Porównanie aktywności klinicznej i MRI stwardnienia rozsianego oraz ekspresji ludzkiego endogennego retrowirusa typu W i herpeswirusa

Tło/uzasadnienie:

Stwardnienie rozsiane (SM) to zapalna choroba demielinizacyjna, która atakuje rdzeń kręgowy (zwłaszcza tylne rdzenie). Kliniczna heterogeniczność SM jest dobrze opisana, ale obecnie wiadomo, że zmiany SM i mechanizmy leżące u podstaw patologicznego zniszczenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są również heterogenne. Jest to choroba wieloczynnikowa, w której za zniszczenie otoczki mielinowej uważa się jeden mechanizm immunopatogenny.

Jednak patologia zmian zapalnych stawów w SM sugeruje, że specyficzne odpowiedzi autoimmunologiczne przeciwko składnikom mieliny OUN mogą odgrywać kluczową rolę w niszczeniu mieliny. Potwierdzeniem tej koncepcji jest wysoki poziom oligoklonalnej immunoglobuliny G (IgG) w płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez wiązanie z locus głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), ekspansja komórek B i T reagujących na mielinę w zmianach SM oraz fakt, że immunizacja białka mieliny indukują chorobę podobną do SM u zwierząt, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE).

U pacjentów ze stwardnieniem rozsianym obserwowano autoreaktywność różnych białek mieliny, w tym zasadowego białka mieliny, białka proteolipidowego i glikoproteiny związanej z mieliną w glikoproteinie oligodendrocytów mieliny (MOG).

Należy jednak zauważyć, że limfocyty T pacjentów z SM wykazują dominującą aktywność przeciwko MOG w stosunku do innych białek mieliny, a przeciwciała anty-MOG zostały zidentyfikowane w związku z rozpadem mieliny wokół aksonów w ostrych zmianach SM. Ponadto uczulenie za pomocą MOG odtwarza kliniczną i demielinizacyjną patologię zwyrodnieniową SM w modelach gryzoni i naczelnych.

Postulowano również zakaźną etiologię stwardnienia rozsianego, a przez kilka lat sugerowano, że wiele różnych wirusów wywołuje immunopatologię. Wykryto podwyższone miano przeciwciał przeciwko EBV, wirusowi ospy wietrznej i półpaśca oraz wirusowi różyczki, aw krwi i zmianach mózgowych u pacjentów z SM wykryto specyficzne białka ludzkich endogennych retrowirusów (HERV), w szczególności z rodziny HERV-W.

HERV powstał w wyniku starożytnych infekcji komórek gospodarza linii zarodkowej przez egzogenne retrowirusy i obecnie stanowi około 8% ludzkiego genomu.

Retrowirus związany ze stwardnieniem rozsianym (MRSV) jest wirusem otoczkowym o aktywności odwrotnej transkryptazy, który reprezentuje prototyp ludzkiego genomu rodziny HERV-W.

MRSV został wyizolowany z opon mózgowo-rdzeniowych, splotu naczyniówkowego i hodowli monocytów/makrofagów pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, a jego pochodzenie jest wciąż badane. Sugerowano, że cząstki pochodzą z prowirusa MSRV HERV-W zmodyfikowanego lub przeniesionego z członka tej samej egzogennej rodziny. Wiriony MSRV mają właściwości superantygenów, indukują produkcję cytokin przez komórki jednojądrzaste w krwi obwodowej człowieka.

Potwierdzono, że cząstki HERV związane z aktywnością odwrotnej transkryptazy (RT) są cechą charakterystyczną ekspresji z MSRV. Opracowano protokół wykrywania wirionów MSRV metodą RT PCR w celu wykrycia ich obecności w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjenta.

Niezależne badania na pacjentach ze stwardnieniem rozsianym i populacjach kontrolnych wykazały korelacje między stwardnieniem rozsianym a MSRV i jego rokowaniem, w tym konwersją rzutowo-remisyjnej postaci stwardnienia rozsianego do postaci wtórnie postępującej (SP-MS).

Równoległe badania wykazały immunopatogenezę wirionów MSRV i zidentyfikowały białko otoczki (Env) MSRV jako odpowiedzialne za prozapalne i superantygeniczne właściwości immunologiczne. Antygen Env wykryto u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w badaniach pośmiertnych mózgu.

Wykazano również, że transaktywacja promotorów HERV-W przez wirusa środowiskowego związanego ze stwardnieniem rozsianym indukuje dysregulację epigenetyczną w HERV-W, gdy jest obecny w genomie gospodarza.

Z pewnością najważniejszym wirusem opryszczki związanym ze stwardnieniem rozsianym jest EBV, stosunek między serologią EBV a rozwojem stwardnienia rozsianego był szeroko badany. Ponadto niezaprzeczalne są interakcje między EBV a układem odpornościowym, prowadzące do trwałej odpowiedzi immunologicznej i unieśmiertelnienia limfocytów. Istnieją również badania korelujące ekspresję EBV z większą aktywnością SM. Wreszcie, interakcja między EBV a endogennymi retrowirusami to nowa i fascynująca dziedzina badań.

EBV był pierwszym członkiem rodziny Herpesviridae, który został uznany za potencjalną przyczynę SM w 1971 roku. EBV jest potencjalnym kandydatem ze względu na kilka czynników: jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, wymaga długiej nieaktywnej infekcji wirusowej, która ma ciągłą produkcję z powodu okresów reaktywacji i moduluje ludzki układ odpornościowy.

Trudność w powiązaniu stwardnienia rozsianego w celu udowodnienia, że ​​EBV jest infekcją wirusową, wystąpiła przed wystąpieniem choroby autoimmunologicznej. Pohl i in. wykazali, że seropozytywność EBV u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w Europie (dzieci) - była o 99% wyższa w porównaniu z grupą kontrolną, w której przeciwciała przeciwko wirusowi stwierdzono u 72%.

Levin i in. oszacowali czas infekcji wirusowej na podstawie mian przeciwciał w surowicy przed SM i porównali z grupą kontrolną. W badaniu tym uzyskano dostęp do dokumentacji medycznej około 8 milionów pracowników armii amerykańskiej, którzy przechowywali próbki krwi. Z tej grupy połączono w pary badanie kliniczno-kontrolne, w którym 305 osób zgłosiło się później z powodu stwardnienia rozsianego i wybrano 610 osób kontrolnych; 10 przypadków, u których rozwinęło się stwardnienie rozsiane i 32 grupy kontrolne, były początkowo seronegatywne w kierunku EBV. Wszystkie przypadki stały się pozytywne EBV przed SM, w porównaniu z zaledwie 35,7% kontroli, które przeszły serokonwersję.

Inne badania również próbowały ocenić związek między mianami przeciwciał przeciwko EBV a początkiem stwardnienia rozsianego. Zgodnie z pracą De Lorenze i wsp., pacjenci ze stwardnieniem rozsianym mieli znaczny wzrost przeciwciał 20 lat przed pierwszymi objawami stwardnienia rozsianego. Fakt ten można wytłumaczyć na dwa sposoby: istnienie wcześniejszej infekcji zmieniającej równowagę komórek receptorowych EBV (komórek T pamięci) lub ponowne zakażenie innym szczepem EBV.

EBV infekuje limfocyty B i jest trwale wysoce immunogenny. Cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla antygenu są wytwarzane w sposób ciągły, a ich liczba wzrasta w odpowiedzi na pierwotną infekcję i wysoką wiremię. Ta kontrola immunologiczna jest niezbędna do zapobiegania nowotworom złośliwym związanym z EBV. W swoim działaniu modulującym udaje mu się uratować zakażone limfocyty B poprzez ekspresję utajonych antygenów i pomaga im różnicować się w komórki B pamięci, w których wirus utrzymuje się. Nie ustalono jednak, czy zwiększona liczba limfocytów T swoistych dla EBV jest odpowiedzią na zwiększoną stymulację poprzez swoiste rozpoznawanie antygenów mieliny. Obciążenie wirusem EBV nie jest bardzo wysokie w stwardnieniu rozsianym, ponadto komórki T specyficzne dla tego wirusa nie wydają się odróżniać od tych samych komórek u gospodarzy bez stwardnienia rozsianego.

Inny badacz stwierdza, że ​​w okresach reaktywacji SM występuje zwiększona aktywność replikacji wirusa w stosunku do okresów remisji. Pacjenci z odpowiedzią przeciwciał na wczesny antygen EBV częściej wykazują aktywność choroby mierzoną za pomocą MRI z użyciem gadolinu, w porównaniu z pacjentami bez odpowiedzi humoralnej. Dane te skłoniły nas do przekonania, że ​​aktywność choroby może być związana z utajoną infekcją EBV, jak również z postępem choroby.

Badania korelujące poziomy przeciwciał przeciwko wirusowi cytomegalii (CMV) i SM są kontrowersyjne. Chociaż większość wyników wskazuje na wysokie wskaźniki zakażenia CMV u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, z drugiej strony obserwuje się łagodniejszy przebieg choroby.

Niektórzy badacze szukali obecności przeciwciał anty-CMV u osób ze stwardnieniem rozsianym i osób zdrowych. Znaleźli pozytywny wynik u 98% pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w porównaniu z 52% w grupie kontrolnej.

Inni badacze wykazali, że pacjenci, którzy mieli przeciwciała przeciwko CMV, byli: w późniejszym wieku zachorowania, niższym odsetkiem reaktywacji choroby i mniejszą liczbą objawów atrofii mózgu w MRI. Ci, którzy mieli wyższe miana tych przeciwciał, mieli mniejszą atrofię mózgu i mniej zmian w badaniach obrazowych, w porównaniu z pacjentami, którzy mieli niższe miana. Model zwierzęcy z naśladującymi wzorce SM wykazał, że zwierzęta z infekcjami CMV z demielinizacją przed objawami klinicznymi były słabsze niż te niezakażone. Badania te sugerują korzystny modulujący wpływ zakażenia CMV na odpowiedź immunologiczną w SM.

Herpeswirusy (HHV-6 i HHV-7) są blisko spokrewnione i mają podobny wzór biologiczny. Wirusy te są zdolne do infekowania komórek układu odpornościowego i modulowania ich funkcji. Praca opisana przez Krukle-Nora i in. próbowali zbadać związki między HHV-6 i HHV-7 w SM, analizując krew obwodową pacjentów. Pacjentów wybrano losowo i podzielono na 2 grupy: 14 pacjentów z rzutowo-remisyjną postacią stwardnienia rozsianego (RR-MS) i 14 z wtórnie postępującą postacią stwardnienia rozsianego (SP-MS). Wszyscy badani pacjenci nie stosowali leków immunosupresyjnych przez co najmniej 3 miesiące. Spośród 28 pacjentów 25 miało utajoną infekcję HHV-6 i/lub HHV-7. HHV-6 stwierdzono u 9 pacjentów z RR-MS i 9 z SP-MS. HHV-7 stwierdzono u 10 pacjentów z RR-MS i 14 z SP-MS.

Dwóch badaczy, stosując technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, zbadało tkanki ludzkich zwłok w celu oceny ekspresji wczesnych i późnych genów wirusowych w istocie białej w dotkniętej chorobą tkance pacjentów ze stwardnieniem rozsianym oraz w próbkach mózgu bez choroby. Gen HHV-6 został znaleziony we wszystkich próbkach i był ograniczony do oligodendrocytów. Ilościowa analiza ekspresji wirusowego RNA wykazała, że ​​w obu grupach pacjentów z SM (tkanka mózgowa ze zmianami istoty białej i bez) próbki miały istotnie wyższy poziom ekspresji tego wirusa. Ponadto wykazali, że uszkodzone tkanki były skorelowane z wyższą ekspresją wirusa, fakt, który przyczynia się do teorii, że HHV-6 jest zaangażowany w patogenezę SM.

Przy użyciu wszystkich tych metod dla wirusa zaobserwowano sprzeczne wyniki. W rzeczywistości, gdy zastosowane technologie nie były w stanie odróżnić aktywnego od utajonego zakażenia HHV-6 (poprzez analizę leukocytów z krwi, komórek zawierających płyn mózgowo-rdzeniowy i tkanki OUN), nie stwierdzono różnic między próbkami pacjentów i grupa kontrolna. Jednakże, gdy technologie diagnostyczne są stosowane specjalnie do wykrywania aktywności HHV-6, obserwuje się silną korelację między HHV-6 a patogenezą SM. Nasza grupa niedawno zbadała poziom podobieństwa między białkiem otoczki HERV-W i MOG. Porównanie otoczki MOG zidentyfikowało pięć domen IgG-podobnych MOG-podobnych rozszerzając ideę, że HERV-W może być zaangażowany w immunopatogenezę stwardnienia rozsianego, być może w celu ułatwienia rozpoznawania przez układ odpornościowy regionów retrowirusowych MOG. Wykazaliśmy również, że większość pacjentów wykazywała ekspresję otoczki HERV-W na pewnym poziomie. Dziewięć z dziesięciu testowanych próbek miało średnie lub wysokie poziomy ekspresji otoczki HERV-W w porównaniu z bardzo niskimi poziomami ekspresji lub brakiem aktywności u zdrowych osób kontrolnych, potwierdzając związek między aktywnością stwardnienia rozsianego a HERV-W w naszej populacji.

Niedawne badanie przeprowadzone we Włoszech wykazało, że EBV stymuluje ekspresję HERV-W w komórkach krwi i mózgu in vitro. Sugerują, że patogeneza stwardnienia rozsianego, możliwy model, mógłby obejmować EBV jako początkowy czynnik wyzwalający stwardnienie rozsiane wiele lat później, i pokazuje HERV-W jako prawdziwy dla patogenności stwardnienia rozsianego, w uderzającej równoległości z zachowaniem choroby w jej postaci remisji wnoszący odwołanie.

Cele:

Główny cel: skorelować kliniczną i obrazową aktywność stwardnienia rozsianego z ilościową oceną HERV-W i wirusów z rodziny Herpesviridae we krwi pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Cel drugorzędny:

Oceń ekspresję HERV-W i wirusa opryszczki i porównaj ekspresję wirusów wśród pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i zdrowych osób kontrolnych z innymi chorobami neurologicznymi i bez nich.

Znaczenie:

Stwardnienie rozsiane jest chorobą wieloczynnikową, o etiologii genetycznej i środowiskowej. Zainteresowanie badaczy czynnikami powiązanymi jest duże, aby ustalić związek przyczynowy. Z patogenezą i aktywnością choroby powiązano kilka wirusów. Chociaż wirusy opryszczki i HERV-W są najważniejsze w próbie ustalenia związku przyczynowego i aktywności SM, do tej pory pozostaje wiele otwartych pytań dotyczących roli tych wirusów w etiologii i rozwoju choroby.

Hipoteza:

Dzięki tej pracy oczekuje się znalezienia większej liczby możliwych odpowiedzi na temat etiopatogenezy i aktywności zapalnej związanej z SM, a tym samym dostarczenia bardziej spójnych danych, które pomogą sformułować coraz bardziej specyficzne i skuteczne terapie skierowane na tę patologię.

Metody:

Początkowo wszystkie próbki będą analizowane testem immunologicznym ELISA w celu wykrycia przeciwciał IgG i immunoglobuliny M (IgM) anty-EBV i CMV w surowicy uczestników, przy użyciu komercyjnych zestawów.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych (DNA i RNA) zostanie przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta. Wszystkie protokoły zapewniające czystość RNA i brak DNA w próbkach zostaną przyjęte w analizie ekspresji (a tym samym wykrywaniu transkryptów). Tak więc kwasy nukleinowe poddaje się działaniu DNAzy i weryfikacji metodą RT-PCR HERV-W. Tylko próbki zawierające RNA zostaną poddane transkrypcji i dalszej analizie. Oznaczenie ilościowe RNA HERV-W zostanie wykonane na komórkach jednojądrzastych (PBMC) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qRT-PCR) swoistej dla podtypu MSRV z rodziny HERV-W.

Wykrywanie DNA wirusa opryszczki będzie początkowo przeprowadzane metodą PCR, przy użyciu dwóch zestawów starterów (HSVPAN i VZVPAN). Po amplifikacji przeprowadza się trawienie enzymatyczne BamHI i BstUI w celu typowania ośmiu typów herpeswirusa, w tym ludzkiego herpeswirusa 6 (6A i 6B). W przypadku próbek, które okażą się pozytywne, zostanie przeprowadzony test qRT-PCR dla określonych wirusów.

Projekt:

Przeprowadzone zostanie prospektywne, podłużne badanie, w którym pobrano materiał biologiczny i obecność grupy kontrolnej. Projekt ten zostanie przeanalizowany przez poszczególne osoby, poprzez okres dobrowolnej i świadomej zgody. Tylko po podpisaniu formularza zgody pacjent będzie mógł wziąć udział w tej ankiecie.

Próbki krwi pacjentów z poradni neurologicznej (CATEM i innych specjalności) będą pobierane podczas rutynowej wizyty wykwalifikowanego specjalisty. Krew pacjentów z Banku Krwi będzie pobierana w związku z rutynowo wykonywanymi badaniami. Wszystkie zebrane materiały zostaną przesłane do laboratorium wirusologicznego w Instytucie Medycyny Tropikalnej Uniwersytetu w São Paulo, gdzie wykonywane są badania laboratoryjne.

Pacjenci będą oceniani pod kątem stopnia klinicznej i obrazowej aktywności choroby poprzez analizę rocznej częstości nawrotów, wzrostów w skali EDSS i zwiększonych uszkodzeń czaszki w badaniu MRI oraz aktywności choroby sklasyfikowanej jako ŁAGODNA, UMIARKOWANA i CIĘŻKA zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez Freedmana i in. MRI czaszki będzie wykonywane tylko dla grup ze stwardnieniem rozsianym i innymi chorobami neurologicznymi.

Metody statystyczne:

Po uzyskaniu wyników badań laboratoryjnych dane zostaną przeanalizowane i poddane niezbędnej obróbce w celu ich statystycznej interpretacji i porównania z aktywnością choroby za pomocą narzędzi parametrycznych i nieparametrycznych. Do oceny zależności między parametrami klinicznymi, demograficznymi i laboratoryjnymi posłużą testy Studenta-t i Manna-Whitneya. Poziom istotności alfa = 0,05 lub 5% do odrzucenia hipotezy zerowej zostanie ustalony.

Obliczanie wielkości próbki:

Wielkość próby określono na podstawie odsetka populacji ze stwardnieniem rozsianym i bez stwardnienia rozsianego wykazującego wykrywalną ekspresję HERV-W w PBMC. Chociaż liczba pacjentów ze stwardnieniem rozsianym wykazującym aktywność otoczki retrowirusa jest bliska 95%, zakładamy bardziej konserwatywne wartości do obliczenia próbki. Dlatego też, zakładając ekspresję odpowiednio o 50% i 10% dla przypadków i kontroli, konieczna jest wielkość próby 28 przypadków i 28 kontroli, w oparciu o poziom ufności = 95% mocy do wykrycia 80%, zgodnie z metodą Kelseya. Tak więc, ponieważ badacze przeanalizują trzy grupy (z SM, bez SM i innymi chorobami neurologicznymi), całkowita N wynosi 84 osobników, po 28 na grupę.