Comparación entre la actividad clínica y de resonancia magnética de la esclerosis múltiple y la expresión del retrovirus endógeno humano tipo W y el herpesvirus

Antecedentes/Razones:

La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria desmielinizante que afecta la médula espinal (especialmente en las médulas posteriores). La heterogeneidad clínica de la EM está bien descrita, pero actualmente se sabe que las lesiones de la EM y los mecanismos subyacentes implicados en la destrucción patológica del sistema nervioso central (SNC) también son heterogéneos. Es una enfermedad multifactorial en la que se sugiere un mecanismo inmunopatogénico como responsable de la destrucción de la vaina de mielina.

Sin embargo, la patología de las lesiones articulares inflamatorias de la EM sugiere que las respuestas autoinmunes específicas contra los componentes de la mielina del SNC pueden tener un papel crucial en la destrucción de la mielina. Este concepto está respaldado por el alto nivel de inmunoglobulina G (IgG) oligoclonal en el líquido cefalorraquídeo mediante la unión con el locus del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), la expansión de las células B y T reactivas a la mielina en las lesiones de EM y el hecho de que la inmunización con proteínas de mielina induce una enfermedad similar a la EM en animales, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE).

La autorreactividad de varias proteínas de mielina, incluida la proteína básica de mielina, la proteína proteolipídica y la glicoproteína asociada a mielina en la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), se ha observado en pacientes con EM.

Sin embargo, se observa que las células T de pacientes con EM muestran una actividad predominante contra MOG en relación con otras proteínas de mielina, y se identificaron anticuerpos anti-MOG relacionados con la desintegración de la mielina alrededor de los axones en lesiones agudas de EM. Además, la sensibilización con MOG reproduce la patología clínica y degenerativa desmielinizante de la EM en modelos de roedores y primates.

También se ha postulado una etiología infecciosa de la EM y, durante varios años, se ha sugerido que varios virus diferentes desencadenan la inmunopatología. Se detectaron títulos aumentados de anticuerpos para el VEB, el virus de la varicela zoster y el virus de la rubéola, mientras que se detectaron proteínas específicas de retrovirus endógenos humanos (HERV), en particular de la familia HERV-W, en la sangre y lesiones cerebrales en pacientes con EM.

Los HERV surgieron de antiguas infecciones de células huésped de la línea germinal por retrovirus exógenos y hoy constituyen alrededor del 8% del genoma humano.

El retrovirus asociado a la esclerosis múltiple (MRSV), es un virus envuelto con actividad de transcriptasa inversa, que representa el prototipo del genoma humano de la familia HERV-W.

El MRSV fue aislado en leptomeninges, en plexo coroideo y en cultivos de monocitos/macrófagos de pacientes con EM y su origen aún está bajo investigación. Se ha sugerido que las partículas se originan a partir del provirus MSRV HERV-W modificado, o se transmiten desde un miembro de la misma familia exógena. Los viriones MSRV tienen propiedades como superantígenos, inducen la producción de citocinas por parte de las células mononucleares en la sangre humana periférica.

Se confirmó que las partículas de HERV asociadas con la actividad de transcriptasa inversa (RT) son un sello distintivo de la expresión de MSRV. Se diseñó un protocolo de detección del virión MSRV por RT PCR para detectar su presencia en suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) del paciente.

Estudios independientes en pacientes con EM y poblaciones de control mostraron correlaciones entre la EM y la MSRV y su pronóstico, incluida la conversión de EM recurrente-remitente en su forma secundaria progresiva (SP-MS).

Estudios paralelos demostraron la inmunopatogénesis de los viriones de MSRV e identificaron a la proteína de la envoltura (Env) de MSRV como responsable de la proinflamación y superantigenicidad inmune. El antígeno Env se detectó en pacientes con EM en estudios de cerebro post mortem.

También se ha demostrado que la transactivación de los promotores de HERV-W por virus ambientales asociados con la EM induce una desregulación epigenética en HERV-W, cuando está presente en el genoma del huésped.

Ciertamente, el virus del herpes más importante asociado con la EM es el EBV, la relación entre la serología del EBV y el desarrollo de la EM se ha estudiado ampliamente. Además, la interacción entre el EBV y el sistema inmunitario es innegable y conduce a una respuesta inmunitaria persistente ya la inmortalización de los linfocitos. También hay estudios que correlacionan la expresión de EBV con mayor actividad de MS. Finalmente, la interacción entre EBV y retrovirus endógenos es un campo de estudio reciente y fascinante.

EBV fue el primer miembro de la familia Herpesviridae implicado como una causa potencial de EM en 1971. El EBV es un posible candidato debido a varios factores: está muy extendido en la naturaleza, requiere una infección viral inactiva prolongada que tiene una producción continua debido a períodos de reactivación y modulación del sistema inmunológico humano.

La dificultad de asociar la EM para probar que el EBV es la infección por el virus ocurrió antes del inicio de la enfermedad autoinmune. Pohl et al. mostró que la seropositividad al VEB en pacientes con EM en Europa (niños) fue un 99 % más alta en comparación con el grupo de control, en el que se encontraron anticuerpos contra el virus en un 72 %.

Levin et al. estimó el tiempo de infección viral por títulos de anticuerpos séricos antes de la EM y comparó con un grupo de control. Este estudio tuvo acceso a los registros médicos de aproximadamente 8 millones de empleados del Ejército de los EE. UU. que tenían muestras de sangre almacenadas. De este grupo, se emparejó el estudio de casos y controles donde 305 personas llegaron a desarrollar posteriormente EM y 610 sujetos control seleccionados; 10 casos que desarrollaron EM y 32 controles fueron inicialmente seronegativos para EBV. Todos los casos se habían vuelto EBV positivos antes de la EM, en comparación con solo el 35,7% de los controles que se seroconvirtieron.

Otros estudios también han intentado evaluar la relación entre los títulos de anticuerpos contra el EBV y la aparición de la EM. Según el trabajo de De Lorenze et al., los pacientes con EM tenían un aumento significativo de anticuerpos 20 años antes de los primeros síntomas de EM. Este hecho puede explicarse de dos formas: la existencia de una infección previa alterando el equilibrio de las células receptoras del VEB (células T de memoria) o la reinfección con una cepa diferente del VEB.

El EBV infecta a los linfocitos B y es persistentemente altamente inmunogénico. Los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno se producen continuamente y aumentan en número en respuesta a la infección primaria y la alta viremia. Este control inmunológico es esencial para prevenir las neoplasias malignas relacionadas con el EBV. En su acción moduladora, consigue rescatar los linfocitos B infectados mediante la expresión de antígenos latentes y les ayuda a diferenciarse en células B de memoria, donde persiste el virus. Sin embargo, no se ha establecido si el aumento de células T específicas para EBV es una respuesta a una mayor estimulación por reconocimiento específico de antígenos de mielina. La carga viral de EBV no es muy alta en la EM, además, las células T específicas para este virus no parecen distinguirse de las mismas células en huéspedes sin EM.

Otro investigador afirma que durante los periodos de reactivación de la EM hay una mayor actividad de replicación del virus en relación a los periodos de remisión. Los pacientes con respuesta de anticuerpos al antígeno temprano de EBV tienen más probabilidades de mostrar actividad de la enfermedad medida por resonancia magnética con gadolinio, en comparación con pacientes sin respuesta humoral. Estos datos nos llevaron a creer que la actividad de la enfermedad puede estar relacionada con la infección latente por VEB, así como con la progresión de la enfermedad.

Los estudios que correlacionan los niveles de anticuerpos contra el citomegalovirus (CMV) y la EM son controvertidos. Aunque la mayoría de los resultados muestran altas tasas de infección por CMV en pacientes con EM, por otro lado, se observa una presentación más leve de la enfermedad.

Algunos investigadores buscaron la presencia de anticuerpos anti-CMV en EM e individuos sanos. Encontraron positivo en el 98% de los pacientes con EM en comparación con el 52% en el grupo de control.

Otros investigadores mostraron que los pacientes que tenían anticuerpos contra el CMV tenían una edad más avanzada de aparición de la enfermedad, tasas más bajas de reactivación de la enfermedad y menos signos de atrofia cerebral en la resonancia magnética. Aquellos que tenían títulos más altos de estos anticuerpos tenían menos atrofia cerebral y menos lesiones en las pruebas de imagen, en comparación con los pacientes que tenían títulos más bajos. Un modelo animal que imitaba los patrones de la EM demostró que los animales con infecciones por CMV con marco desmielinizante antes de las presentaciones clínicas eran más débiles que los no infectados. Estos estudios sugieren un efecto modulador beneficioso de la infección por CMV sobre la respuesta inmunitaria en la EM.

Los herpesvirus (HHV-6 y HHV-7) están estrechamente relacionados y tienen un patrón biológico similar. Estos virus son capaces de infectar células del sistema inmunitario y modular sus funciones. El trabajo descrito por Krukle-Nora et al. intentó investigar las asociaciones entre HHV-6 y HHV-7 en la EM analizando la sangre periférica de los pacientes. Los pacientes fueron seleccionados aleatoriamente y divididos en 02 grupos: 14 pacientes con EM remitente-recurrente (EM-RR) y 14 con EM progresiva secundaria (EM-SP). Todos los pacientes del estudio estuvieron al menos 3 meses sin uso de fármacos inmunosupresores. De los 28 pacientes, 25 tenían infección latente por HHV-6 y/o HHV-7. Se ha encontrado HHV-6 en 9 pacientes con RR-MS y 9 con SP-MS. Se encontraron HHV-7 en 10 pacientes con RR-MS y 14 con SP-MS.

Dos investigadores utilizando la técnica de hibridación fluorescente in situ, examinaron tejidos de cadáveres humanos para evaluar la expresión de genes virales tempranos y tardíos en la sustancia blanca en el tejido afectado de pacientes con EM y en muestras de cerebro sin enfermedad. El gen de HHV-6 se encontró en todas las muestras y se restringió a los oligodendrocitos. El análisis cuantitativo de la expresión del ARN viral mostró que en ambos grupos de pacientes con EM (tejido cerebral con y sin cambios en la sustancia blanca) las muestras tenían niveles significativamente más altos de expresión de este virus. Además, demostraron que los tejidos lesionados se correlacionaban con una mayor expresión viral, un hecho que contribuye a la teoría de que el HHV-6 está implicado en la patogenia de la EM.

Usando todos estos métodos para virus se observaron resultados contradictorios. De hecho, cuando las tecnologías utilizadas no fueron capaces de distinguir la infección activa de la latente por HHV-6 (por análisis de leucocitos de la sangre, de células que contienen líquido cefalorraquídeo y de tejido del SNC), no se encuentra diferencia entre las muestras de pacientes y el grupo de control Sin embargo, cuando se utilizan tecnologías de diagnóstico específicamente para la detección de la actividad del HHV-6, se observa una fuerte correlación entre el HHV-6 y la patogenia de la EM. Nuestro grupo ha investigado recientemente el nivel de similitud entre la proteína de la envoltura de HERV-W y MOG. Una comparación de la envoltura MOG identificó cinco dominios similares a IgG de MOG que amplían la idea de que el HERV-W puede estar involucrado en la inmunopatogénesis de la EM, tal vez para facilitar el reconocimiento por parte del sistema inmunitario de regiones retrovirales MOG. También hemos demostrado que la mayoría de los pacientes mostraron expresión de la envoltura HERV-W en algún nivel. Nueve de las diez muestras analizadas tenían niveles medios a altos de expresión de la envoltura de HERV-W frente a niveles de expresión muy bajos o sin actividad en controles sanos, lo que confirma la asociación entre la actividad de la EM y el HERV-W en nuestra población.

Un estudio reciente en Italia mostró que EBV estimula la expresión de HERV-W en células de sangre y cerebro in vitro. Sugieren que en la patogenia de la EM, un posible modelo podría incluir al EBV como desencadenante inicial de la EM, años después, y muestra al HERV-W como real a la patogenicidad de la EM, en sorprendente paralelismo con el comportamiento de la enfermedad en su forma remitente contribuyente el recurrente.

Objetivos:

Objetivo principal: correlacionar la actividad clínica y de imagen de la EM con la evaluación cuantitativa de HERV-W y virus de la familia Herpesviridae en la sangre de pacientes con EM.

Objetivo secundario:

Evalúe la expresión de HERV-W y Herpesvirus y compare la expresión de virus entre pacientes con EM y controles sanos con y sin otras enfermedades neurológicas.

Significado:

La EM es una enfermedad multifactorial, con etiología genética y ambiental. Es grande el interés de los investigadores en los factores asociados para establecer una relación causal. Varios virus se han relacionado con la patogenia y la actividad de la enfermedad. Aunque los virus herpes y HERV-W son los más importantes en el intento de establecer una relación causal y con la actividad de la EM, hasta el momento quedan muchas preguntas abiertas sobre el papel de estos virus en la etiología y desarrollo de la enfermedad.

Hipótesis:

Con este trabajo se espera encontrar más posibles respuestas sobre la etiopatogenia y la actividad inflamatoria relacionada con la EM, y así aportar datos más consistentes que ayuden a la formulación de terapias cada vez más específicas y eficaces dirigidas a esta patología.

Métodos:

Inicialmente, todas las muestras serán analizadas mediante inmunoensayo ELISA para la detección de anticuerpos IgG e inmunoglobulina M (IgM) anti-EBV y CMV en el suero de los participantes, utilizando kits comerciales.

Se realizará la extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN), según las instrucciones del fabricante. Todos los protocolos para asegurar la pureza del ARN y la ausencia de ADN en las muestras se adoptarán en el análisis de expresión (y por lo tanto en la detección de transcritos). Así, los ácidos nucleicos se someten a tratamiento con ADNsa y verificación por RT-PCR HERV-W. Solo las muestras que contengan ARN se transcribirán y se someterán a análisis posteriores. La cuantificación del ARN del HERV-W se realizará en células mononucleares (PBMC) mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR) específica para el subtipo MSRV de la familia HERV-W.

La detección del ADN del herpesvirus se realizará inicialmente mediante una PCR, utilizando dos juegos de cebadores (HSVPAN y VZVPAN). Después de la amplificación se lleva a cabo una digestión enzimática con BamHI y BstUI para tipificar los ocho tipos de herpesvirus incluyendo el herpesvirus humano 6 (6A y 6B). Para las muestras que resulten positivas, se realizará una qRT-PCR para virus específicos.

Diseño:

Se realizará un estudio longitudinal prospectivo que recoja material biológico y la presencia de un grupo control. Este proyecto será analizado por los particulares, mediante el término del consentimiento libre e informado. Solo al firmar el formulario de consentimiento, el paciente podrá participar en esta encuesta.

Las muestras de sangre de los pacientes del ambulatorio de neurología (CATEM y otras especialidades) se realizarán durante la visita de rutina por un profesional calificado. La sangre de los pacientes del Banco de Sangre se recolectará en conjunto con el examen que se realiza de forma rutinaria. Todos los materiales recolectados serán enviados al laboratorio de virología del Instituto de Medicina Tropical de la Universidad de São Paulo, donde se realizan las pruebas de laboratorio.

Se evaluará a los pacientes en cuanto al grado de actividad clínica y de imagen de la enfermedad mediante el análisis de la tasa anualizada de recaídas, los aumentos en la escala EDSS y el aumento de las lesiones craneales en la RM y la actividad de la enfermedad clasificada como LEVE, MODERADA y GRAVE según los criterios propuestos por Freedman et al. La resonancia magnética craneal se realizará únicamente para grupos con EM y con otras enfermedades neurológicas.

Métodos de estadística:

Luego de los resultados de las pruebas de laboratorio, los datos serán analizados y recibirán el tratamiento necesario para su interpretación estadística y comparación con la actividad de la enfermedad utilizando herramientas paramétricas y no paramétricas. Se utilizarán las pruebas Student-t y Mann-Whitney para evaluar asociaciones entre parámetros clínicos, demográficos y de laboratorio. Se fijará el nivel de significación de alfa = 0.05 o 5% para rechazar la hipótesis nula.

Cálculo del tamaño de la muestra:

El tamaño de la muestra se determinó en función del porcentaje de la población con y sin EM que mostraba una expresión detectable de HERV-W en PBMC. Aunque el número de pacientes con EM que presenta actividad de envoltura de retrovirus es cercano al 95%, asumimos valores más conservadores para el cálculo de la muestra. Por lo tanto, asumiendo una expresión del 50 % y 10 % para casos y controles, respectivamente, es necesario un tamaño de muestra de 28 casos y 28 controles, con base en un nivel de confianza = 95 % de poder de detección del 80 %, según el método de Kelsey. Así, como los investigadores analizarán tres grupos (con EM, sin EM y otras enfermedades neurológicas) el N total es de 84 sujetos, 28 por grupo.