人内源性逆转录病毒W型和疱疹病毒的临床和MRI多发性硬化活动和表达比较

背景/理由：

多发性硬化症 (MS) 是一种影响脊髓（尤其是后脊髓）的炎症性脱髓鞘疾病。 MS 的临床异质性已得到充分描述，但目前已知 MS 的病变和中枢神经系统 (CNS) 病理破坏所涉及的潜在机制也是异质的。 它是一种多因素疾病，其中一种免疫致病机制被认为是造成髓鞘鞘破坏的原因。

然而，MS 炎症性关节病变的病理学表明，针对 CNS 髓磷脂成分的特异性自身免疫反应可能在髓磷脂的破坏中起着至关重要的作用。 脑脊液中高水平的寡克隆免疫球蛋白 G (IgG) 与主要组织相容性复合体 (MHC) 位点的联系、MS 病变中对髓磷脂有反应的 B 细胞和 T 细胞的扩增以及免疫接种这一事实支持了这一概念髓磷脂蛋白在动物中诱发 MS 样疾病，即实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)。

已在 MS 患者中观察到各种髓鞘蛋白的自身反应性，包括髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG) 中的髓鞘相关糖蛋白。

然而，值得注意的是，与其他髓鞘蛋白相比，MS 患者的 T 细胞显示出针对 MOG 的主要活性，并且鉴定出抗 MOG 抗体与 MS 急性损伤中轴突周围的髓鞘崩解有关。 此外，用 MOG 致敏可在啮齿动物模型和灵长类动物中重现 MS 的临床和脱髓鞘退行性病理学。

还假设了 MS 的传染性病因，并且在几年内，已经提出许多不同的病毒来触发免疫病理学。 检测到 EBV、水痘带状疱疹病毒和风疹病毒的抗体数量增加，同时在 MS 患者的血液和脑部病变中检测到特定蛋白质人内源性逆转录病毒 (HERV)，特别是 HERV-W 家族。

HERV 起源于古代外源性逆转录病毒对种系宿主细胞的感染，如今约占人类基因组的 8%。

逆转录病毒多发性硬化症相关（MRSV）是一种具有逆转录酶活性的包膜病毒，代表了HERV-W家族人类基因组的原型。

MRSV 是在软脑膜、脉络丛和 MS 患者的单核细胞/巨噬细胞培养物中分离出来的，它们的来源仍在调查中。 有人提出，颗粒起源于 MSRV 原病毒 HERV-W 修饰，或从同一外源家族的成员传播。 MSRV 病毒体具有超抗原等特性，它们可诱导人外周血中的单核细胞产生细胞因子。

与逆转录酶活性 (RT) 相关的 HERV 颗粒被证实是 MSRV 表达的标志。 通过 RT PCR 检测 MSRV 病毒粒子的方案旨在检测它们在患者血清和脑脊液 (CSF) 中的存在。

对 MS 患者和对照人群的独立研究表明，MS 和 MSRV 与其预后之间存在相关性，包括复发缓解型 MS 向继发性进展型 (SP-MS) 的转变。

平行研究显示了 MSRV 病毒粒子的免疫发病机制，并确定了 MSRV 的包膜蛋白 (Env) 负责促炎和超抗原性免疫。 Env 抗原在 MS 患者的大脑尸检研究中被检测到。

当 HERV-W 存在于宿主基因组中时，与 MS 相关的环境病毒对 HERV-W 启动子的反式激活也被证明会诱导 HERV-W 的表观遗传失调。

当然，与 MS 相关的最重要的疱疹病毒是 EBV，EBV 血清学与 MS 发展之间的比率已得到广泛研究。 此外，不可否认，EBV 与免疫系统之间的相互作用会导致持续的免疫反应和淋巴细胞的永生化。 也有研究将 EBV 的表达与 MS 的更高活性相关联。 最后，EBV 和内源性逆转录病毒之间的相互作用是最近的一个引人入胜的研究领域。

EBV 是 1971 年第一个被认为是 MS 潜在病因的疱疹病毒科成员。 由于几个因素，EBV 是一个可能的候选者：它在自然界中广泛存在，需要长时间的静止病毒感染，这种病毒感染在重新激活和调节人体免疫系统期间具有持续的生产。

很难将MS联系起来证明EBV是自身免疫病发病前发生的病毒感染。 波尔等。表明，与对照组相比，欧洲 MS 患者（儿童）的 EBV 血清阳性率高出 99%，在 72% 的人群中发现了病毒抗体。

莱文等。在 MS 之前通过血清抗体滴度估计病毒感染的时间，并与对照组进行比较。 这项研究访问了大约 800 万名美国陆军雇员的医疗记录，他们存储了血液样本。 在该组中，将 305 人后来发展为 MS 的病例对照研究与选择的 610 名对照受试者配对； 10 名发展为 MS 的病例和 32 名对照者最初为 EBV 血清反应阴性。 所有病例在 MS 之前都变成了 EBV 阳性，而只有 35.7% 的对照组发生了血清转化。

其他研究也试图评估针对 EBV 的抗体滴度与 MS 发病之间的关系。 根据 De Lorenze 等人的工作，MS 患者在出现 MS 首发症状前 20 年抗体显着增加。 这一事实可以用两种方式解释：先前感染的存在改变了 EBV 受体细胞（记忆 T 细胞）的平衡，或者再次感染了不同的 EBV 毒株。

EBV 感染 B 淋巴细胞并持续具有高度免疫原性。 抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞持续产生并在数量上增加以响应原发性感染和高病毒血症。 这种免疫控制对于预防 EBV 相关的恶性肿瘤至关重要。 在其调节作用中，通过表达潜伏抗原设法拯救受感染的 B 淋巴细胞，并帮助它们分化为病毒持续存在的记忆 B 细胞。 然而，尚未确定增加的 EBV 特异性 T 细胞是否是对通过特异性识别髓磷脂抗原而增加的刺激的反应。 EBV 病毒载量在 MS 中不是很高，此外，对该病毒特异的 T 细胞似乎无法与没有 MS 的宿主中的相同细胞区分开来。

另一位研究者指出，在 MS 重新激活期间，与缓解期相关的病毒复制活动增加。 与没有体液反应的患者相比，对 EBV 早期抗原有抗体反应的患者更有可能显示疾病活动，如通过含钆 MRI 测量的。 这些数据使我们相信疾病的活动可能与潜伏的 EBV 感染以及疾病进展有关。

将抗巨细胞病毒 (CMV) 抗体水平与 MS 相关联的研究存在争议。 虽然大多数结果显示 MS 患者的 CMV 感染率很高，但另一方面，观察到该疾病的表现较轻。

一些研究人员在 MS 和健康个体中寻找抗 CMV 抗体的存在。 他们发现 98% 的 MS 患者呈阳性，而对照组为 52%。

另一项研究表明，具有抗 CMV 抗体的患者：发病年龄较晚，疾病再激活率较低，MRI 上脑萎缩迹象较少。 与滴度较低的患者相比，这些抗体滴度较高的患者脑萎缩和影像学检查损伤较少。 模拟 MS 模式的动物模型表明，CMV 感染的动物在临床表现前的脱髓鞘框架比未感染的动物弱。 这些研究表明 CMV 感染对 MS 中的免疫反应具有有益的调节作用。

疱疹病毒（HHV-6 和 HHV-7）密切相关，具有相似的生物学模式。 这些病毒能够感染免疫系统的细胞并调节它们的功能。 Krukle-Nora 等人描述的工作。试图通过分析患者的外周血来研究 MS 中 HHV-6 和 HHV-7 之间的关联。 患者被随机选择并分为 2 组：14 名患者患有复发缓解型 MS (RR-MS) 和 14 名患者患有继发性进展型 MS (SP-MS)。 所有研究患者至少 3 个月未使用免疫抑制药物。 在 28 名患者中，25 名患有潜伏性 HHV-6 感染和/或 HHV-7。 在 9 名 RR-MS 患者和 9 名 SP-MS 患者中发现了 HHV-6。 在 10 名 RR-MS 患者和 14 名 SP-MS 患者中发现了 HHV-7。

两名研究人员使用荧光原位杂交技术检查人类尸体组织，以评估 MS 患者受影响组织和无病脑样本中白质早期和晚期病毒基因的表达。 HHV-6基因在所有样本中均有发现，且仅限于少突胶质细胞。 病毒 RNA 表达的定量分析表明，在两组 MS 患者（有和没有白质变化的脑组织）样本中，该病毒的表达水平明显更高。 此外，他们表明受损组织与更高的病毒表达相关，这一事实有助于 HHV-6 理论与 MS 的发病机制有关。

使用所有这些方法对病毒观察到相互矛盾的结果。 事实上，当所使用的技术无法区分 HHV-6 的主动感染和潜伏感染时（通过分析血液中的白细胞、含有细胞的脑脊液和 CNS 组织），样本患者和患者之间没有差异。对照组。 然而，当诊断技术专门用于检测 HHV-6 的活性时，观察到 HHV-6 与 MS 的发病机制之间存在很强的相关性。 我们小组最近研究了 HERV-W 包膜蛋白与 MOG 之间的相似性水平。 MOG 包膜的比较确定了 MOG-like 的五个 IgG 样结构域的扩展，推测 HERV-W 可能参与 MS 的免疫发病机制，也许是为了促进免疫系统识别 MOG 逆转录病毒区域。 我们还表明，大多数患者在某种程度上表现出 HERV-W 包膜的表达。 十个测试样本中有九个具有中高水平的 HERV-W 包膜表达，而健康对照中的表达水平非常低或没有活性，证实了我们人群中 MS 活性与 HERV-W 之间的关联。

意大利最近的一项研究表明，EBV 在体外刺激血液和大脑细胞中 HERV-W 的表达。 他们提出 MS 的发病机制，一个可能的模型可能包括 EBV 作为 MS 的初始触发因素，多年后，并显示 HERV-W 对 MS 的致病性是真实的，与缓解形式的疾病行为惊人地平行贡献者上诉人。

目标：

主要目标：将 MS 活动的临床和影像学与 MS 患者血液中 HERV-W 和疱疹病毒科病毒的定量评估相关联。

次要目标：

评估 HERV-W 和疱疹病毒的表达，并比较 MS 患者和有或没有其他神经系统疾病的健康对照者的病毒表达。

意义：

MS 是一种多因素疾病，具有遗传和环境病因。 研究人员对相关因素建立因果关系很感兴趣。 几种病毒与发病机制和疾病活动有关。 尽管疱疹病毒和 HERV-W 病毒在尝试建立 MS 的因果关系和活性方面最为重要，但直到现在，关于这些病毒在疾病的病因学和发展中的作用，仍有许多问题悬而未决。

假设：

通过这项工作，有望找到更多关于与 MS 相关的发病机制和炎症活动的可能答案，从而提供更一致的数据，这将有助于针对这种病理学制定越来越具体和有效的疗法。

方法：

最初，将使用商业试剂盒通过 ELISA 免疫测定法分析所有样本，以检测参与者血清中的 IgG 和免疫球蛋白 M (IgM) 抗 EBV 和 CMV 抗体。

将根据制造商的说明进行核酸提取（DNA 和 RNA）。 在表达分析（以及转录本检测）中将采用所有确保 RNA 纯度和样本中不含 DNA 的方案。 因此，对核酸进行 DNAse 处理并通过 RT-PCR HERV-W 进行验证。 只有含有 RNA 的样本才会被转录并进行进一步分析。 HERV-W 的 RNA 定量将通过对 HERV-W 家族的亚型 MSRV 特异的定量聚合酶链反应 (qRT-PCR) 在单核细胞 (PBMC) 上进行。

疱疹病毒 DNA 的检测最初将通过 PCR 进行，使用两组引物（HSVPAN 和 VZVPAN）。 扩增后用 BamHI 和 BstUI 进行酶消化，以分型疱疹病毒八种类型，包括人疱疹病毒 6（6A 和 6B）。 对于证明呈阳性的样本，将针对特定病毒进行 qRT-PCR。

设计：

将进行一项前瞻性纵向研究，收集生物材料并设立对照组。 该项目将由个人通过自由和知情同意的条款进行分析。 只有签署同意书，患者才能参与本次调查。

来自神经科门诊（CATEM 和其他专科）的患者的血样将在合格专业人员的例行访问期间完成。 血库中的患者血液将与常规检查一起收集。 收集到的所有材料将被送到圣保罗大学热带医学研究所的病毒学实验室，在那里进行实验室测试。

将根据 Freedman 等人提出的标准，通过分析年化复发率、EDSS 量表增加和 MRI 上增加的颅骨病变以及分类为轻度、中度和重度的疾病活动来评估患者的临床和影像学疾病活动程度。 头颅 MRI 将仅对患有 MS 和其他神经系统疾病的人群进行。

统计方法：

在实验室测试结果之后，将对数据进行分析并接受必要的处理，以使用参数和非参数工具对其进行统计解释和与疾病活动进行比较。 Student-t 和 Mann-Whitney 测试将用于评估临床、人口统计和实验室参数之间的关联。 alpha = 0.05 或 5% 的显着性水平将被固定以拒绝原假设。

样本量计算：

样本大小是根据显示 PBMC 中 HERV-W 可检测表达的有和没有 MS 的人群的百分比确定的。 尽管表现出活性逆转录病毒包膜的 MS 患者数量接近 95%，但我们为样本计算假设了更保守的值。 因此，假设病例和对照的表达分别为 50% 和 10%，根据 Kelsey 方法，基于置信水平 = 95% 检测 80% 的能力，需要 28 个病例和 28 个对照的样本量。 因此，由于研究人员将分析三组（有 MS、无 MS 和其他神经系统疾病），因此总 N 为 84 名受试者，每组 28 名。