Sammenligning mellem klinisk og MRI multipel skleroseaktivitet og ekspression af human endogen retrovirus type W og herpesvirus

Baggrund/Begrundelse:

Multipel sklerose (MS) er en inflammatorisk demyeliniserende sygdom, der påvirker rygmarven (især i bagmarvene). Den kliniske heterogenitet af MS er godt beskrevet, men i øjeblikket er det kendt, at læsioner af MS og mekanismer, der ligger til grund for den patologiske ødelæggelse af centralnervesystemet (CNS) også er heterogene. Det er en multifaktoriel sygdom, hvor en immunopatogene mekanisme foreslås som ansvarlig for ødelæggelsen af ​​skedens myelin.

Patologien af ​​inflammatoriske ledlæsioner af MS tyder imidlertid på, at specifikke autoimmune reaktioner mod komponenter i CNS myelin kan have en afgørende rolle i ødelæggelsen af ​​myelin. Dette koncept understøttes af det høje niveau af oligoklonalt immunoglobulin G (IgG) i cerebrospinalvæsken ved kobling med locus for det store histokompatibilitetskompleks (MHC), udvidelse af B- og T-celler, der er reaktive for myelin i MS-læsioner og det faktum, at immunisering med myelinproteiner inducerer en MS-lignende sygdom hos dyr, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE).

Autoreaktiviteten for forskellige myelinproteiner, herunder myelinbasisprotein, proteolipidprotein og myelinassocieret glycoprotein i myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG), er blevet observeret hos patienter med MS.

Det bemærkes dog, at T-celler fra patienter med MS viser en overvejende aktivitet mod MOG i forhold til andre myelinproteiner, og anti-MOG-antistoffer blev identificeret forbundet med myelinens opløsning omkring axoner i akutte læsioner af MS. Derudover reproducerer sensibilisering med MOG den kliniske og demyeliniserende degenerative patologi af MS i gnavermodeller og primater.

En infektiøs ætiologi af MS er også blevet postuleret, og over flere år er en række forskellige vira blevet foreslået at udløse immunopatologi. Forøgede antistoftitler blev påvist for EBV, varicella zoster-virus og rubellavirus, mens specifikke proteiner humane endogene retrovira (HERV), især fra HERV-W-familien, blev påvist i blod- og hjernelæsioner hos patienter med MS.

HERV opstod fra ældgamle infektioner af værtsceller i kimlinien af ​​eksogene retrovira og udgør i dag omkring 8% af det menneskelige genom.

Retrovirus multipel sklerose-associeret (MRSV) er en kappeformet virus med revers transkriptaseaktivitet, som repræsenterer prototypen af ​​HERV-W-familiens humane genom.

MRSV blev isoleret i leptomeninges, i choroid plexus og i kulturer af monocytter/makrofager fra MS-patienter, og deres oprindelse er stadig under undersøgelse. Er blevet foreslået, at partikler stammer fra MSRV provirus HERV-W modificeret eller transmitteret fra et medlem af den samme eksogene familie. MSRV-virioner har egenskaber såsom superantigener, de inducerer produktionen af ​​cytokiner af mononukleære celler i perifert humant blod.

HERV-partikler forbundet med revers transkriptaseaktivitet (RT) blev bekræftet at være et kendetegn for ekspression fra MSRV. En protokol til påvisning af MSRV virion ved RT PCR blev designet til at påvise deres tilstedeværelse i serum og cerebrospinalvæske (CSF) hos patienten.

Uafhængige undersøgelser af patienter med MS og kontrolpopulationer viste korrelationer mellem MS og MSRV og dens prognose, herunder omdannelsen af ​​recidiverende-remitterende MS i sin sekundære progressive form (SP-MS).

Parallelle undersøgelser viste immunopatogenesen af ​​MSRV-virioner og identificerede kappeproteinet (Env) af MSRV som værende ansvarligt for det pro-inflammatoriske og superantigenicitetsimmun. Env-antigenet blev påvist på MS-patienter i undersøgelser af hjernens postmortem.

Transaktivering af HERV-W-promotorerne med miljøvirus forbundet med MS har også vist sig at inducere en epigenetisk dysregulering i HERV-W, når den er til stede i værtsgenomet.

Den vigtigste herpesvirus forbundet med MS er bestemt EBV, forholdet mellem EBV-serologi og udviklingen af ​​MS er blevet grundigt undersøgt. Ydermere er interaktionen mellem EBV og immunsystemet ubestridelig, hvilket fører til et vedvarende immunrespons og immortalisering af lymfocytter. Der er også undersøgelser, der korrelerer ekspressionen af ​​EBV med større aktivitet af MS. Endelig er interaktionen mellem EBV og endogene retrovira et nyligt og fascinerende studieområde.

EBV var det første medlem af Herpesviridae-familien, der blev impliceret som en potentiel årsag til MS i 1971. EBV er en mulig kandidat på grund af flere faktorer: det er udbredt i naturen, kræver en lang hvilende viral infektion, der har kontinuerlig produktion på grund af perioder med reaktivering og modulerer det menneskelige immunsystem.

Vanskeligheden ved at forbinde MS for at bevise, at EBV er virusinfektionen, opstod før starten af ​​autoimmun sygdom. Pohl et al. viste, at EBV-seropositiviteten hos patienter med MS i Europa (børn) - var 99 % højere sammenlignet med kontrolgruppen, hvilke virusantistoffer blev fundet hos 72 %.

Levin et al. estimeret tidspunktet for virusinfektion ved serumantistoftitre før MS og sammenlignet med en kontrolgruppe. Denne undersøgelse havde adgang til lægejournalerne for cirka 8 millioner ansatte i den amerikanske hær, som havde opbevaret blodprøver. Af denne gruppe blev case-kontrolstudiet, hvor 305 personer kom til senere at udvikle MS og 610 udvalgte kontrolpersoner, parret; 10 tilfælde, der udviklede MS og 32 kontroller, var oprindeligt EBV-seronegative. Alle tilfælde var blevet positive EBV før MS, sammenlignet med kun 35,7 % af kontrollerne, der serokonverterede.

Andre undersøgelser har også forsøgt at vurdere forholdet mellem antistoftitre mod EBV og indtræden af ​​MS. Ifølge De Lorenze et al.s arbejde havde patienter med MS en signifikant stigning i antistoffer 20 år før de første symptomer på MS. Dette faktum kan forklares på to måder: eksistensen af ​​en tidligere infektion, der ændrer balancen i EBV-receptorcellerne (hukommelses-T-celler) eller geninfektion med en anden EBV-stamme.

EBV inficerer B-lymfocytter og er vedvarende stærkt immunogene. De antigenspecifikke cytotoksiske T-lymfocytter produceres kontinuerligt og øges i antal som reaktion på primær infektion og høj viræmi. Denne immunkontrol er afgørende for at forhindre EBV-relaterede maligniteter. I sin modulerende virkning formår den at redde inficerede B-lymfocytter via ekspression af latente antigener og hjælper dem med at differentiere sig til hukommelses-B-celler, hvor virussen fortsætter. Det er imidlertid ikke fastslået, om de øgede T-celler, der er specifikke for EBV, er en reaktion på øget stimulering ved specifik genkendelse af myelinantigener. EBV viral load er ikke særlig høj i MS, desuden synes T-celler, der er specifikke for denne virus, ikke at kunne skelnes fra de samme celler i værter uden MS.

En anden efterforsker anfører, at der i perioder med MS-reaktivering er en øget aktivitet af virusreplikation i forhold til perioder med remission. Patienter med antistofrespons på tidligt antigen af ​​EBV er mere tilbøjelige til at vise sygdomsaktivitet målt ved MRI med gadolinium sammenlignet med patienter uden humoral respons. Disse data fik os til at tro, at sygdommens aktivitet kan være relateret til latent EBV-infektion såvel som sygdomsprogression.

Undersøgelser, der korrelerer niveauer af antistoffer mod cytomegalovirus (CMV) og MS er kontroversielle. Selvom de fleste af resultaterne viser høje forekomster af CMV-infektion hos patienter med MS, observeres der på den anden side en mildere præsentation af sygdommen.

Nogle efterforskere ledte efter tilstedeværelsen af ​​anti-CMV-antistoffer hos MS og raske individer. De fandt positive hos 98 % af MS-patienterne sammenlignet med 52 % i kontrolgruppen.

En anden efterforskere viste, at patienter, der havde antistof mod CMV, var: senere alder for sygdomsdebut, lavere frekvens af reaktivering af sygdommen og færre tegn på cerebral atrofi på MR. De, der havde højere titere af disse antistoffer, havde mindre hjerneatrofi og færre læsioner på billeddiagnostiske test sammenlignet med patienter, der havde lavere titre. En dyremodel med efterligning af mønstrene for MS viste, at dyr med CMV-infektioner demyeliniserende ramme før kliniske præsentationer var svagere end dem, der ikke var inficerede. Disse undersøgelser tyder på en gavnlig modulerende effekt af CMV-infektion på immunresponset i MS.

Herpesvirus (HHV-6 og HHV-7) er nært beslægtede og har et lignende biologisk mønster. Disse vira er i stand til at inficere celler i immunsystemet og modulere deres funktioner. Arbejdet beskrevet af Krukle-Nora et al. forsøgte at undersøge sammenhænge mellem HHV-6 og HHV-7 i MS ved at analysere patienters perifere blod. Patienterne blev tilfældigt udvalgt og inddelt i 02 grupper: 14 patienter med recidiverende remitterende MS (RR-MS) og 14 med sekundær progressiv MS (SP-MS). Alle undersøgelsespatienter var i mindst 3 måneder uden brug af immunsuppressive lægemidler. Af de 28 patienter havde 25 latent HHV-6-infektion og/eller HHV-7. HHV-6 er fundet hos 9 patienter med RR-MS og 9 med SP-MS. HHV-7 blev fundet hos 10 patienter med RR-MS og 14 med SP-MS.

To efterforskere, der anvender teknikken til fluorescerende in situ hybridisering, undersøgte humane kadaveriske væv for at evaluere ekspressionen af ​​tidlige og sene virale gener ved hvidt stof i det berørte væv hos patienter med MS og i hjerneprøver uden sygdom. Genet af HHV-6 blev fundet i alle prøver og var begrænset til oligodendrocytter. Kvantitativ analyse af ekspressionen af ​​viralt RNA viste, at i begge grupper af MS-patienter (hjernevæv med og uden ændring af hvidt stof) havde prøver signifikant højere niveauer af ekspression af denne virus. Desuden viste de, at det skadede væv var korreleret med højere viral ekspression, et faktum, der bidrager til teorien om HHV-6, er impliceret i patogenesen af ​​MS.

Brug af alle disse metoder til virus blev observeret modstridende resultater. Faktisk når de anvendte teknologier ikke var i stand til at skelne aktiv fra latent infektion med HHV-6 (ved analyse af leukocytter fra blodet, af cerebrospinalvæske indeholdende celler og væv i CNS), er der ikke fundet nogen forskel blandt prøvepatienterne og kontrolgruppen. Men når diagnostiske teknologier anvendes specifikt til påvisning af aktiviteten af ​​HHV-6, observeres en stærk korrelation mellem HHV-6 og patogenesen af ​​MS. Vores gruppe har for nylig undersøgt niveauet af lighed mellem kappeproteinet i HERV-W og MOG. En sammenligning af kappen MOG identificerede fem IgG-lignende domæne af MOG-lignende, der udvider ideen om HERV-W, kan være involveret i immunopatogenesen af ​​MS, måske for at lette genkendelse af immunsystemets MOG retrovirale regioner. Vi har også vist, at de fleste patienter viste udtryk for HERV-W-kappen på et eller andet niveau. Ni af de ti testede prøver havde medium til høje niveauer af HERV-W-kappeekspression mod meget lave ekspressionsniveauer eller ingen aktivitet i raske kontroller, hvilket bekræfter sammenhængen mellem MS-aktivitet og HERV-W i vores population.

En nylig undersøgelse i Italien viste, at EBV stimulerer ekspressionen af ​​HERV-W i celler fra blod og hjerne in vitro. De foreslår, at patogenesen af ​​MS, en mulig model kunne inkludere EBV som den første udløser af MS, år senere, og viser HERV-W som reel for patogenicitet af MS, i slående parallel med sygdommens adfærd i deres remitterende form bidragyder appellanten.

Mål:

Primært mål: korrelere klinisk og billeddannelse af MS-aktivitet med kvantitativ vurdering af HERV-W og vira fra Herpesviridae-familien i blodet hos patienter med MS.

Sekundært mål:

Vurder ekspression af HERV-W og Herpesvirus og sammenlign virusekspression blandt patienter med MS og raske kontroller med og uden andre neurologiske sygdomme.

Betydning:

MS er en multifaktoriel sygdom med genetisk og miljømæssig ætiologi. Det er stor interesse for forskerne i tilknyttede faktorer at etablere en årsagssammenhæng. Adskillige vira er blevet forbundet med patogenesen og sygdomsaktiviteten. Selvom herpesvirus og HERV-W vira er de vigtigste i forsøget på at etablere en årsagssammenhæng og med aktiviteten af ​​MS, er der indtil nu mange spørgsmål, der forbliver åbne om disse virussers rolle i ætiologien og udviklingen af ​​sygdommen.

Hypotese:

Med dette arbejde forventes det at finde flere mulige svar på etiopatogenesen og den inflammatoriske aktivitet relateret til MS og dermed give mere konsistente data, der vil hjælpe med formuleringen af ​​stadig mere specifikke og effektive terapier rettet mod denne patologi.

Metoder:

Indledningsvis vil alle prøver blive analyseret ved ELISA immunoassay til påvisning af IgG og immunglobulin M (IgM) anti-EBV og CMV antistoffer i deltagernes serum ved hjælp af kommercielle kits.

Nukleinsyreekstraktionen vil blive udført (DNA og RNA) i henhold til producentens instruktioner. Alle protokoller for at sikre renheden af ​​RNA'et og fraværet af DNA i prøverne vil blive vedtaget i analysen af ​​ekspression (og dermed påvisning af transkripter). Nukleinsyrerne udsættes således for behandling med DNAse og verifikation med RT-PCR HERV-W. Kun prøver, der indeholder RNA, vil blive transskriberet og underkastet yderligere analyse. RNA-kvantificering af HERV-W vil blive foretaget på mononukleære celler (PBMC) ved en kvantitativ polymerasekædereaktion (qRT-PCR) specifik for undertypen MSRV af HERV-W-familien.

Påvisningen af ​​herpesvirus-DNA vil indledningsvis blive foretaget ved en PCR ved hjælp af to sæt primere (HSVPAN og VZVPAN). Efter amplifikation udføres en enzymatisk fordøjelse med BamHI og BstUI til typebestemmelse af herpesvirus otte typer, herunder human herpesvirus 6 (6A og 6B). For prøver, der viser sig positive, vil der blive afholdt en qRT-PCR for specifikke vira.

Design:

En prospektiv, longitudinel undersøgelse, der indsamlede biologisk materiale og tilstedeværelsen af ​​en kontrolgruppe, vil blive afholdt. Dette projekt vil blive analyseret af individerne gennem vilkåret for frit og informeret samtykke. Kun ved at underskrive samtykkeerklæringen vil patienten kunne deltage i denne undersøgelse.

Blodprøver af patienter fra det neurologiske ambulatorium (CATEM og andre specialer) vil blive taget under rutinebesøg af en kvalificeret professionel. Patienternes blod fra Blodbanken vil blive opsamlet i forbindelse med den rutinemæssigt udførte undersøgelse. Alt indsamlet materiale vil blive sendt til virologilaboratoriet på Institut for Tropisk Medicin, University of São Paulo, hvor laboratorietest udføres.

Patienter vil blive vurderet for graden af ​​klinisk og billeddannende sygdomsaktivitet ved at analysere den årlige rate af tilbagefald, EDSS-skalastigninger og øgede kranielæsioner på MR og sygdomsaktivitet klassificeret som MILDE, MODERAT og SVÆR i henhold til de foreslåede kriterier af Freedman et al. Kraniel MR vil kun blive udført for grupper med MS og med andre neurologiske sygdomme.

Statistiske metoder:

Efter laboratorietestresultater vil data blive analyseret og modtage nødvendig behandling for deres statistiske fortolkning og sammenligning med sygdomsaktivitet ved hjælp af parametriske og ikke-parametriske værktøjer. Student-t og Mann-Whitney testene vil blive brugt til at evaluere sammenhænge mellem kliniske, demografiske og laboratorieparametre. Signifikansniveauet for alfa = 0,05 eller 5 % for at forkaste nulhypotesen vil blive fastsat.

Beregning af prøvestørrelse:

Prøvestørrelsen blev bestemt baseret på procentdelen af ​​populationen med og uden MS, der viste påviselig ekspression af HERV-W i PBMC. Selvom antallet af patienter med MS, der udviser aktivitet retrovirus-kappe, er tæt på 95%, antager vi mere konservative værdier for prøveberegningen. Hvis man derfor antager ekspression med 50 % og 10 % for henholdsvis tilfælde og kontroller, er en stikprøvestørrelse på 28 tilfælde og 28 kontroller nødvendig, baseret på et konfidensniveau = 95 % effekt til at detektere 80 %, ifølge Kelsey-metoden. Da efterforskerne vil analysere tre grupper (med MS, uden MS og andre neurologiske sygdomme), er det samlede N 84 forsøgspersoner, 28 pr. gruppe.