (lapset) - oli 99 % korkeampi verrattuna kontrolliryhmään, jossa virusvasta-aineita löytyi 72 %:lta.

Levin et ai. arvioivat virusinfektion ajan seerumin vasta-ainetiittereillä ennen MS-tautia ja verrattiin kontrolliryhmään. Tässä tutkimuksessa oli pääsy noin 8 miljoonan verinäytteitä säilyttäneen Yhdysvaltain armeijan työntekijän potilastietoihin. Tästä ryhmästä tapaus-verrokkitutkimus, jossa 305 ihmistä tuli myöhemmin kehittämään MS-tautia ja 610 kontrollihenkilöä valittiin pariksi; 10 tapausta, joille kehittyi MS ja 32 kontrollia, olivat alun perin EBV-seronegatiivisia. Kaikki tapaukset olivat tulleet positiivisiksi EBV:stä ennen MS-tautia, verrattuna vain 35,7 %:iin verrokeista, jotka muuntuivat serokonversioon.

Muut tutkimukset ovat myös yrittäneet arvioida EBV-vasta-ainetiitterien ja MS-taudin alkamisen välistä suhdetta. De Lorenzen et al.:n työn mukaan MS-potilailla vasta-aineiden määrä lisääntyi merkittävästi 20 vuotta ennen MS-taudin ensimmäisiä oireita. Tämä tosiasia voidaan selittää kahdella tavalla: aiemman infektion olemassaolo, joka muuttaa EBV-reseptorisolujen (muisti-T-solujen) tasapainoa, tai uudelleeninfektio eri EBV-kannalla.

EBV infektoi B-lymfosyyttejä ja on jatkuvasti erittäin immunogeeninen. Antigeenispesifisiä sytotoksisia T-lymfosyyttejä tuotetaan jatkuvasti ja niiden lukumäärä kasvaa vasteena primaariselle infektiolle ja korkealle viremialle. Tämä immuunijärjestelmä on välttämätön EBV:hen liittyvien pahanlaatuisten kasvainten ehkäisemisessä. Moduloivassa toiminnassaan se onnistuu pelastamaan infektoituneet B-lymfosyytit latenttien antigeenien ilmentymisen kautta ja auttaa niitä erilaistumaan muisti-B-soluiksi, joissa virus säilyy. Ei kuitenkaan ole vahvistettu, onko EBV:lle spesifisten T-solujen lisääntyminen vaste lisääntyneelle stimulaatiolle myeliiniantigeenien spesifisen tunnistamisen avulla. EBV-viruskuorma ei ole kovin korkea MS-taudissa, lisäksi tälle virukselle spesifiset T-solut eivät näytä erottuvan samoista soluista isännissä, joissa ei ole MS-tautia.

Toinen tutkija toteaa, että MS-taudin uudelleenaktivoitumisjaksojen aikana viruksen replikaation aktiivisuus on lisääntynyt suhteessa remissiojaksoihin. Potilaat, joilla on vasta-ainevaste EBV:n varhaiselle antigeenille, osoittavat todennäköisemmin taudin aktiivisuutta mitattuna magneettikuvauksella gadoliniumilla verrattuna potilaisiin, joilla ei ole humoraalista vastetta. Nämä tiedot saivat meidät uskomaan, että taudin aktiivisuus voi liittyä piilevään EBV-infektioon sekä taudin etenemiseen.

Sytomegaloviruksen (CMV) ja MS-taudin vasta-aineiden tasoja korreloivat tutkimukset ovat kiistanalaisia. Vaikka useimmat tulokset osoittavat korkean CMV-infektion MS-potilailla, toisaalta taudin havaitaan lievemmin.

Jotkut tutkijat etsivät CMV-vasta-aineiden esiintymistä MS-taudissa ja terveissä yksilöissä. Ne todettiin positiivisiksi 98 %:lla MS-potilaista verrattuna 52 %:iin kontrolliryhmässä.

Toiset tutkijat osoittivat, että potilaat, joilla oli vasta-aineita CMV:tä vastaan, olivat: myöhempi taudin alkamisikä, taudin uudelleenaktivoitumisaste ja vähemmän merkkejä aivoatrofiasta magneettikuvauksessa. Niillä, joilla oli korkeammat näiden vasta-aineiden tiitterit, oli vähemmän aivoatrofiaa ja vähemmän leesioita kuvantamistesteissä verrattuna potilaisiin, joilla oli alhaisemmat tiitterit. Eläinmalli, joka jäljitteli MS-taudin malleja, osoitti, että eläimet, joilla oli CMV-infektioiden demyelinisaatiokehitys ennen kliinisiä esityksiä, olivat heikompia kuin ne, jotka eivät olleet infektoituneita. Nämä tutkimukset viittaavat CMV-infektion edulliseen moduloivaan vaikutukseen immuunivasteeseen MS:ssä.

Herpesvirus (HHV-6 ja HHV-7) ovat läheistä sukua ja niillä on samanlainen biologinen kuvio. Nämä virukset pystyvät infektoimaan immuunijärjestelmän soluja ja muuttamaan niiden toimintoja. Krukle-Noran et ai. Yritti tutkia MS-taudin HHV-6:n ja HHV-7:n välisiä yhteyksiä analysoimalla potilaiden ääreisverta. Potilaat valittiin satunnaisesti ja jaettiin 02 ryhmään: 14 potilasta, joilla oli uusiutuva remittoiva MS (RR-MS) ja 14 sekundaarisesti etenevä MS (SP-MS). Kaikki tutkimuspotilaat olivat vähintään 3 kuukautta ilman immunosuppressiivisia lääkkeitä. 28 potilaasta 25:llä oli piilevä HHV-6- ja/tai HHV-7-infektio. HHV-6 on löydetty yhdeksältä potilaalta, joilla on RR-MS ja 9 potilaalla SP-MS. HHV-7 löydettiin 10 potilaalta, joilla oli RR-MS ja 14 potilaalla SP-MS.

Kaksi tutkijaa, jotka käyttivät fluoresoivaa in situ -hybridisaatiotekniikkaa, ihmisen ruumiinkudoksia tutkittiin varhaisten ja myöhäisten virusgeenien ilmentymisen arvioimiseksi MS-potilaiden sairastuneessa kudoksessa valkoisessa aineessa ja aivonäytteissä, joissa ei ole sairautta. HHV-6:n geeni löydettiin kaikista näytteistä ja se rajoittui oligodendrosyytteihin. Viruksen RNA:n ilmentymisen kvantitatiivinen analyysi osoitti, että molemmissa MS-potilasryhmissä (aivokudos valkoisen aineen muutoksella ja ilman) näytteillä oli merkittävästi korkeampi tämän viruksen ilmentymistaso. Lisäksi he osoittivat, että vahingoittuneet kudokset korreloivat korkeamman viruksen ilmentymisen kanssa, mikä seikka, joka edistää HHV-6:n teoriaa, liittyy MS-taudin patogeneesiin.

Käyttämällä kaikkia näitä menetelmiä viruksen havaittiin ristiriitaisia ​​tuloksia. Itse asiassa, kun käytetyt tekniikat eivät kyenneet erottamaan aktiivista HHV-6-infektiota piilevästä infektiosta (veren leukosyyttien, aivo-selkäydinnestettä sisältävien solujen ja keskushermoston kudosten analysoinnilla), näytepotilaiden ja potilaiden välillä ei havaita eroa. kontrolliryhmä. Kuitenkin, kun diagnostisia tekniikoita käytetään erityisesti HHV-6:n aktiivisuuden havaitsemiseen, HHV-6:n ja MS-taudin patogeneesin välillä havaitaan vahva korrelaatio. Ryhmämme on äskettäin tutkinut HERV-W:n ja MOG:n vaippaproteiinin samankaltaisuuden tasoa. Verrattaessa vaippaa MOG tunnisti viisi IgG:n kaltaista MOG:n kaltaista domeenia, jotka laajentavat HERV-W:n ideaa, voivat olla mukana MS:n immunopatogeneesissä, ehkä helpottaakseen immuunijärjestelmän MOG-retrovirusalueiden tunnistamista. Olemme myös osoittaneet, että useimmilla potilailla HERV-W-vaippa ilmeni jollain tasolla. Yhdeksässä kymmenestä testatusta näytteestä oli keskitasoista tai korkeita HERV-W-vaipan ilmentymistasoja vastaan ​​erittäin alhaisia ​​ilmentymistasoja vastaan ​​tai ei aktiivisuutta terveissä kontrolleissa, mikä vahvistaa yhteyden MS-aktiivisuuden ja HERV-W:n välillä populaatiossamme.

Hiljattain Italiassa tehty tutkimus osoitti, että EBV stimuloi HERV-W:n ilmentymistä veren ja aivojen soluissa in vitro. He ehdottavat, että MS-taudin patogeneesi, mahdollinen malli, voisi sisältää EBV:n MS-taudin alkulaukaisijana vuosia myöhemmin, ja osoittaa HERV-W:n olevan todellista MS-taudin patogeenisyyttä silmälläpitäen rinnakkain taudin käyttäytymisen kanssa niiden leviävässä muodossa. avustaja valittaja.

Tavoitteet:

Ensisijainen tavoite: korreloida MS-aktiivisuuden kliininen ja kuvantaminen HERV-W:n ja Herpesviridae-heimon virusten kvantitatiivisen arvioinnin kanssa MS-potilaiden veressä.

Toissijainen tavoite:

Arvioi HERV-W:n ja herpesviruksen ilmentymistä ja vertaa virusten ilmentymistä MS-potilailla ja terveillä verrokeilla, joilla on tai ei ole muita neurologisia sairauksia.

Merkitys:

MS on monitekijäinen sairaus, jolla on geneettinen ja ympäristöllinen etiologia. Tutkijoiden kiinnostus asiaan liittyviin tekijöihin on suuri syy-suhteen luomiseksi. Useita viruksia on liitetty patogeneesiin ja taudin aktiivisuuteen. Vaikka herpesvirus ja HERV-W-virukset ovat tärkeimmät syy-yhteyden selvittämisessä ja MS-taudin aktiivisuuden kanssa, on toistaiseksi monia kysymyksiä, jotka ovat avoinna näiden virusten roolista taudin etiologiassa ja kehityksessä.

Hypoteesi:

Tämän työn avulla odotetaan löytävän enemmän mahdollisia vastauksia MS-tautiin liittyvään etiopatogeneesiin ja tulehdusaktiivisuuteen ja siten tarjoavan johdonmukaisempaa tietoa, joka auttaa muotoilemaan yhä spesifisempiä ja tehokkaampia tähän patologiaan suunnattuja hoitoja.

Menetelmät:

Aluksi kaikki näytteet analysoidaan ELISA-immunomäärityksellä IgG:n ja immunoglobuliini M (IgM) anti-EBV- ja CMV-vasta-aineiden havaitsemiseksi osallistujien seerumista käyttämällä kaupallisia sarjoja.

Nukleiinihappouutto suoritetaan (DNA ja RNA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki menetelmät, joilla varmistetaan RNA:n puhtaus ja DNA:n puuttuminen näytteistä, otetaan käyttöön ekspression (ja siten transkriptien havaitsemisen) analysoinnissa. Siten nukleiinihapot käsitellään DNAasella ja varmistetaan RT-PCR HERV-W:llä. Vain RNA:ta sisältävät näytteet transkriptoidaan ja niille tehdään lisäanalyysi. HERV-W:n RNA-kvantifiointi tehdään mononukleaarisissa soluissa (PBMC) kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR), joka on spesifinen HERV-W-perheen MSRV-alatyypille.

Herpesviruksen DNA:n havaitseminen tehdään aluksi PCR:llä käyttämällä kahta alukesarjaa (HSVPAN ja VZVPAN). Monistamisen jälkeen suoritetaan entsymaattinen pilkkominen BamHI:llä ja BstUI:lla herpesviruksen kahdeksan tyypin tyypittämiseksi, mukaan lukien ihmisen herpesvirus 6 (6A ja 6B). Positiivisiksi osoittautuneiden näytteiden osalta suoritetaan qRT-PCR tiettyjen virusten varalta.

Design:

Prospektiivinen, pitkittäinen tutkimus, jossa kerättiin biologista materiaalia ja kontrolliryhmän läsnäolo, järjestetään. Yksityishenkilöt analysoivat tätä hanketta vapaan ja tietoisen suostumuksen ehdolla. Vain allekirjoittamalla suostumuslomakkeen potilas voi osallistua tähän kyselyyn.

Neurologian poliklinikan (CATEM ja muut erikoisalat) potilaiden verinäytteet otetaan pätevän ammattilaisen rutiinikäynnin aikana. Potilaiden veri Veripankista kerätään rutiininomaisesti suoritettavan tutkimuksen yhteydessä. Kaikki kerätyt materiaalit lähetetään São Paulon yliopiston trooppisen lääketieteen instituutin virologian laboratorioon, jossa suoritetaan laboratoriotestejä.

Potilaiden kliinisen ja kuvantamisen taudin aktiivisuuden aste arvioidaan analysoimalla vuositasoinen pahenemisaste, EDSS-asteikon lisäykset ja lisääntyneet kallon leesiot magneettikuvauksessa sekä sairauden aktiivisuus, joka on luokiteltu LUOKSIIN LIETTY, KOHTAALTA ja VAKAVA Freedmanin et al. ehdottamien kriteerien mukaan. Kallon magneettikuvaus tehdään vain MS-tautia ja muita neurologisia sairauksia sairastaville ryhmille.

Tilastolliset menetelmät:

Laboratoriotestitulosten jälkeen tiedot analysoidaan ja niitä käsitellään tarvittavalla tavalla tilastolliseen tulkintaan ja vertailuun sairauden aktiivisuuteen parametrisilla ja ei-parametrisilla työkaluilla. Student-t- ja Mann-Whitney-testejä käytetään kliinisten, demografisten ja laboratorioparametrien välisten yhteyksien arvioimiseen. Alfa = 0,05 tai 5 % merkitsevyystaso nollahypoteesin hylkäämiseksi vahvistetaan.

Näytteen koon laskeminen:

Näytteen koko määritettiin sen populaation prosenttiosuuden perusteella, jolla oli ja ei MS-tautia, joka osoitti havaittavaa HERV-W:n ilmentymistä PBMC:ssä. Vaikka MS-potilaiden määrä, joilla on aktiivisuus retrovirusvaippa on lähes 95%, oletamme konservatiivisempia arvoja näytelaskennassa. Siksi, jos oletetaan, että ilmentyminen on 50 % ja 10 % tapauksille ja kontrolleille, vastaavasti, 28 tapauksen ja 28 kontrollin otoskoko on välttämätön, perustuen luottamustasoon = 95 %:n teho 80 %:n havaitsemiseksi Kelsey-menetelmän mukaisesti. Siten, koska tutkijat analysoivat kolme ryhmää (MS-tautia sairastavia, ilman MS-tautia ja muita neurologisia sairauksia), koehenkilöiden kokonaismäärä on 84, 28 per ryhmä.