Confronto tra l'attività della sclerosi multipla clinica e RM e l'espressione del retrovirus endogeno umano di tipo W e dell'herpesvirus

Contesto/motivazione:

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria demielinizzante che colpisce il midollo spinale (soprattutto nelle corde posteriori). L'eterogeneità clinica della SM è ben descritta, ma attualmente è noto che anche le lesioni della SM ei meccanismi alla base coinvolti nella distruzione patologica del sistema nervoso centrale (SNC) sono eterogenei. È una malattia multifattoriale in cui un meccanismo immunopatogeno è suggerito come responsabile della distruzione della guaina mielinica.

Tuttavia, la patologia delle lesioni articolari infiammatorie della SM suggerisce che specifiche risposte autoimmuni contro componenti della mielina del SNC possono avere un ruolo cruciale nella distruzione della mielina. Questo concetto è supportato dall'elevato livello di immunoglobulina G oligoclonale (IgG) nel liquido cerebrospinale mediante il legame con il locus del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), l'espansione delle cellule B e T reattive alla mielina nelle lesioni della SM e il fatto che l'immunizzazione con proteine ​​della mielina induce una malattia simile alla SM negli animali, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE).

L'autoreattività per varie proteine ​​della mielina, tra cui la proteina basica della mielina, la proteina proteolipidica e la glicoproteina associata alla mielina nella glicoproteina degli oligodendrociti mielinici (MOG), è stata osservata in pazienti con SM.

Si noti tuttavia che le cellule T di pazienti con SM mostrano un'attività predominante contro MOG in relazione ad altre proteine ​​della mielina e sono stati identificati anticorpi anti-MOG collegati alla disintegrazione della mielina attorno agli assoni nelle lesioni acute della SM. Inoltre, la sensibilizzazione con MOG riproduce la patologia degenerativa clinica e demielinizzante della SM in modelli di roditori e primati.

È stata anche postulata un'eziologia infettiva della SM e, nel corso di diversi anni, è stato suggerito che diversi virus possano scatenare l'immunopatologia. Sono stati rilevati titoli anticorpali aumentati, per EBV, virus varicella zoster e virus della rosolia, mentre specifiche proteine ​​dei retrovirus endogeni umani (HERV), in particolare della famiglia HERV-W, sono state rilevate nel sangue e nelle lesioni cerebrali in pazienti con SM.

L'HERV è nato da antiche infezioni delle cellule ospiti della linea germinale da parte di retrovirus esogeni e oggi costituisce circa l'8% del genoma umano.

Il retrovirus associato alla sclerosi multipla (MRSV), è un virus con involucro con attività di trascrittasi inversa, che rappresenta il prototipo del genoma umano della famiglia HERV-W.

Il MRSV è stato isolato nelle leptomeningi, nel plesso coroideo e in colture di monociti/macrofagi di pazienti affetti da SM e la loro origine è ancora oggetto di indagine. È stato ipotizzato che le particelle siano originate da MSRV provirus HERV-W modificato, o trasmesse da un membro della stessa famiglia esogena. I virioni MSRV hanno proprietà come superantigeni, inducono la produzione di citochine da parte delle cellule mononucleate nel sangue umano periferico.

È stato confermato che le particelle di HERV associate all'attività della trascrittasi inversa (RT) sono un segno distintivo dell'espressione di MSRV. È stato progettato un protocollo per il rilevamento del virione MSRV mediante RT PCR per rilevare la loro presenza nel siero e nel liquido cerebrospinale (CSF) del paziente.

Studi indipendenti su pazienti con SM e popolazioni di controllo hanno mostrato correlazioni tra SM e MSRV e la sua prognosi, inclusa la conversione della SM recidivante-remittente nella sua forma secondaria progressiva (SP-MS).

Studi paralleli hanno mostrato l'immunopatogenesi dei virioni di MSRV e identificato la proteina dell'involucro (Env) di MSRV come responsabile della pro-infiammatoria e della superantigenicità immunitaria. L'antigene Env è stato rilevato su pazienti affetti da SM in studi post-mortem sul cervello.

È stato anche dimostrato che la transattivazione dei promotori di HERV-W da parte del virus ambientale associato alla SM induce una disregolazione epigenetica in HERV-W, quando presente nel genoma dell'ospite.

Certamente il più importante virus erpetico associato alla SM è l'EBV, il rapporto tra la sierologia dell'EBV e lo sviluppo della SM è stato ampiamente studiato. Inoltre, l'interazione tra EBV e il sistema immunitario è innegabile, portando a una risposta immunitaria persistente e all'immortalizzazione dei linfociti. Esistono anche studi che correlano l'espressione di EBV con una maggiore attività della SM. Infine, l'interazione tra EBV e retrovirus endogeni è un campo di studio recente e affascinante.

EBV è stato il primo membro della famiglia Herpesviridae ad essere implicato come potenziale causa di SM nel 1971. EBV è un possibile candidato a causa di diversi fattori: è diffuso in natura, richiede una lunga infezione virale quiescente che ha una produzione continua dovuta a periodi di riattivazione e modula il sistema immunitario umano.

La difficoltà nell'associare la SM per dimostrare che l'EBV è l'infezione virale avvenuta prima dell'insorgenza della malattia autoimmune. Pohl et al. ha mostrato che la sieropositività EBV nei pazienti con SM in Europa (bambini) era del 99% più alta rispetto al gruppo di controllo, i cui anticorpi contro il virus sono stati trovati nel 72%.

Levi et al. stimato il tempo di infezione virale dai titoli anticorpali sierici prima della SM e confrontato con un gruppo di controllo. Questo studio ha avuto accesso alle cartelle cliniche di circa 8 milioni di dipendenti dell'esercito americano che avevano conservato campioni di sangue. Di questo gruppo, lo studio caso-controllo in cui 305 persone sono arrivate a sviluppare successivamente la SM e 610 soggetti di controllo selezionati sono stati accoppiati; 10 casi che hanno sviluppato SM e 32 controlli erano inizialmente sieronegativi per EBV. Tutti i casi erano diventati EBV positivi prima della SM, rispetto a solo il 35,7% dei controlli che erano sieroconvertiti.

Altri studi hanno anche tentato di valutare la relazione tra i titoli anticorpali contro l'EBV e l'insorgenza della SM. Secondo il lavoro di De Lorenze et al., i pazienti con SM avevano un aumento significativo degli anticorpi 20 anni prima dei primi sintomi della SM. Questo fatto può essere spiegato in due modi: l'esistenza di una precedente infezione che altera l'equilibrio delle cellule recettrici dell'EBV (cellule T memoria) o la reinfezione con un diverso ceppo di EBV.

EBV infetta i linfociti B e persistentemente altamente immunogenico. I linfociti T citotossici specifici per l'antigene vengono prodotti continuamente e aumentano di numero in risposta all'infezione primaria e all'elevata viremia. Questo controllo immunitario è essenziale per prevenire i tumori maligni correlati all'EBV. Nella sua azione modulante, riesce a salvare i linfociti B infetti attraverso l'espressione di antigeni latenti e li aiuta a differenziarsi in cellule B di memoria, dove il virus persiste. Tuttavia, non è stato stabilito se l'aumento delle cellule T specifiche per EBV sia una risposta all'aumento della stimolazione mediante riconoscimento specifico degli antigeni della mielina. La carica virale di EBV non è molto alta nella SM, inoltre, le cellule T specifiche per questo virus non sembrano essere distinte dalle stesse cellule negli ospiti senza SM.

Un altro ricercatore afferma che durante i periodi di riattivazione della SM vi è una maggiore attività di replicazione del virus in relazione ai periodi di remissione. I pazienti con risposta anticorpale all'antigene precoce dell'EBV hanno maggiori probabilità di mostrare l'attività della malattia misurata mediante risonanza magnetica con gadolinio, rispetto ai pazienti senza risposta umorale. Questi dati ci hanno portato a credere che l'attività della malattia possa essere correlata all'infezione da EBV latente e alla progressione della malattia.

Gli studi che correlano i livelli di anticorpi contro il citomegalovirus (CMV) e la SM sono controversi. Sebbene la maggior parte dei risultati mostri alti tassi di infezione da CMV nei pazienti con SM, d'altra parte si osserva una presentazione più lieve della malattia.

Alcuni ricercatori hanno cercato la presenza di anticorpi anti-CMV nella SM e negli individui sani. Hanno trovato positività nel 98% dei pazienti con SM rispetto al 52% nel gruppo di controllo.

Un altro investigatore ha mostrato che i pazienti che avevano anticorpi contro il CMV erano: età avanzata di insorgenza della malattia, tassi più bassi di riattivazione della malattia e meno segni di atrofia cerebrale alla risonanza magnetica. Coloro che avevano titoli più alti di questi anticorpi avevano meno atrofia cerebrale e meno lesioni nei test di imaging, rispetto ai pazienti che avevano titoli più bassi. Un modello animale con modelli mimici della SM ha dimostrato che gli animali con quadro demielinizzante delle infezioni da CMV prima delle presentazioni cliniche erano più deboli di quelli non infetti. Questi studi suggeriscono un benefico effetto modulante dell'infezione da CMV sulla risposta immunitaria nella SM.

Gli herpesvirus (HHV-6 e HHV-7) sono strettamente correlati e hanno un modello biologico simile. Questi virus sono in grado di infettare le cellule del sistema immunitario e di modulare le loro funzioni. Il lavoro descritto da Krukle-Nora et al. ha tentato di indagare le associazioni tra HHV-6 e HHV-7 nella SM analizzando il sangue periferico dei pazienti. I pazienti sono stati selezionati in modo casuale e divisi in 02 gruppi: 14 pazienti con SM recidivante remittente (RR-MS) e 14 con SM secondaria progressiva (SP-MS). Tutti i pazienti dello studio erano almeno 3 mesi senza l'uso di farmaci immunosoppressori. Dei 28 pazienti, 25 presentavano un'infezione latente da HHV-6 e/o HHV-7. HHV-6 è stato trovato in 9 pazienti con RR-MS e 9 con SP-MS. HHV-7 è stato trovato in 10 pazienti con RR-MS e 14 con SP-MS.

Due ricercatori hanno utilizzato la tecnica dell'ibridazione fluorescente in situ, tessuti cadaverici umani esaminati per valutare l'espressione di geni virali precoci e tardivi nella sostanza bianca nel tessuto affetto di pazienti con SM e in campioni di cervello senza malattia. Il gene dell'HHV-6 è stato trovato in tutti i campioni ed era limitato agli oligodendrociti. L'analisi quantitativa dell'espressione dell'RNA virale ha mostrato che in entrambi i gruppi di pazienti affetti da SM (tessuto cerebrale con e senza alterazione della sostanza bianca) i campioni avevano livelli significativamente più alti di espressione di questo virus. Inoltre, hanno dimostrato che i tessuti danneggiati erano correlati a una maggiore espressione virale, un fatto che contribuisce alla teoria dell'HHV-6 implicato nella patogenesi della SM.

Utilizzando tutti questi metodi per virus sono stati osservati risultati contrastanti. Infatti quando le tecnologie utilizzate non erano in grado di distinguere l'infezione attiva da quella latente da HHV-6 (attraverso l'analisi dei leucociti del sangue, delle cellule contenenti liquido cerebrospinale e del tessuto del SNC), non si riscontra alcuna differenza tra i campioni di pazienti e il gruppo di controllo. Tuttavia, quando le tecnologie diagnostiche vengono utilizzate specificamente per il rilevamento dell'attività dell'HHV-6, si osserva una forte correlazione tra l'HHV-6 e la patogenesi della SM. Il nostro gruppo ha recentemente studiato il livello di somiglianza tra la proteina dell'involucro di HERV-W e MOG. Un confronto dell'envelope MOG ha identificato cinque domini IgG-like di MOG-like estendendo l'idea che HERV-W possa essere coinvolto nell'immunopatogenesi della SM, forse per facilitare il riconoscimento da parte del sistema immunitario delle regioni retrovirali MOG. Abbiamo anche dimostrato che la maggior parte dei pazienti ha mostrato l'espressione dell'involucro HERV-W a un certo livello. Nove dei dieci campioni testati presentavano livelli medio-alti di espressione dell'involucro di HERV-W rispetto a livelli di espressione molto bassi o nessuna attività nei controlli sani, confermando l'associazione tra attività MS e HERV-W nella nostra popolazione.

Un recente studio in Italia ha dimostrato che EBV stimola l'espressione di HERV-W nelle cellule del sangue e del cervello in vitro. Suggeriscono che la patogenesi della SM, un possibile modello potrebbe includere l'EBV come innesco iniziale della SM, anni dopo, e mostra l'HERV-W come reale per la patogenicità della SM, in sorprendente parallelo con il comportamento della malattia nella sua forma remittente collaboratore il ricorrente.

Obiettivi:

Obiettivo primario: correlare l'attività clinica e di imaging dell'attività della SM con la valutazione quantitativa di HERV-W e virus della famiglia Herpesviridae nel sangue di pazienti con SM.

Obiettivo secondario:

Valutare l'espressione di HERV-W e Herpesvirus e confrontare l'espressione del virus tra pazienti con SM e controlli sani con e senza altre malattie neurologiche.

Significato:

La SM è una malattia multifattoriale, con eziologia genetica e ambientale. È grande l'interesse dei ricercatori nei confronti dei fattori associati per stabilire una relazione causale. Diversi virus sono stati collegati alla patogenesi e all'attività della malattia. Sebbene i virus herpesvirus e HERV-W siano i più importanti nel tentativo di stabilire una relazione causale e con l'attività della SM, fino ad ora rimangono molte domande aperte sul ruolo di questi virus nell'eziologia e nello sviluppo della malattia.

Ipotesi:

Con questo lavoro ci si aspetta di trovare più risposte possibili sull'eziopatogenesi e sull'attività infiammatoria correlata alla SM, e quindi, fornire dati più coerenti che aiuteranno la formulazione di terapie sempre più specifiche ed efficaci dirette a questa patologia.

Metodi:

Inizialmente, tutti i campioni saranno analizzati mediante test immunologico ELISA per la rilevazione di anticorpi IgG e immunoglobulina M (IgM) anti-EBV e CMV nel siero dei partecipanti, utilizzando kit commerciali.

L'estrazione dell'acido nucleico sarà eseguita (DNA e RNA), secondo le istruzioni del produttore. Tutti i protocolli per garantire la purezza dell'RNA e l'assenza di DNA nei campioni saranno adottati nell'analisi dell'espressione (e quindi del rilevamento dei trascritti). Pertanto, gli acidi nucleici vengono sottoposti a trattamento con DNAsi e verifica mediante RT-PCR HERV-W. Solo i campioni contenenti RNA saranno trascritti e sottoposti ad ulteriori analisi. La quantificazione dell'RNA dell'HERV-W sarà effettuata su cellule mononucleate (PBMC) mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi (qRT-PCR) specifica per il sottotipo MSRV della famiglia HERV-W.

La rilevazione del DNA dell'herpesvirus sarà inizialmente effettuata mediante PCR, utilizzando due set di primers (HSVPAN e VZVPAN). Dopo l'amplificazione viene effettuata una digestione enzimatica con BamHI e BstUI per la tipizzazione degli otto tipi di herpesvirus compreso l'herpesvirus umano 6 (6A e 6B). Per i campioni che risultano positivi, verrà tenuta una qRT-PCR per virus specifici.

Progetto:

Si terrà uno studio prospettico longitudinale che ha raccolto materiale biologico e la presenza di un gruppo di controllo. Questo progetto sarà analizzato dai singoli, attraverso il termine del consenso libero e informato. Solo firmando il modulo di consenso il paziente potrà partecipare a questo sondaggio.

I campioni di sangue dei pazienti della clinica ambulatoriale di neurologia (CATEM e altre specialità) verranno eseguiti durante la visita di routine da un professionista qualificato. Il sangue dei pazienti della Banca del sangue verrà raccolto in concomitanza con l'esame eseguito di routine. Tutti i materiali raccolti saranno inviati al laboratorio di virologia dell'Istituto di medicina tropicale dell'Università di San Paolo, dove vengono eseguiti i test di laboratorio.

I pazienti saranno valutati per il grado di attività della malattia clinica e di imaging analizzando il tasso annualizzato di recidive, gli aumenti della scala EDSS e l'aumento delle lesioni craniche alla risonanza magnetica e l'attività della malattia classificata come LIEVE, MODERATA e GRAVE secondo i criteri proposti da Freedman et al. La risonanza magnetica cranica verrà eseguita solo per i gruppi con SM e con altre malattie neurologiche.

Metodi statistici:

Dopo i risultati dei test di laboratorio, i dati saranno analizzati e riceveranno il trattamento necessario per la loro interpretazione statistica e confronto con l'attività della malattia utilizzando strumenti parametrici e non parametrici. I test Student-t e Mann-Whitney saranno utilizzati per valutare le associazioni tra parametri clinici, demografici e di laboratorio. Verrà fissato il livello di significatività di alfa = 0,05 o 5% per rifiutare l'ipotesi nulla.

Calcolo della dimensione del campione:

La dimensione del campione è stata determinata in base alla percentuale della popolazione con e senza SM che mostrava un'espressione rilevabile di HERV-W in PBMC. Sebbene il numero di pazienti con SM che esibisce l'inviluppo retrovirale di attività sia vicino al 95%, assumiamo valori più conservativi per il calcolo del campione. Pertanto, assumendo un'espressione rispettivamente del 50% e del 10% per casi e controlli, è necessaria una dimensione del campione di 28 casi e 28 controlli, basata su un livello di confidenza = 95% di potenza per rilevare l'80%, secondo il metodo Kelsey. Pertanto, poiché i ricercatori analizzeranno tre gruppi (con SM, senza SM e altre malattie neurologiche) il totale N è di 84 soggetti, 28 per gruppo.